CC BY
22
SCIENCE TIME
■
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ ПРОБИОТИКОВ
Полянская Ирина Сергеевна, Шигина Екатерина Сергеевна, Вологодская молочнохозяйственная академия, г. Вологда
E-mail: poljanska69@mail.ru
Аннотация. Данная статья посвящена вопросам селекции новых пробиотических штаммов, предназначенных для животных. Рассмотрены основные методы генетической селекции: трансформация, трансдукция, конъюгация, протопластирование, клонирование с помощью вектора. Более детально методически представлен конъюгативный перенос между молочнокислыми микроорганизмами.
Ключевые слова: селекция, конъюгация, плазмидная ДНК, молочнокислые микроорганизмы.
Пробиотический потенциал штаммов во многом зависит от качественного состава и количественного содержания пробиотических микроорганизмов в кормовых добавках, а также от их удачного симбиотического многокомпонентного сочетания, если в кормовую добавку включено несколько культур (или штаммов) и учёта особенностей ЖКТ конкретных животных для которых добавка предназначена. Проблема приобретает всё большее значение в связи с резким расширением в последние годы ассортимента предлагаемых рынком пробиотических кормовых добавок. Системно-аналитический метод проектирования состава бактериальных препаратов, предложенный сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института маслодельной и сыродельной промышленности и экспериментальной биофабрики, г. Углич (Перфильев Г.Д. с сотр.) [1] регламентирует следующую последовательность получения бактериальных, в том числе пробиотических препаратов: определение назначения пробиотика, микрофлору которого планируется подбирать [2]; выбор критериев оценки культур для определения возможности их использования в проектируемом
| SCIENCE TIME Щ
препарате [3]; получение или отбор (селекция) чистых культур пробиотиков, отвечающих выбранным критериям; подбор культур в комбинации и оценка свойств симбиотически подобранных консорциумов.
Генетические методы селекции новых чистых культур высокоэффективных штаммов пробиотиков, отвечающих выбранным критерием, рассматривается как важнейшая часть системно-аналитического метода проектирования. В ветеринарной практике имеются данные по использованию генетически модифицированных микроорганизмов ГММО, обладающих максимальным спектром заданных полезных свойств. К таким свойствам относится, например, продукция бактериями интерферона человека, гены за отвечающие за репродукцию которого клонированы с помощью вектора в штамм пробиотик [4]. В настоящее время насчитываются десятки рекомбинантных штаммов микроорганизмов, несущих гены, ответственные за синтез а, в и у-интерферонов, различного типа интерлейкинов [5]. В РФ в 1998 г. был принят Закон «О Государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» и создана Межведомственная комиссия по проблемам генно-инженерной деятельности. Пробиотические препараты на основе ГММО, которые были предложены для ветеринарной практики, до настоящего времени в стране официально не зарегистрированы, получено лишь разрешение на их широкое производственное испытание [6].
Среди генетических методов есть, несколько методов, использование которых равносильно происходящим в живой природе самопроизвольным процессам, не относящимся к созданию ГММО: они не требует подбора подходящего вектора для клонирования, получения вшиваемой в него ДНК, содержащей необходимый ген, происходит перенос генов только в близкородственные виды (горизонтальный) т.п.
К таким методам получения генетических рекомбинантов относят, трансдукцию, трансформацию, лизогению (которую иногда рассматривают как случай трансдукции), конъюгативный перенос. При протопластировании, вследствие искусственного разрушения клеточной оболочки бактерий, может происходить перенос генов, который самопроизвольно в природе происходить не может. По всей видимости, изучение и использование в практической селекции горизонтального переноса не только уже сыграло огромную роль, но и, при последующем совершенствовании этих методов, имеет дальнейшее практическое значение. В данной работе мы уделили внимание методикам, использованным нами при получении фагоустойчивых транс-конъюгантов молочнокислых бактерий, с тем, чтобы последующие поколения селекционеров смогли использовать и развивать опыт получения рекомбинантов конъюгативной передачей (экс-конъюгантов) этого сложного, с точки зрения селекции объекта. Работа проводилась во ВНИИ Генетика под
I
SCIENCE TIME
I
руководством В.З. Ахвердян и ВНИИМС под руководством Г. Д. Перфильева
Конъюгативная передача генов между молочнокислыми культурами.
Для получения рекомбинантных культур методом конъюгативной передачи генов используют исходные родительские культуры, имеющие различный маркер (различную антибиотикоустойчивость, фагоспецифичность и т.п.). Конъюгативная передача генов между молочнокислыми культурами осуществлялась в 5 этапов.
1. Подготовка исходных родительских культур. Две родительские культуры с различным маркером рассеивают на рекомендуемую для данного вида плотную питательную среду таким образом, чтобы образовались хорошо выраженные отдельные колонии. Посевы выдерживают при (30+1) 0С в течение 18-24 ч. С помощью бактериологической петли отбирают по одной типичной колонии каждой родительской культуры в отдельные пробирки по (9,5+0,5) мл жидкой питательной среды и выдерживают при (30+1) ос в течение 4-5 ч.
