CC BY
40DOI: 10.24411/9999-007A-2019-10015
УДК 636.082.12
Терлецкий Валерий Павлович, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста», Россия, Санкт-Петербург, п. Тярлево, 196601, Московское ш.55а, Государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Ленинградской области «Ленинградский государственный университет им.
А.С. Пушкина», Россия, Санкт-Петербург, Петербургское ш. д.10 (ГАОУ ВО ЛО ЛГУ им. А.С. Пушкина), профессор, доктор биологических наук, e-mail:
valeriter@mail. ru;
Тыщенко Валентина Ивановна, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста», (ВНИИГРЖ), Россия, Санкт-Петербург, п. Тярлево, 196601, Московское ш.55а, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, e-mail: tinatvi@mail.ru
Усенбеков Есенгали Серикович, Казахский национальный аграрный университет, Республика Казахстан 050013, Алматы, ул. Абая 8, зав. кафедрой, кандидат биологических наук,
email: usen03@mail.ru
Генетические особенности казахских пород скота
Genetic features of Kazakh cattle breeds
Аннотация
В статье рассматриваются вопросы популяционно-генетической структуры стад крупного рогатого скота, на примере трех популярных пород разводимых в Республике Казахстан. Анализ проведен методом ДНК-фингерпринтинга с использованием ДНК-зонда для выявления генетического разнообразия.
Resume
The article addresses the questions of population and genetic structure of cattle herds of three breeds which are popular in Republic of Kazakhstan. The analysis has been performed by DNA-fingerprinting using oligonucleotide probe to reveal genetic variability.
Ключевые слова: породы скота, генетическое разнообразие, ДНК-зонд
Keywords: cattle breeds, genetic variability, DNA-probe
ВВЕДЕНИЕ
В мясном скотоводстве внимание уделяется как чистопородному разведению скота, так и скрещиванию с целью получения новых пород и достижения более высоких уровней продуктивности у гибридов (гетерозис). Одной из самых распространенных мясных пород является казахская белоголовая, которая отличается хорошей приспособленностью к условиям содержания в юго-восточных районах России и на территории Республики Казахстан [1]. К числу новых пород можно отнести аулиекольскую, используемую для разведения в чистоте и для скрещивания [2]. Генофондная порода алатауская является носителем ценных признаков, которые можно использовать при скрещивании с другими породами с целью закрепления
этих ценных генотипов. В частности, имеются работы, показывающие перспективность скрещивания алатауских коров с быками абердино-ангусской породы [3]. В связи с получившей распространением практикой скрещивания в скотоводстве возникает необходимость контроля за чистотой используемых пород. Особенно это актуально для сохранения генофондных пород. В настоящее время молекулярно-генетические методы являются стандартом при оценке состояния популяций, выявления их структуры, а также для подтверждения породной принадлежности животных как на индивидуальном уровне, так и на популяционном [4, 5]. Популяционно-генетические особенности КРС изучались на уровне изменений в геномах (молекулярно-генетический метод - ДНК-фингерпринтинг). Данный подход был использован нами ранее при изучении генетического разнообразия популяций кур [6]. Метод позволяет выявлять гибридизационные фрагменты геномной ДНК, распределение которых различно в каждом образце ДНК. Анализ общих фрагментов ДНК и частот встречаемости дает информацию о межпородном и межлинейном генетическом разнообразии, а также о внутрипопуляционной гетерогенности (гетерозиготности).
Интенсивная селекция в породах, приводящая к повышению продуктивных качеств животных, одновременно сопровождается потерей генетического разнообразия популяций. Современные данные показывают, что генетическое разнообразие в популяциях определяется не столько численностью популяции, сколько стратегией отбора и разведения. Установлено, что уровень инбридинга в популяциях может быть оценен по коэффициенту сходства в распределении фрагментов ДНК на картинах фингерпринтинга. Широкое распространение при изучении генетического разнообразия получили олигонуклеотидные зонды [6]. Именно такой подход и был использован в данной работе.
