CC BY
31
SCIENCE TIME
■
СЕЛЕКЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ПРОБИОТИКОВ. ЕСТЕСТВЕННЫЙ ОТБОР
Корюкина Марина Вениаминовна, Филиал Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии, г. Вологда
Закрепина Елена Николаевна, Полянская Ирина Сергеевна, Воробьёва Елизавета Алексеевна, Вологодская молочнохозяйственная академия, г. Вологда
E-mail: poljanska69@mail.ru
Аннотация. Данная статья посвящена вопросам селекции чистых культур, обладающих пробиотическими свойствами. Рассмотрены основные алгоритмы естественного отбора практически ценных форм из природных и производственных источников и биотопов животных.
Ключевые слова: селекция, микробиология, пробиотическая культура.
Системно-аналитический метод [1, 2] для получения эффективного бактериального консорциума, предполагает после двух предварительных этапов: определения назначения пробиотика; выбора критериев оценки возможности культур для использования в проектируемом препарате третий этап - селекцию чистых культур, отвечающих выбранным критериям [3].
Поиск или получение новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов включают [4]:
- селекция посредством естественного отбора практически ценных форм. После выделения из природных или производственных источников штаммов микроорганизмов, обладающих полезными для человека свойствами, проводится отбор наиболее продуктивных среди них;
- применение искусственного мутагенеза;
- генетические методы рекомбинации (конъюгация, трансформация, трансдукция, использование протопластов, генная инженерия с помощью вектора-плазмиды или вектора-бактериофага т.д.).
Технология естественного отбора практически ценных форм (рис.1)
| SCIENCE TIME Щ
позволила селекционерам получить штаммы, продуктивность которых в сотни и тысячи раз выше по сравнению с исходными штаммами микроорганизмов, взятыми из природы. Для выделения микроорганизмов выбирают объекты, где обитание той или иного вида микроорганизмов наиболее предпочтительно в связи с выбранными для него критериями оценки (сырое молоко, молочная сыворотка, силос, квашенные продукты, молочные продукты, части растений ягоды, фрукты, овощи, stercus и др.) [4- 6].
Выбор объекта для выделения культуры
4
По лучение накопительной культуры
На жидкой питательной среде
4
Выде ление чистой культуры на плотной
питательной среде
4
Идентификация выделенного микроорганизма
Рис. 1 Основные этапы естественного отбора в селекции
Надземные части растений (стебли, листья, цветы), особенно прикорневая зона, является одним из объектов выделения молочнокислых бактерий, бифидобактерий, В. subtilis, грибов фитопатогенов Trichoderma viride и др. При отборе образцов для выделения, следует исходить из следующих основных положений: эпифитная микрофлора культурных растений, ягод, овощей и фруктов представлена большим разнообразием видов и большей плотностью популяции (до 106 КОЕ/г), чем диких (до 103 КОЕ/г). Наибольшее разнообразие видов характерны для ризосферы таких культурных растений, как кукуруза, люцерна, клевер, виноград.
При силосовании, в зависимости от технологии, смена микроорганизмов, занимающих доминирующее положение может быть различной, но обычно в первые 5-7 суток доминирующее положение занимают лактококки, в период от 8 до 15 суток в силосе обнаруживаются как лактококки, лейконостоки и гомоферментативные молочнокислые палочки (в основном L. р1аПжит), в более поздние сроки микрофлора преимущественно представлена молочнокислыми палочками и В. subtilis.
Выделение молочнокислых бактерий предпочтительно проводить в период бутонизации, цветения растений и начальной фазы созревания. Часть растения массой 1-2 г отрезают стерильными ножницами, помещают в стерильную ступку,
I
SCIENCE TIME
I
добавляют 10 мл физиологического раствора и растирают стерильным пестиком. Ягоды, овощи и фрукты обмывают стерильной водой и 1 мл смыва вносят в 10 мл стерильного обезжиренного молока.
Микробиоценноз самоквасных кисломолочных продуктов хорошего качества отличается от промышленных большим разнообразием. Однако в кисломолочных продуктах промышленного производства под действием конкретных физико-химических условий происходит отбор форм, наиболее приспособленных к этим условиям.
При квашении капусты максимальная плотность популяции молочнокислых микроорганизмов (преимущественно лейконостоков) к концу 2-3 суток, на 6-8 сутки их сменяют молочнокислые палочки. Для выделения кокковых форм бактерий из рассола при посолке огурцов эффективнее использовать период от 3 до 14 суток, а палочковидных форм - через 24-48 суток.