2. Получение спаривающей смеси донор-реципиент. Небольшие равные количества (0,95+0,05) мл 4-5 часовых родительских культур, выращенных по п. 1, смешивают в стерильной пробирке. Далее 100 мкл смеси родительских культур растирают стеклянным шпателем Дригальского по чашке Петри с плотной питательной средой, фосфатным буфером, обогащенным лактозой. Через (24+1) ч посев, выдержанный при (30+1) ос, с чашки Петри смывают (0,95+0,05) см3 физиологического раствора и рассеивают смыв по чашкам с селективной плотной питательной средой, содержащей ингредиенты (антибиотики, бактериофаги), проявляющие маркеры родительских культур. Выдерживали чашки (24+1) ч при (30+1) ос (опытные чашки).
3. Контроль частоты образования мутантов исходных культур. По 100 мкл 4-5 часовых родительских культур родительских культур, выращенных по п. 1 растирают раздельно стеклянным шпателем Дригальского по чашкам Петри с плотной питательной средой, фосфатным буфером, обогащенным лактозой. Через (24+1) ч посев, выдержанный при (30+1) ос, с чашки Петри смывают (0,95+0,05) мл физиологического раствора и рассеивают смыв по чашкам с селективной плотной питательной средой, содержащей ингредиенты (антибиотики, бактериофаги), проявляющие маркеры родительских культур. Выдерживают чашки (24+1) ч при (30+1) ос (контрольные чашки).
4. В случае превышения количества рекомбинантов на опытных чашках по сравнению с мутантами на контрольных чашках, выделяют 10-20 рекомбинантных клонов из отдельных колоний на контрольных чашках и культивируют в (0,95+0,05) см3 10% восстановленного обезжиренного молока,
[7- 11].
| SCIENCE TIME Щ
до свкашивания молока (не более 48 ч) проверяя через 5-10 пассажей сохранение у рекомбининта родительских свойств.
5. Выделение рекомбинантных клонов и сравнение их плазмидных ДНК (плазмидного профиля) с родительскими культурами.
Выделение плазмидной ДНК из молочнокислых бактерий проводится в специально оборудованных помещениях также в 5 этапов, которые могут иметь некоторые особенности в зависимости от скорости роста, оптимальных условий для роста культуры, состава клеточной стенки. Некоторые допустимые пределы подбираются практически путем сравнения результатов качества получения плазмидных профилей. Использованная нами представленная методика модифицирована для лактококков в ВНИИГенетика (Ахвердян В.З., 1994) [12,
13].
1. Подготовка культуры. 7 и 8 разведения в физиологическом растворе, полученные из культуры, выращенной в 10% восстановленном сухом обезжиренном молоке рассевают на соответствующую плотную питательную среду. Посевы выдерживают при (30+1) 0С в течение 18-24 ч до образования хорошо выраженных изолированных колоний. С помощью бактериологической петли отбирают одну типичную колонию, переносят её в пробирку с 5 см3 БГМ и выдерживают культуру при (30+1) ос в течение (18+4) ч. Полученную культуру разводят в 20 раз в БГМ и выдерживают в течение (6+2) ч (в зависимости от скорости роста исследуемой культуры - до начала фазы логарифмического роста).
2. Выделение клеточной биомассы. От 4 до 8 см3 культуры, полученной по п. 1, подвергают центрифугированию при (12500+2500) об/мин в течение 30-40 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресупендируют в (0,4+0,05) см3 0,05М раствора ЭДТА. Полученную суспензию тщательно перемешивают, центрифугируют по режимам, приведенным выше, повторяя ещё 2 раза операцию отмывания биомасы от культуральной среды. После 3-х кратного отмывания, биомассу исследуемой культуры ресуспендируют в 379 мкл буфера, содержащего 6,7 мМ сахарозы, 50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА.
3. Лизис клеточной стенки. К суспензии, полученной по п. 3.5., добавляют 700 мкл фенол-хлороформа, перемашали, выдерживают при комнатной температуре 20 мин, осаждают, надосадочную жидкость осторожно контаминируют в новый центифужный стаканчик. Операцию проводят 2 раза.
4. Выделение плазмидной ДНК. Добавляют равный объем изопропанола, выдерживают при комнатной температуре в течение (10+1) мин, затем подвергают центрифугированию при (5000+1000) об/мин в течение (4+1) мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 500 мкл 96% этанола, перемешивают, выдерживают (10+1) мин при комнатной температуре. Осаждение повторяют.
5. Электрофорез плазмидной ДНК, анализ плазмидного профиля
I SCIENCE TIME Щ
Пробы плазмидной ДНК смешивают с буфером, содержащим 5-10% глицерина, 10 мМ ЭДТА, 0.025% бромфенолового синего и наносят в лунки 15 % агарозного геля, приготовленного в 0.04М трис-ацетате, 20 мМ ЭДТА, с рН равным 8. Объем наносимой на гель пробы составляет 5-10 мкл. Электрофорез проводят при напряжении 15-20 В/см геля в течение 2-3 ч. Затем гель окрашивают в растворе эллюминофора бромистого этидия 5 мкг/мл в течение 15 мин. Фотографируют гель, помещенный на траниллюминатор, с помощью оранжевого фильтра в проходящем УФ-свете на плёкку 300 микрат (Тасма) с выдержкой 5 10, 15 и 20 сек, диафрагмой 2. Пленку проявляют в стандартном проявителе №1 [12].
