CC BY
19
Литература
1. Сидорцов В.И., Велик Н.И., Сердюков И.Г. Шерстоведение с основами менеджмента качества и маркетинга шерстяного сырья. - М.: Колос ; Ставрополь : АГРУС, 2010. - 288 с.
2. Трухачев В.И., Велик Н.И., Болотов Н.Д., Асеева Н.В. Влияние сочетания пород на формирование кожного покрова ярок // Зоотехния. - 2007. - №1. - С.30.
3. Николаев А.И. Товароведение шерсти; Под ред. Н. М. Овчинникова. - М.: Заготиздат, 1954. -284 с.
4. Велик Н.И., Асеева Н.В., Болотов H.A., Шевченко Н.В. Продуктивность ярок породы советский меринос с разной тониной шерсти // Зоотехния. - 2007. - №6. - С.25-27.
5. Велик H.H. Использование метода OFDA в измерении тонины шерсти // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2010. - № 3. - С. 39-41.
6. Исмаилов И.С., Сидорцов В.И., Велик H.H. Определение, измерение и оценка свойств шерсти: Методические рекомендации. - Ставрополь, 2006. -36 с.
УДК 575.162
Канд. биол. наук В.И. ТБПЦЕНКО (ФГБНУ ВНИИГРЖ, Tinatvi-57@mail.ru) Доктор биол. наук В.П. ТЕРЛЕЦКИЙ (ФГБНУ ВНИИГРЖ, valeriter@mail.ru) Канд биол наук Т.Э. ПОЗДНЯКОВА (СПбГАУ, erastovna@mail.ru)
ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ В ЛИНИЯХ ИНДЕЕК
БЕЛОЙ ШИРОКОГРУДОЙ ПОРОДЫ
Индейки, линии, мультилокусный зонд, гетерозиготность, ДНК, молекулярная гибридизация
Индейководство, являясь отраслью птицеводства, обеспечивает отечественный рынок качественной и диетической мясной продукцией. К числу широко используемых пород индеек относят белую широкогрудую породу, которая создавалась в США путем скрещивания белой голландской с белыми английскими с последующей селекцией на продуктивные признаки. Эта порода часто служит источником создания отечественных промышленных линий, используемых при скрещивании для получения мясной продукции.
Молекулярно-генетические методы анализа геномов широко применяются для исследования популяционной структуры и эволюционных взаимоотношений между породами и популяциями сельскохозяйственной птицы [1, 2, 8]. Интенсивная селекция в породах, приводящая к повышению продуктивных качеств животных, сопровождается, как правило, потерей генетического разнообразия популяций [4]. Современные данные показывают, что генетическое разнообразие в популяциях определяется не столько численностью популяции, сколько стратегией отбора и разведения. Самым надежным методом изучения генетического разнообразия является ДНК-фингерпринтинг с микро- и минисателлитной ДНК кур [3, 6, 7]. Этот метод позволяет выявлять гибридизационные полосы (фрагменты геномной ДНК), анализ частот встречаемости которых дает информацию о межпородном и межлинейном генетическом разнообразии, а также о внутрипопуляционной гетерогенности [8]. Установлено, что уровень инбридинга в популяциях может быть оценен по коэффициенту сходства в распределении фрагментов ДНК на картинах фингерпринтинга [5]. Помимо популяционных вопросов, методы молекулярной генетики успешно используются в изучении полиморфизма отдельных генов (БКР), которые имеют важное значение в формировании продуктивных качеств животных, а также определяют жизнеспособность особей (вредные рецессивные аллели). Своевременная выбраковка животных-носителей этих вредных вариантов генов позволяет осуществлять эффективный контроль над соотношением нормальный/мутантный аллель в популяции.
Широкое распространение при изучении генетического разнообразия получили олигонуклеотидные зонды [3]. Первые работы, в которых доказана возможность применения ДНК-фингерпринтинга для оценки уровня инбридинга, были выполнены в 90-х годах прошлого века на птицах. Прогнозирование эффекта гетерозиса при скрещивании у разных видов животных стало возможным после опубликования ряда работ, в которых четко показана связь между генетическими расстояниями у исходных групп и эффектом гетерозиса. Например, Гавор с соавт. [9] показали, что даже в малых выборках (10-15 особей кур) отмечается высокая корреляция (г = 0,87) между коэффициентом сходства и уровнем гетерозиса в линиях.