Молочнокислые бактерии играют важную роль в приготовлении теста, они постоянно находятся на наружных и внутренних эпителиальных покровах человека, животных, птиц, рыб, поэтому возможные источники выделения
Необходимо знать, что только молочнокислые микроорганизмы имеют «GRAS» статус (Generally Recognized As Safe), что определяет их как абсолютно безопасные для здоровья человека и животных.
Получение накопительной культуры
При бактериологическом исследовании биологического материала искомый микроорганизм может количественно преобладать в смешанной популяции или сопутствующих микроорганизмов может быть больше искомого. В первом случае выделение чистой культуры бактерий - относительно простая процедура, во втором - требуется предварительно получать накопительные культуры.
В ходе получения накопительных культур создают условия роста для искомого микроорганизма, при которых он начинает количественно преобладать в смешанной популяции, или число его клеток в популяции в процентном отношении увеличивается. С целью получения накопительных культур используют химические, физические и биологические методы. Все эти методические приёмы основаны на тех или иных особенностях искомого микроорганизма.
Для выделения молочнокислых бактерий предпочтительна накопительная среда - стерильное обезжиренное молоко с 0,05-0,07 % этилового спирта с выдержкой при оптимальной для выделения необходимых культур температуре до образования сгустка или контролируя состояние молока микроскопически
новых штаммов мноночисленны.
| SCIENCE TIME |
(если культура не образует сгустка, то накопительные работы проводятся только в лаборатории, имеющей для этого допуск) [7].
Повторное обогащение возможно путем повторных перевивок на соответствующую жидкую питательную среду, затем выделение клонов культур посевом на плотные питательные среды. Молочнокислые культуры выделяют на среде с молочным гидролизатом или MRS, термофильный стрептококк на среде М17. Для выделения дрожжей в качестве накопительной используют среду Сабуро, или аналогичную. Для роста микроаэрофильных бифидобактерий, руминококков и пропионовокислых бактерий используют столбики со специальной полужидкой питательной средой (Блаурокка, Бифидум, ГМК и др.)
Для получения чистых культур пробиотиков дрожжей, палочек Bacillus, Propionibacterium и др. лаборатория, в которой проводятся накопительные работы с выделенными культурами должна иметь допуск работ с микроорганизмами I-, II- групп патогенности [7], т.к. среди них иногда встречаются условно-патогенные культуры.
Выделение чистой культуры на плотной питательной среде происходит нижеследующим образом.
1. Дробный посев на поверхность плотной агаровой среды (метод Дригальского). Подходящую агаровую среду разливают в чашки Петри, подсушивают при комнатной температуре и включенном УФ-облучателе. Дно чашки делят на 3-4 сектора. Петлёй культуру вносят первый сектор и штрихами распределяют по его поверхности. Затем петлю стерилизуют в пламени горелки, остужают. Стерильной петлёй касаются поверхности среды во втором секторе. Петлю вновь прожигают и засевают третий и четвертый секторы. Чашки инкубируют в термостате дном вверх, чтобы не образовывалось конденсата. В результате в последнем секторе видны отдельные колонии, а не сплошной рост.
2. Последовательное (серийное) разведение материала в жидком виде. Метод применяют в том случае, если искомая культура не растет на плотной среде. Необходимым условием является количественное преобладание искомой бактерии в смешанной популяции. В пробирки наливают одинаковые объемы питательной среды. Посев производят из каждого разведения на 2-5 параллельных пробирок с питательной средой. Посевная доза везде одинаковая. Инкубируют и учитывают наличие роста в пробирках. Концентрация клеток определяется методом наиболее вероятных чисел, заключающемся в математической оценке вероятности присутствия жизнеспособных клеток в серийных разведениях, в которых уже не регистрируется рост по формуле Пуассона [12].
3. Глубинный метод посева в плотную питательную среду. Используется для получения изолированных колоний факультативных и облигатных
I SCIENCE TIME Щ
анаэробов. Среда должна быть достаточно прозрачная. В пробирку с 15-20 мл среды с температурой 45-50 оС, вносят материал, перемешивают со средой, выливают в стерильную чашку Петри и после застывания инкубируют. Колонии, выросшие в толще среды, извлекают стерильными пастеровскими пипетками, вырезают шпателем, или микробиологической петлёй.
4. Метод выделения культуры из одной клетки имеет две основные разновидности:
- с помощью микроманипулятора. На предметный столик микроскопа во влажной камере устанавливают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки, которые передвигаются при помощи винтов. Концы микропипеток вводят в «висячую каплю». Глядя в микроскоп, исследователь извлекает при помощи пипеток единичные клетки переносит их в стерильную жидкую питательную среду.