МЕТОДИКА
Анализ генетической изменчивости методом ДНК-фингерпринтинга проводили следующим образом. Кровь от трех пород КРС в количестве по 15
голов, отбирали в пробирки, содержащие ЭДТА для предотвращения свертывания крови. Геномную ДНК выделяли стандартным фенольно-детергентным способом. В пробирку помещаем 90 мкл раствора ДНК (ДНК 5-10 мкг), затем прибавляем 10 мкл 10Х буфера для эндонуклеазы рестриктции äsmRI (Thermo Fisher Scientific). Смесь тщательно размешиваем и только после этого вносим 4 мкл эндонуклеазы, реакционную смесь ставим на инкубацию при 37°С на 3 часа. После инкубации фрагменты ДНК осаждали этанолом. ДНК разделяли по размеру в 0,8% агарозном геле, затем денатурировали 40 минут в щелочном растворе, содержащем 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCL и нейтрализовали в растворе 0,5 М Трис и 1,5 М NaCL. Перенос одноцепочечной ДНК с геля на нейлоновый фильтр осуществляли под вакуумом 50 мбар в течении 1часа в приборе для вакуумного переноса (GE Healthcare). Время гибридизации с олигонуклеотидом (ГТГ)5, меченым дезоксигенином, составляло 30 минут. Прегибридизацию проводили в течение 1 - 2 часов при 45°С. Буфер для прегибридизации состоит из 5-кратного раствора Денхардта (50 -кратный: 1% бычий сывороточный альбумин - 1% поливинилпирролидон- 1% фиколл 400), 5-кратный раствор SSC (1-кратный SSC: 0,15М NaCL - 0,15М цитрат натрия), 0,1% (SDS) додецилсульфат натрия. После прегибридизации проводили реакцию гибридизации (прегибридизационный буфер, содержащий меченый олигонуклеотид (ГТГ)5 в концентрации 10 рМ/мл). Затем фильтр отмывали 3 раза буфером 5xSSC продолжительностью 1 минута каждая.
Отмытые от не включившейся метки фильтры инкубировали с легким покачиванием на шейкере 1 минуту в буфере следующего состава: 0,1 М малеиновая кислота рН 7,5 -0,15 М NaCL (буфер 1). После этого фильтр обрабатывали блокирующим буфером, аналогичным предыдущему, но с включением в состав 1% блокирующего агента (Blocking Agent, фирма Roche®). Инкубацию на шейкере продолжали в течение 30 минут. Фильтр переносили на чистую ровную поверхность (стекло), наносили 5 мл блокирующего буфера, содержащем конъюгированные антитела к
дезоксигенину/щелочной фосфатазе (1:1000). Взаимодействие с антителами происходило в течение 30 минут. После инкубации с антителами фильтр отмывали в буфере 1 на шейкере 2 раза по 10 минут каждый. При этом удаляются все несвязанные с фильтром антитела. Фермент проявляет активность при наличии в растворе двух субстратов: 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфата (BCIP) и нитро голубой тетразолия хлорида (NBT). Рабочие концентрации субстратов составляют 0,075 мг/мл в щелочном буфере состава: 0,1 М Трис^^ рН 9,5 - 0,1 М Фильтр помещали в ванночку,
туда вносили щелочной буфер с субстратами. Наиболее интенсивные полосы начинали проявляться уже через несколько минут. В целом, проявление заканчивается через 12 часов действия щелочной фосфатазы. При этом формируются полосы картин фингерпринтинга, число и распределение которых характерно для каждой особи. Статистический анализ распределения фрагментов ДНК проводили по общепринятым методикам, которые были в деталях описаны в предыдущих отчетах. Рассчитывались как внутрипопуляционные параметры (например, гетерозиготность), так и межпопуляционные (коэффициенты сходства и генетические расстояния) с помощью программы Gelstats™.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Анализ популяционно-генетических параметров был проведен на трех породах КРС - Алатауская, Казахская белоголовая, Аулиекольская. Были получены картины ДНК-фингепринтинга (Рис. ).