В данной работе с помощью метода ДНК-фингерпринтинга определены популяционно-генетические характеристики четырех коммерчески используемых линий (Ка, ВИ, 04 и 02) индеек породы белая широкогрудая. Кровь индеек отбирали в гепаринизированные пробирки (или пробирки, содержащие ЭДТА) в количестве 0,5 мл. Геномную ДНК выделяли стандартным фенольно-детергентным способом. Затем ДНК подвергалась расщеплению с помощью ферментов рестрикции НаеШ или BsuRI. Реакция проводилась в течение 3-х часов при 37°С в термостате. На одну пробу использовали 40 ед. акт. фермента. Электрофорез проводили в трис-боратном буфере и 0,8% агарозном геле при напряжении 60 вольт около двух суток. Такой низкий градиент напряжения необходим для лучшего разделения больших фрагментов ДНК, представляющих наиболее информативную часть фингерпринтов. Использовали специально сконструированные гребенки, позволяющие анализировать одновременно 44 образца. Так как подвижность фрагментов ДНК в агарозном геле зависит от множества факторов (градиент температуры, концентрации агарозы, буфера и т.д.), учесть которые в полном объеме не представляется возможным, необходимо введение маркеров электрофоретической подвижности - набор фрагментов ДНК известной длины.
Гель инкубировали 10 минут в 0,25М HCl, затем 40 минут в щелочном растворе, содержащем 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl , и нейтрализовали в растворе 0,5 М Трис и 1,5 М NaCl. Перенос одноцепочечной ДНК с геля на нейлоновый фильтр осуществляли под вакуумом 50 мбар в течении 1 часа в приборе для вакуумного переноса (GE Healthcare™).
Молекулярная гибридизация ДНК основана на узнавании и взаимодействии комплементарных оснований, что приводит к восстановлению двухцепочечной структуры. Геномная ДНК животных, расщепленная рестриктазами, находится в фиксированном состоянии на нейлоновом фильтре, а ДНК меченого зонда - в растворе, омывающем этот фильтр. Снижение неспецифического связывания зонда с фильтром достигается предварительной инкубацией последнего в прегибридизационном буфере, имеющем такой же состав, что и буфер гибридизации за исключением меченого зонда.
Молекулярная гибридизация с меченым дезоксигенином зондом (rTr5-Dig-dUTP) проходила при температуре 45°С в течение 30 минут. Отмывку от не включившейся метки проводили в буфере 5><SSC при той же температуре 3 раза по 3 минуты. Выявление мест связывания зонда с фрагментами ДНК основывалось на иммунохимической реакции с применением антитела к дезоксигенину, конъюгированного со щелочной фосфатазой. В качестве цветных реагентов выступали соли 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфата (ВОР) и нитроголубой тетразолия хлорида (NBT). ДНК расщепляли ферментом рестрикции BsuRI в соответствующем буфере. После завершения расщепления проводили электрофорез в 0,8% агарозном геле с целью разделения фрагментов ДНК по размеру.
Статистический анализ распределения фрагментов ДНК проводили по общепринятым методикам, с использованием компьютерной программы Gelstats™. Рассчитывали внутри- и межпопуляционные параметры - коэффициенты сходства, генетические расстояния и гетерозиготность. Коэффициент генетического сходства (BS) рассчитывали по формуле:
BS 2 В ху
В +в
х у
где Вху - число общих полос у сравниваемых двух особей, Вх и Ву - число всех полос у особи х и у соответственно.
На основе коэффициента генетического сходства можно рассчитать генетическое расстояние (О) между популяциями:
В=В8\+В82_в812 ^
где В§1 и В§2 - средние значения коэффициентов сходства особей внутри популяций 1 и 2 соответственно, 551,2 - среднее значение коэффициентов сходства между популяциями.
Анализ внутрипопуляционного генетического разнообразия проводили на основании расчетов средней гетерозиготности (Н) по формуле Штефенса [7]:
I Я*
Н 2п
2n- 1
к= 1__ ^
A-Y4-sk . ^
где Sk - частота встречаемости к-ой полосы у исследованных животных, А - наблюдаемое число различных полос на фильтре, п - число исследованных животных.
