CC BY
37
SCIENCE TIME
СЕЛЕКЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ПРОБИОТИКОВ. ПРИМЕНЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО МУТАГЕНЕЗА
Корюкина Марина Вениаминовна, Филиал Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии, г. Вологда
Шигина Екатерина Сергеевна, Вологодская молочнохозяйственная академия, г. Вологда
E-mail: eshigina@mail.ru
Аннотация. Данная статья посвящена вопросам селекции чистых культур, обладающих пробиотическими свойствами. Рассмотрены основные алгоритмы селекции индуцированным мутагенезом практически ценных форм из природных и производственных источников и биотопов животных.
Ключевые слова: селекция, микробиология, пробиотическая культура, индуцированный мутагенез.
Индуцированный мутагенез - метод получения искусственных мутаций (лат. «индукцио» - возбуждение, «мутацио» - изменение, «генезис» - рождение). В 20-е годы прошлого века было показано, что ионизирующее облучение резко увеличивает частоту возникновения генных мутаций. При этом мутагенный эффект наблюдается при любой дозе облучения, и при повторном облучении он суммируется. Эти исследования ассоциируются с работами М. Демереца, М. Дельбрюка, Н. В. Тимофеева-Ресовского, Н. П. Дубинина по мутагенному эффекту УФ-облучения. Спустя два десятилетия было обнаружено мутагенное действие некоторых химических соединений, таких как иприт, этиленимин, формальдегид и др. Большой вклад в изучение молекулярных основ химического мутагенеза внес отечественный генетик И. А. Рапопорт.
В 1934 г. в Институте общей генетики АН СССР, директором которого в то время был академик Н. И. Вавилов, была организована лаборатория проблем гена и мутагенеза. Её возглавил приглашенный из США профессор Г. Дж. Мёллер, удостоенный впоследствии, в том числе и за работы, выполненные
| SCIENCE TIME Щ
сотрудниками этой лаборатории, почетного звания лауреата Нобелевской премии [1, 2].
Уже первые работы по индуцированному мутагенезу привели исследователей к равнозначным представлениям об универсальности действия одних мутагенов и ограниченности действия других. Иприт и его производные вызывали мутации у всех испытуемых организмов, в то время как перекись водорода и диазометан были способны индуцировать мутации у насекомых и микроорганизмов, но не у растений. Специфичность действия мутагенов определяется химическими особенностями реакций с генным материалом. Предполагают, что повышенная мутабельность отдельных локусов может зависеть от большего скопления одних или других азотистых оснований, с которыми данный мутаген наиболее реактогенен. Вместе с тем повторяемость азотистых оснований в цепи нуклеиновых кислот объясняет причину изменчивости под действием мутагенов разных генов [2].
Несмотря на общее понимание природы индуцированного мутагенеза, конкретные причины возникновения различных спонтанных мутаций чаще всего остаются неизвестными.
Системно-аналитический метод [3, 4] для получения эффективного бактериального консорциума, после предварительных этапов:
- определения назначения пробиотика;
- выбора критериев оценки возможности культур для использования в проектируемом препарате включает селекцию чистых культур, отвечающих выбранным критериям [5, 6].
Получение новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, т.е. селекция включает методы [7, 8]: селекции посредством естественного отбора практически ценных форм; применения индуцированного мутагенеза, позволяющего усилить появление различных мутаций; генетические методы рекомбинации.
Для улучшения отдельных свойств микроорганизмов могут быть использованы методы мутагенеза. Вероятность возникновения мутаций у микроорганизмов - примерно 1 мутация на 1 млн. особей по каждому гену. Посредством мутагенеза удается повысить наследственную изменчивость микроорганизмов в десятки и сотни раз, благодаря чему облегчается и ускоряется процесс отбора высокопродуктивных штаммов.
Мутагены могут быть как физические: (ультрафиолетовые (УФ-) лучи, гамма (О-) лучи, рентгеновские лучи, температура, быстрые нейтроны и др.); так и химические: иприт, диазометан, этиленимин, нитрозосоединения (N-нитрозо-N-этилмочевина, N-нитрозогуанидин), диметилсульфат, этилметансульфонат и др. соединения с выраженным мутагенным действием; комбинированные: физические и химические (сочетание предыдущих или, например,
| SCIENCE TIME Щ
геотермальные воды).
В табл.1 приведены примеры режимов мутагенной обработки, использованные селекционерами для получения улучшенных форм.
Основные этапы получения микроорганизмов методом индуцированного мутагенеза:
- выбор исходной культуры;
- предварительный отбор естественных вариантов;
- подготовка культуры к мутагенной обработке;
-мутагенная обработка культуры;
-выявление и отбор перспективных мутантов с улучшенными свойствами.
Выбор исходной культуры осуществляют из числа производственно-ценных штаммов или выделенных из природных источников (стабильно сохраняющих основные свойства на протяжении не менее 5 пассажей), у которых нужно улучшить те или иные свойства.