Рисунок. ДНК-фингерпринтинг трех пород КРС, Республики Казахстан. М - маркер, 1-15 - Алатауская, 16-30 - Казахская белоголовая, 31-45 -Аулиекольская.
Наибольший коэффициент сходства внутри группы был обнаружен у Аулиекольской породы КРС BS=0,64, наименьший у Казахской белоголовой BS=0,51. Генетическое расстояние между Казахской белоголовой и Аулиекольской породой составило D=0,025, что свидетельствует о родстве данных пород. Более удаленной оказалась Алатауская порода от Казахской белоголовой и Аулиекольской (0,055 и 0,060, соответственно) (Табл.1).
Таблица 1.
Популяционно-генетические параметры в 3-х породах КРС Алатауская, Казахская белоголовая, Аулиекольская из Казахстана, рассчитанные методом ДНК-фингерпринтинга с зондом (ГТГ)5 и
программой Gelstats™
Породы КРС п Полос на дорожку, X±m ? 1 BS 2 BS Б
Алатауская- 0 Казахская белоголовая 15 15 21,47±0,9 16,40±1,1 1,9x10-6 1,5х10-5 0,54 0,51 0,47 0,055
Алатауская-0 Аулиекольская 15 15 21,47±0,9 17,33±0,5 1,9x10-6 4,7x10-4 0,54 0,64 0,53 0,060
Казахская белоголовая Аулиекольская 15 15 16,40±1,1 17,33±0,5 1,5х10-5 4,7x10-4 0,51 0,64 0,55 0,025
P - вероятность встречаемости двух особей с идентичным набором фрагментов ДНК;
BS1 - коэффициент сходства внутри групп; BS2 - коэффициент сходства между группами; D - генетическое расстояние.
Специфические фрагменты ДНК были обнаружены у Алатауской породы КРС, так, фрагмент №12 встречался с частотой 0,80, но очень редко встречался у Казахской белоголовой и Аулиекольской пород (0,20 и 0,13, соответственно). Фрагмент №63 был мономорфным для всех пород, т.е. встречался с частотой 1,00 (Табл. 2).
Таблица 2.
Специфические фрагменты ДНК и аллели имеющие разную частоту встречаемости в 3 -х породах КРС из Казахстана , рассчитанные методом ДНК-фингерпринтинга с зондом (ГТГ)5 и
программой Gelstats™
Фрагмент ДНК Частота фрагментов ДНК Частота встречаемости аллелей q=1-Vl-p
Алатауская Казах. белоголов. Аулиеко-льская Алатау-ская Казах. белогол. Аулиеко-льская
12 0,80 0,20 0,13 0,55 0,11 0,07
24 1,00 0,93 1,00 1,00 0,16 1,00
58 0,33 1,00 0,93 0,18 1,00 0,16
63 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Внутрипопуляционное генетическое разнообразие пород определяли по критерию средней гетерозиготности. Установлено, что Казахская белоголовая порода КРС имела наибольшую гетерозиготность H=0,54 и в группе была более разнообразная по сравнению с Аулиекольской породой, где H=0,38, и животные были более однородные (Табл.3).
Таблица 3.
Гетерозиготность (Н) в 3-х породах КРС из Казахстана
Породы КРС п Число локусов Число аллелей на локус Число полиморф. локусов И
Алатауская 15 14,24 4,28 0,79 0,51
Казахская белоголовая 15 10,67 4,68 0,81 0,54
Аулиекольская 15 12,59 3,73 0,68 0,38
ВЫВОДЫ
1. Небольшое генетическое расстояние D=0,025 было установлено между Казахской белоголовой и Аулиекольской породой КРС, что
свидетельствует об их родстве. Алатауская порода была более удалена от этих пород (0=0,055 и 0,060, соответственно).
2. Аулиекольская порода КРС внутри группы была более однородная (ВБ1=0,64), по сравнению с Казахской белоголовой (ВБ1=0,051). При этом гетерозиготность у Казахской белоголовой породы была выше И=0,54 , чем у Аулиекольской И= 0,38.