В популяционных исследованиях методом ДНК-фингерпринтинга необходимо использование, по крайней мере, 10-15 животных из популяции. Следует иметь в виду, что частоты аллелей, рассчитываемые по Штефенсу, являются смещёнными оценками и при использовании компьютерной программы Gelstats™ имеется возможность получить также скорректированные данные по частотам аллелей (модифицированная версия программы находится по адресу: GELSTATS.ZIP на ftp.uc.edu4). В этом случае частота рассчитывается по формуле:
Р= 1- —1= 8n М - .у '
= к_
где 5 п , к - количество дорожек с данной полосой, п - число образцов (дорожек на фильтре).
Второй оценкой средней гетерозиготности является скорректированное значение гетерозиготности, полученное по методу Штефенса [7]:
У Ы
Н=~ 1+-%—
wz_ Р1
Программа помимо обычной оценки средней гетерозиготности по Штефенсу, вычисляет также скорректированные значения этого параметра по Jin & Chakraborty [10]:
Т
н=-т~1
nL
где Т - общее количество полос на фильтре, п - число образцов, L - количество генетических локусов.
На первом этапе нами были определены популяционно-генетические параметры 4-х линий индеек. Результаты анализа попарного сравнения линий представлены в табл.1. Данные указывают на относительную удаленность друг от друга линии ВИ от линий 02 и 04 (генетические расстояния равны 0,105 и 0, 100 соответственно). Сравнительно близкими оказались линии 02 и 04 (D = 0,055). Эти результаты соответствуют ожиданиям, исходя из истории создания этих линий индеек.
Таблица1. Популяционно-генетические параметры 4-х линий индеек белой широкогрудой породы Северо-Кавказской зональной опытной станции по птицеводству
(ФГУП ППЗ «СКЗОСП»)
Линии индеек п Полос на дорожку Х±т Р BS1 BS2 D
КА 11 45,18±1,84 3,37 х 10"17 0,43 0,34 0,095
ВИ 11 38,82±1,46 1,12 х 1014 0,44
КА 11 45,18±1,84 3,37х 10 " 0,43 0,33 0,065
04 11 38,64±1,54 5,36 х 10"18 0,36
КА 11 45,18±1,84 3,37 х 10"1У 0,43 0,31 0.080
02 11 37,64±2,00 7,17 х 10"18 0,35
ВИ 11 38,82±1,46 1,12 х 1014 0,44 0,30 0,100
04 11 38,64±1,54 5,36 х 10"1х 0,36
ВИ 11 38,82±1,46 1,12 х 1014 0,44 0,29 0,105
02 11 37,64±2,00 7,17 х 10~18 0,35
04 11 38,64±1,54 5,36 х 10"18 0,36 0,30 0,055
02 11 37,64±2,00 7,17 х 10"18 0,35
п - количество образцов
Р - вероятность встречаемости двух особей с идентичным набором фрагментов ДНК ВБ1 - коэффициент сходства внутри групп ВБ2 - коэффициент сходства между группами Б - генетическое расстояние
Анализ картин фингериринтинга позволил выявить специфические (маркерные) фрагменты ДНК в отдельных промышленных линиях (табл. 2). Так, фрагмент №70 является характерным для линии ВИ (частота встречаемости 1,00), редким для линии 02 (частота 0,09) и линии 04 (частота 0,18). Фрагмент в позиции на фильтре №52 отсутствовал в линии К А и присутствовал в других линиях с разной частотой, доходящей до 0,82 в линии 02. Крайним случаем маркерных фрагментов является ситуация, когда один фрагмент встречается у всех представителей одной группы (частота 1,0) и вовсе отсутствует у представителей другой (частота 0,0). Маркерные фрагменты ДНК являются ценным генетическим инструментом, позволяющим контролировать селекционный процесс.