Предварителъный отбор естественных вариантов. Культуру засевают петлёй в соответствующую жидкую питательную среду и инкубируют при оптимальных условиях для получения свежей культуры. Затем штаммы высевают на поверхность агараризованной среды с таким расчетом, чтобы на поверхности каждой чашки Петри получить от 10 до 20 изолированных колоний. Получают не менее 20 вариантов (изолятов, клонов) каждой культуры на жидкой питательной среде. В соответствии с тем, какое свойство культуры предполагают улучшить (антибиотическую активность, кислотоустойчивость, устойчивость к действию желчи, фермента, выработка перекиси водорода и др.), исследуют все 20 изолятов культуры. Для получения улучшенных форм целесообразно использовать культуры с коэффициентом вариации признака выше 10%. Для дальнейшей работы отбирают 2-3 клона, показавших лучшие свойства.
Таблица 1
Примеры получения штаммов с применением индуцированного мутагенеза [3, 8, 9]
Культуры Мутаген, дозировка Эффект Авторы
L.lactis sp. lactis Этиленимин (1:30000), или N-нитрозо- N-этилмочевина (1% р-р, 30-60 мин.) Увеличение кислотообразующей активности на 30% Пятницина И.Н., Королёва Н.С., Банникова Л.А.
L. lactis sp. diacety-lactis О-лучи (85-130 крат) Увеличение образования диацетила в 25 раз Гриневич А.И.
| SCIENCE TIME Щ
продолжение таблицы 1
L. lactis sp. lactis L. lactis sp. diacety-lactis №нитрозо- N этилмочевина (0,02-1% р-р, 1-6 час) или У-лучи, (300-800 крат) или УФ-лучи (30-150 с) Увеличение липоли-тической активности Каган ЯР.
L.plantarum У-лучи (3-50 крат) Повышение кислото-образования в 3-4 раза Квасников Е.И., Гриневич А.И., Пантюхина Е.А.
L.casei рентгеновские лучи (36-54 т.рентг.) Увеличение протео-литической активности в 2,5-4,6 раза Диланян З.Х. и др.
L.lactis sp. lactis Этиленимин в сочетании с УФ-лучами Увеличение продукции низина Стоянова Л.Г., Шарма Среоши, Егоров НС.
Подготовка культуры к мутагенной обработке. Наибольшей чувствительностью к мутагенным факторам обладают молодые, активно метаболизирующие клетки бактерий (экспоненциальная культура), отмытые от питательной среды. Пример получения такой культуры для лактококков: В 50 мл бульона из гидролизованного молока или жидкой среды MRS вносят 0,5 мл 18-часовой культуры селектируемого штамма, выращенной при 30 °С и инкубируют 4 ч при этой же температуре. Полученную четырёхчасовую культуру разливают в стерильные (центрифужные) пробирки и центрифугируют 5 мин со скоростью 5 тыс об/ мин. Надосадочную жидкость сливают, а осажденные клетки ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе, доводя суспензию до первоначального объема, и центрифугируют при вышеуказанном режиме. Операцию промывки и центрифугирования повторяют несколько раз с новой порцией физиологического раствора. Количество клеток в суспензии доводят до 108-109 КОЕ (возможен фотоколориметрический контроль).
При фотоколориметрическом контроле количества клеток в суспензии используют зелёный светофильтр и составленную заранее градуировочную кривую зависимости оптической плотности нескольких последовательных разведений суспензии от содержания клеток, определённого стандартным чашечным методом. Градуировочную кривую строят для каждого селектируемого штамма свою [3].
Мутагенная обработка культуры. Для каж дого штамма, соблюдая соответствующие меры предосторожности, подбирают дозу мутагена: подготовленную культуру обрабатывают его различными дозами и строят график
| SCIENCE TIME Щ
зависимости выживаемости культуры от дозы мутагена. Для индуцирования применяют дозы конкретного мутагена, при которых выживает от 1 до 10% от исходного количества клеток в суспензии. Контроль не подвергается мутагенной обработке.
В частности, при обработке популяции клеток селектируемого штамма УФ -излучением с помощью лампы, испускающей излучение преимущественно с длинной волны 253,7 нм (БУФ-15), пробирки с бактериальной суспензией размещают таким образом, чтобы обеспечить максимальную изотропность УФ-излучения в образце во время облучения, для чего во время облучения жидкости её перемешивают магнитной мешалкой. Перед облучением лампу 10 мин выдерживают включённой. На расстоянии 32 см от центра лампы время экспозиции для достижения выживаемости составляет от 30 до 150 сек [3].
Обработка раствором мутагена на примере нитрозосоединения: Раствор мутагена ^нитрозо- ^этилмочевины с концентрацией от 0,02% до 1,0% готовят за 10-15 мин до обработки, растворяя навеску в цитратном буфере (5,5+0,1) рН. В стерильную пробирку помещают 3,0 мл приготовленного раствора мутагена, в другую (контрольную) - 3,0 мл цитратного буфера (5,5+0,1) рН. В обе пробирки вносят по 3,0 мл культуры селектируемого штамма, подготовленной к мутагенной обработке. Пробирки осторожно встряхивают, перемешивая мутаген с бактериальными клетками и инкубируют при оптимальной для культуры температуре (если температура не является дополнительным мутагенным фактором). По истечении определённого времени (от 1 до 6 ч) из них отбирают
17 1
по 1 мл и готовят разведения от 10- до 10- , причём для разведения 10-используют цитратный буфер (8,0+0,1) рН (для инактивации мутагена), а для последующих разведений - стерильный физиологический раствор.