- метод Ледерберга. На нижней поверхности предметного стекла чертят сетку квадратов со стороной 5 мм. Наружную поверхность стекла стерилизуют на пламени, охлаждают и покрывают слоем вазелинового масла толщиной приблизительно 0,5 мм. Нагревают и вытягивают стеклянную трубку до получения капилляра диаметром около 0,1 мм, на противоположном конце надевают кусок резиновой трубки, культуру бактерий набирают концентрацией около 106-107 КОЕ/мл. В каждый квадрат под масло, из капилляра вносят каплю жидкости. Затем в темнопольном или фазовоконтрастном микроскопе просматривают капли на стекле и находят содержащие одну клетку. После этого клетку извлекают, выпуская в каплю из капилляра стерильную питательную среду и набирая её обратно [12].
Первым этапом идентификации выделенного микроорганизма является ориентировочное определение групповой и видовой принадлежности, исходя из набора признаков, определяющими из которых являются микроскопический препарат, оптимальная температура роста, отношение к кислороду, культуральные свойства, окраска по Грамму, способность образовывать ароматические вещества, сбраживать те или иные сахара, признаки ауксотрофности и др. [3, 6]. Важным моментом является способность у культур к сохранению необходимых свойств при длительном хранении [8].
К молочнокислым микроорганизмам относят, в основном, факультативно анаэробных грамположительных микроорганизмов, неспорообразующих кокковидных (Lactococcus, Leuconostoc) или палочковидных (Lactobacillus) представителей отряда сбраживающих углеводы с образованием молочной кислоты как одного из основных продуктов. Особое место занимает термофильный стрептококк (Streptococcus thermophilus) - ещё один вид молочнокислых микроорганизмов. Дальние родственники Lactobacillales из класса актинобактерий — бифидобактерии часто рассматриваются в одной
I
SCIENCE TIME
I
группе с молочнокислыми бактериями.
Окончательную идентификацию проводят в специализированных лабораториях [9, 10]. В последнее время для более четкой дифференцировки микроорганизмов на уровне рода и вида (подвида), когда биохимические и основанные на молекулярно-биологических подходы, недостаточны, предлагают использовать, наряду с определением последовательностей нуклеотидов (секвенированием), многокоординатную таксономию. Более тонким методом оценки генетического сходства организмов является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов. Главным достоинством этого метода является то, что он впервые позволил провести количественную оценку родства микроорганизмов [11].
Методики испытаны в работе по подбору и селекции культур пробиотических штаммов для животных (1992-2016 годы) творческим коллективом ФГБНУ ВИЭВ и ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА.
Литература:
1. Перфильев Г.Д и др. Методические указания по селекции мезофильных молочнокислых бактерий в состав бактериальных заквасок и препаратов для мелких сычужных сыров. ВНИИМС. МУ 01.86.02.89. - 80 с.
2. Протасова И.С. Повышение качества сычужных сыров посредством углубления научных основ и разработки практических мер предотвращения фаголизиса заквасочной микрофлоры. - Дис. на соиск. ст. к.т.н. - Вологда-Молочное, - 1998 г.
3. Полянская И.С., Тераевич А.С., Макарова В. Н., Корюкина М. В. Определение назначение пробиотика // Сельскохозяйственные науки. - 2016. - №5 (8)
4. Методы селекции микроорганизмов [Электронный ресурс]. — Режим доступа. — URL: http://biofile.ru/bio/6753.html
5. Барабанщиков Б.И., Бабылил Э.В., Хамидулина Р.Г. Методы изучения мутационной изменчивости микроорганизмов. - Издательство Казанского государственного университета, 2008. - 42 с.
6. Банникова Л.А. Микробиологические основы молочного производства: Справочник / Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина; под ред. Я.И.Костина. М.: Агропромиздат, 1987. - 400 с.
7. "Безопасность работы с микроорганизмами. Санитарные правила и нормы. СП 1.3.3118-13 для работы с I-II группой патогенности (введены с 15.08.2014 года) [Электронный ресурс]. — Режим доступа. — URL: http://www.normacs.ru/Doclist/
I
SCIENCE TIME
I
8. Исследование генетической стабильности молочнокислых микроорганизмов при замораживании и низкотемпературном хранении [Электронный ресурс]. — Режим доступа. — URL: http://www.dissercat.com/content/issledovanie-geneticheskoi-stabilno
9. Научно-производственная компания СИНТОЛ [Электронный ресурс]. — Режим доступа. — URL:- http://www.syntol.ru/about/
10. ПЦР диагностика микроорганизмов [Электронный ресурс]. — Режим до ступа. — URL: http: //www. syntol .ru/
11. Лысак В.В. Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. - Минск БГУ, 2007. - 426 с.
12. Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных: справочник / М.: «ИзографЪ», 2005. - 656 с.