Таблица 2. Специфические фрагменты ДНК и аллели, имеющие разную частоту встречаемости в 4-х линиях индеек, определенные методом ДНК-фингерпринтинга
с зондом (ГТГ)5
Номер фрагмента ДНК Частота фрагментов ДНК в линиях Частота встречаемости аллелей в линиях q=lWl-p
КА ВИ 04 02 КА ВИ 04 02
11 0,82 0,45 0,45 0,18 0,58 0,26 0,26 0,09
52 0,00 0,09 0,64 0,82 0,00 0,05 0,40 0,58
70 0,09 1,00 0,18 0,09 0,05 1,00 0,09 0,05
99 0,18 1,00 0,27 0,36 0,09 1,00 0,15 0,20
110 0,82 0,09 1,00 0,27 0,58 0,05 1,00 0,15
Внутрипопуляционное разнообразие в линиях индеек определяли с расчетом значений средней гетерозиготности по трем критериям (программа Gel stats™). Максимальное разнообразие отмечается в линиях 04 (Н1 = 0,72) и 02 (HI = 0,74), в то же время линия ВИ имела наименьшее разнообразие (Н1 = 0,63). В связи с этим можно предположить, что селекция в линии ВИ была более жесткой, либо было отобрано меньшее число животных при выведении этой линии.
ТаблицаЗ. Гетерозиготность 4-х линий индеек белой широкогрудой породы, определенная
методом ДНК-фингерпринтинга с зондом (ГТГ)5
Линии n Число локусов Число аллелей Число полиморф. Н1
индеек локусов
KA 11 26,89 4,76 1,00 0,68 0,78 0,73
ВИ 11 23,79 4,84 0,92 0,63 0,72 0,68
04 11 22,41 5,53 0,96 0,72 0,81 0,77
02 11 21,60 5,65 1,00 0,74 0,84 0,79
п - количество образцов
Н1 - средняя гетерозиготность по Stephens
H2 - скорректированная средняя гетерозиготность по Stephens
H3 - средняя гетерозиготность по Jin & Chakraborty
Таким образом, полученные данные указывают на генетическую удаленность линии ВИ от линий 02 и 04 (генетические расстояния равны 0,105 и 0,100 соответственно). Сравнительно близкими оказались линии 02 и 04 (D = 0,055). Максимальное генетическое разнообразие по критерию гетерозиготности отмечается в линии 04 (Н1 = 0,72) и 02 (Н1 = 0,74), в то же время линия ВИ имела наименьшее разнообразие (Н1 = 0,63). Выявлен ряд специфических фрагментов ДНК, характерных для линий индеек. Эти фрагменты ДНК позволяют идентифицировать данную породу или линию.
Литература
1. Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Яковлев А.Ф. Использование метода фингерпринтинга ДНК для изучения генетической дивергенции в популяциях сельскохозяйственных животных // Вестник РАСХН. - 2003. - №1. - С.79-80.
2. Митрофанова О.В., Тыщенко В.И., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф.
Исследование особенностей генетической гетерогенности пород и экспериментальных популяций кур на основе анализа полиморфизма ДНК // Доклады РАСХН. - 2007. - №6. -С.36-38.
3. Тыщенко В.И., Митрофанова О.В., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф.
Оценка генетического разнообразия в породах и экспериментальных популяциях кур с помощью ДНК-фингерпринтинга // Сельскохозяйственная биология. - 2007. - №4. - С.29-33.
4. Grander A., Sabour M., Gavora J. Estimates of relatedness and inbreeding in goose strains from DNA fingerprints // Anim. Genet. - 1994. - V.25. - P.81-88.
5. Haberfeld A., Dunnington E.A., Siegel P.B., Hillel J. Heterosis and DNA fingerprinting in chickens // Poultry Science. - 1996. - V.75. - P.951-953.
6. Meng A., Gong G., Chen D., Zhang H., Qi S., Tang H., Gao Z. DNA fingerprint variability within and among parental lines and its correlation with performance of F-l laying hens // Theor. Appl. Genetics. - 1996. - V.92. - P.769-776.
7. Stephens J.C., Gilbert D.A., Yuhki N., O'Brien S.J. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. - 1992. - V.9. - P.729-743.
8. Weigend S., Romanov M.N. Current strategies for the assessment and evaluation of genetic diversity in chicken resources // World's Poultry Science - 2001. - V.3. - P.2752-2788.
9. Gavora J.S., Fairfull R.W., Benkel B.F., Cantwell W.J., Chambers J.R. Prediction of heterosis from DNA fingerprints in chickens // Genetics. -1996. - V.144. - P.777-784.
10. Jin L., Chakraborty R. Estimation of genetic distance and coefficient of gene diversity from single-probe multilocus DNA fingerprinting data // Mol. Biol. Evol. - 1994. - V.l 1. - P. 120-127.