Правила техники безопасности работы с мутагеном в каждом случае специфичны, на примере работы с нитрозосоединениями, важнейшими из них являются: мутаген хранится в запаянных ампулах в морозильном отделении холодильника, в котором запрещается хранить продукты питания, приготовление навески и раствора мутагена проводят в вытяжном шкафу, по окончании мутагенной обработки посуду, соприкасающуюся с мутагеном, промывают 1% раствором гидроксида натрия.
Выявление и отбор перспективных мутантов с улучшенными свойствами. После обработки суспензии проводят подсчёт выживаемости, выделение изолированных колоний из чашек Петри, засеянных обработанной мутагеном суспензией, на которых число КОЕ не превышает 150. Для этого чашечным
С
методом ( по1 мл разведений от 10- до 10- ) в обработанной мутагеном и контрольной суспензией клеток селектируемого штамма определяют КОЕ. Выделение колоний производят лишь в случае, если выживаемость составила от 1 до 50%.
I
SCIENCE TIME
I
Для выделенных и отобранных по улучшенному признаку мутантов проводят многократный пересев и проверку сохранения свойства через каждые 5 -10 пассажей [3].
Несмотря на достижения молекулярной генетики и генной инженерии, применение и совершенствование индуцированного мутагенеза остается актуальной задачей для селекционеров, т.к.
- мутагенез лишь увеличивает частоту происходящих мутаций, без передачи наследственного материала между различными микроорганизмами, как это происходит в генетических методах, а не все ГММО считаются абсолютно безопасными;
- мутагены повсеместны в природе, мутации под их действием происходят in vivo, что обуславливает дополнительный интерес селекционеров к естественным мутагенам: геотермальным водам, геомагнитным и космическим излучениям и т.п.;
- во многих случаях индуцированный мутагенез представляет собой не только научный интерес, но и позволяет практически получить устойчивые ценные мутанты с улучшенными, в том числе пробиотическими свойствами.
Литература:
1. Спонтанный и индуцированный мутагенез // Биофайл [Электронный ресурс]. — Режим доступа. — URL: http://biofile.ru/chel/1777.html
2. Тайны вирусов. Спонтанный и индуцированный мутагенез.
3. Перфильев Г.Д и др. Методические указания по селекции мезофильных молочнокислых бактерий в состав бактериальных заквасок и препаратов для мелких сычужных сыров. ВНИИМС. МУ 01.86.02.89. - 80 с.
4. Протасова И.С. Повышение качества сычужных сыров посредством углубления научных основ и разработки практических мер предотвращения фаголизиса заквасочной микрофлоры. - Дис. на соиск. ст. к.т.н. - Вологда-Молочное, - 1998 г. - 161 с.
5. Полянская И.С., Тераевич А.С., Макарова В. Н., Корюкина М. В. Определение назначение пробиотика // Сельскохозяйственные науки. - 2016. - №5 (8).
6. Тераевич А.С., Полянская И.С. Выбор критериев оценки побиотических культур // Сельскохозяйственные науки. - 2016. - №5 (8).
7. Барабанщиков Б.И., Бабылил Э.В., Хамидулина Р.Г. Методы изучения мутационной изменчивости микроорганизмов. - Издательство Казанского государственного университета. 2008. - 42 с.
8. Банникова Л.А. Микробиологические основы молочного производства: Справочник / Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина; под ред. канд.техн.наук Я.И.Костина. М.: Агропромиздат, 1987. - 400 с.
I
SCIENCE TIME
I
9. Стоянова Л.Г., Шарма Среоши, Егоров Н.С. Получение высокопродуктивных штаммов низинпродуцирующих бактерий с помощью мутагенов // Современные достижения биотехнологии. 1995. С. 20-22.
10. Методические указания. Получение генетически модифицированных молочнокислых бактерий с ценными для сыроделия свойствами (Ю.Я. Свириденко, Г.Г. Перфильев, И.С. Протасова) // ВНИИМС. - Углич. - 1997. - 22
11. Полянская И.С. Нутрициологическая химия s-элементов. - Вологда-Молочное: ИЦ ВГМХА, 2011. - 139 с.
12. Полянская И.С., Топал О.И., Тераевич А.С., Новокшанова А.Л., Забегалова Г.Н. Нутрициологические, микробиологические, генетические и биохимические основы разработки и производства продуктов с пробиотиками. - Вологда-Молочное. - 2013. - 149 с.
13. Полянская И.С. Тераевич А.С. и др. Функциональные продукты питания // По стопам Вернадского, Покровского, Мечникова, Королева, Чижевского. -Germany: LAP LAMBERT Academic Publishing is a trademark of: AV Akademikerverlag GmbH.
с.