3. Специфический фрагмент ДНК №12 был обнаружен у Алатауской породы с частотой 0,80, а у Казахской белоголовой и Аулиекольской он встречался значительно реже (0,20 и 0,13, соответственно). Этот фрагмент ДНК можно использовать для определения породной принадлежности животных.
4. Фрагмент ДНК №63 был мономорфный у всех пород КРС.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Метод ДНК-фингерпринтинга позволил выявить особенности генетической организации и популяционной структуры в породах крупного рогатого скота. Были обнаружены маркерные фрагменты ДНК. Метод может быть использован для установления породной принадлежности, а также в селекционной работе при создании новых пород и популяций животных.
Литература
1. Герасимов Р.П., Макаев Ш.А. Эффективность разведения казахской белоголовой породы крупного рогатого скота // Вестник мясного скотоводства. - 2011. - Т. 3. - № 64. - С. 29-34.
2. Жанбуршинов З.А., Жузенов Ш.А., Крючков В.Д., Ахметалиева А.Б. Выведение и совершенствование аулиекольской породы мясного скота // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. -2012. - № 4(36). - С. 99-102.
3. Ногоев А.И. Жумаканов К.Т., Абдурасулов А.Х. Биотехнологические факторы повышения мясной продуктивности скота с использованием мирового генофонда // Сборник научных трудов Всероссийского
научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. -2016. - Т. 1. -№ 9. - С. 443-449.
4. Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Бейшова И.С., Белая Е.В., Поддудинская Т.В. Влияние аллелей полиморфных генов bPit-1, bGH, bGHR на показатели роста у крупного рогатого скота аулиекольской породы // Успехи современной науки. - 2017. - Т. 2. - № 4. - С. 142147.
5. Терлецкий В. П.,Тыщенко В. И., Сурундаева Л, Г., Адаев Н, Л., Гайрабеков Р, Х., Усенбеков Е. С. Молекулярно-генетический анализ популяционной структуры генофондных пород крупного рогатого скота // Молочное и мясное скотоводство. - 2014. - № 6. - С. 5-7.
6. Тыщенко В.И., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф. Оценка генетического разнообразия в популяциях кур на основе геномной дактилоскопии // Сельскохозяйственная биология. - 2002. -№ 6. - С. 43-46.
References
1. Gerasimov R.P., Makaev Sh.A. Efficiency of breeding of Kazakh White-Head cattle breed // The Herald of Beef Cattle Breeding. - 2011. - Vol. 3. -No 64. - p. 29- 34.
2. Zhanburshinov Z.A., Zhuzenov Sh.A., Kryuchkov V.D., Akhmetalieva A.B. Breeding and improvement of Auliekolsky cattle // Izvestia of Orenburg State Agrarian University. - 2012. - No 4(36). - p. 99-102.
3. Nogoev A.I., Zhumakanov K.T., Abdurasulov A.H. Biotechnological factors increasing the meat productivity with use of cattle world gene pool // Proceedings of All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding. - 2016. - Vol. 1. - No 9. - p. 443-449.
4. Terletsky V.P., Tyschenko V.I., Beyshova I.S, Belaya E.V., Poddudinskaya T.V. Influence of alleles of polymorphic genes bPit-1, bGH, bGHR on
growth indexes in large cattle of Auliekol breed // Modern Science Success. - 2017. - Vol.2. - No 4. - p. 142-146.
5. Terletskiy V.P, Tyschenko V. I, Surundaeva L. G, Adaev N. L, Gajrabekov R. N, Usenbekov E. S. Molecular genetic analysis of population structure of gene pool cattle breeds // Dairy and Beef Cattle Farming. - 2014. - No 6. -p. 5-7.
6. Tyshchenko V. I, Dementieva N.V., Terletskiy V.P, Yakovlev A.F. Evaluation of genetic variability in chicken populations by genomic fingerprinting // Agricultural Biology. - 2002. - No 6. - p. 43-46.