Полученные транс-конъюганты, не являющиеся ГММО, прошли длительные производственные испытания в составе бактериальных препаратов для сыров [14-16].
Даже в случае, если будет подтверждена абсолютная безопасность созданных селекционерами ГММО, использованный метод, не являющийся генной модификацией, не утратит своего значения. Природа предоставляет генетический материал уникальный по разнообразию, а человек, на его основе, улучшая его отдельные участки, доводит природный объект (в конкретном примере, плазмидный профиль молочнокислого микроорганизма с пробиотическим потенциалом горизонтальным переносом) до лучшего с точки зрения практического использования в рамках природосообразности и безграничных возможностей по совершенствованию методик.
Литература:
1. Перфильев Г.Д. МУ по селекции мезофильных молочнокислых бактерий в состав бактериальных заквасок и препаратов для мелких сычужных сыров. ВНИИМС. 01.86.02.89. - 80 с.
2. Полянская И.С., Тераевич А.С., Макарова В.Н., Корюкина М.В. Определение назначение пробиотика // Сельскохозяйственные науки. - 2016. - №5 (8).
3. Тераевич А.С., Полянская И.С. // Сельскохозяйственные науки. - 2016. - №5 (8)
4. Бондаренко В.М., Белявская В.А. Конструирование генно-инженерных препаратов - пробиотиков и их безопасность. [Электронный ресурс]. — Режим доступа. — URL: http://www.gastroportal.ru/php/content.php?id=1340
5. Старовойтова С. А., Скроцкая О. И. Пробиотики на основе трансгенных микроорганизмов // Biotechnol. acta. 2013. №1. [Электронный ресурс]. — Режим доступа. — URL: //cyberleninka.ru/article/n/probiotiki-na-osnove-transgennyh-mikroorganizmov
6. Данилевская Н.В. Критерии выбора пробиотических препаратов при их использовании мелким домашним животным // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. - 2005. - №3.
«
| SCIENCE TIME |
7. Ахвердян В.З., Лобанов А.О., Протасова И.С., Перфильев Г.Д. Получение рекомбинантных фагорезистентных культур лактококков модифицированным методом конъюгативного переноса и изучение их свойств // Вклад науки в развитие сыроделия и маслоделия. - Углич. - 1994. - С. 213.
8. Akhwerdyan V.Z., Protasova I.S., Freizon E. V., Gudkov A. V. Morhological and classification of phages of lactococci isolated during cheese production // International dairy congress Melbourne, Australia 18 ТН - 22 ND September, 1994.
9. Ожгихина Н.Н., Головков В.П., Перфильев Г.Д., Протасова И.С. Бактериальные концентраты для сыров на основе генетически модифицированных штаммов молочнокислых бактерий // Научные основы прогрессивных технологий хранения и переработки сельхозпродукции для создания продуктов питания человека. - Углич. - 1995. - С. 152.
10. Перфильев Г.Д., Протасова И.С., Ахвердян В.З., Ожгихина Н.Н. Разработка генетических методов получения фагоустойчивых штаммов лактококков // Образование в условиях реформ: опыт, проблемы, научные исследования. -Кемерово, 1997. - С. 75.
11. Протасова И.С., Суслов В.Н., Сорокина Н.П., Медведева З.П. Коллекция молочнокислых бактерий и бактериофагов // Образование в условиях реформ: опыт, проблемы, научные исследования. - Кемерово, 1997. - С. 74.
12. Методические указания. Получение генетически модифицированных молочнокислых бактерий с ценными для сыроделия свойствами (Ю.Я. Свириденко, Г.Г. Перфильев, И.С. Протасова) // ВНИИМС. - Углич. - 1997. - 22 с.
13. . МУ 2.3.2.2789-10. 2.3.2. Продовольственное сырьё и пищевые продукты. Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и фукнционального потенциала пробиотических микроорганизмов, Г.Г. Онищенко. - 2011 г.
14. . Полянская И.С. Нутрициологическая химия s-элементов. - Вологда-Молочное: ИЦ ВГМХА, 2011. - 139 с.
15. Полянская И.С., Топал О.И., Тераевич А.С., Новокшанова А.Л., Забегалова Г.Н. Нутрициологические, микробиологические, генетические и биохимические основы разработки и производства продуктов с пробиотиками. - Вологда-Молочное. - 2013. - 149 с.
16. Полянская И.С. Тераевич А.С. и др. Функциональные продукты питания // По стопам Вернадского, Покровского, Мечникова, Королева, Чижевского. -Germany: LAP LAMBERT Academic Publishing is a trademark of: AV Akademikerverlag GmbH.
