CC BY
2И.С. Гордей, Н.Б. Белько, И.С. Щетько, И.А. Гордей
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ДУПЛИКАЦИИ ГЕНОМА У ОЗИМОЙ РжИ (SECALE CEREALE L.)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
В эволюции большинства высших растений полиплоидия сыграла решающую роль. Широкое распространение полиплоидных форм в природных популяциях и их значение для процессов видообразования установлено на большом и разнообразном фактическом материале. По образному выражению П.М. Жуковского, «человечество питается в основном продуктами растительной полиплоидии» [1]. Установление роли дупликации геномов в эволюции живых организмов [2] обуславливает необходимость экспериментального обоснования генетических эффектов и молекулярно-генетических механизмов этого явления.
Экспериментальная полиплоидия на современном этапе является одним из перспективных методов создания генетического разнообразия исходного материала для селекции. Однако, интенсивность работ за последние 10 лет по созданию новых тетраплоидных сортов озимой ржи снизилась, что обусловлено ограниченностью генофонда и недостаточной изученностью генетической изменчивости при дупликации генома [3].
Дупликация генома (полиплоидия) - больше, чем простое удвоение генома. Она включает комплекс молекулярно-генетических процессов, ведущих к геномным перестройкам [4-7]:
1. Геномные перегруппировки, обмен между геномами, рекомбинации между гомеологич-ными хромосомами;
2. Дифференциальная элиминация генов дублированного генома;
3. Диферсификация гена - приобретение геном новой функции на основе избыточности ДНК, функциональное расхождение генов;
4. Перегруппировка последовательностей ДНК, метилирование ДНК;
5. Изменение структуры хроматина, активация ретротранспозонов, вызывающих транслокации хромосом;
6. Эпигенетическое замолкание генов после дублирования - важнейший фактор полиплоидной эволюции;
7. Изменение пространственной организации хромосом в интерфазном ядре, обуславливающее изменение эпигенетического контроля экспрессии генов.
Известно, что у полиплоидов в профазе первого деления мейоза, как правило, образуются мультивалентные комплексы хромосом в отличие от бивалентных комплексов у диплоидов. При этом нарушается кроссинговер между гомологичными хромосомами и распределение хромосом по дочерним клеткам. Нарушения конъюгации хромосом в мейозе могут явиться причиной их структурных изменений - дупликаций, делеций, транслокаций или инверсий отдельных участков хромосом. Показано, что у модельных полиплоидов наблюдаются быстрые потери одних генов и специфическая инактивация других за счет метилирования [8]. В настоящее время не вызывает сомнений влияние пространственной организации хромосом в ядре растений на регуляторную функцию генов в развитии. Вопрос о пространственном положении генетического материала в интерфазном ядре эукариотической клетки в последнее время приобретает особое значение, так как рассматривается в свете эпигенетического контроля экспрессии генов [7].
Эти и другие изменения генетического аппарата при дупликации генома вызывают наследственно обусловленные разнообразные проявления ботанико-морфологических, анатомических, молекулярно-генетических, цитологических, физиологических, биохимических и других признаков и свойств растений.
Материалы и методы
Материалом исследований служили новые диплоидные сорта и гибриды (ЯЛ, 2х=14) и созданные на их основе тетраплоидные формы (ЛЯЛЯ, 4х=28) озимой ржи (Беса1е cerealе L.). Тетраплоидные формы ржи получены в лаборатории хромосомной инженерии растений Института генетики и цитологии НАН Беларуси с использованием усовершенствованного метода полиплоидизации растений закисью азота (N20) [8]. Цитологический анализ ключевых этапов микроспорогенеза и определение фертильности пыльцы проводили на давленых препаратах апикальных меристем корня и пыльников, окрашенных 2%-м раствором ацетокармина в 45%-й уксусной кислоте.
Анализ хромосомного состава ди- и те-траплоидных форм проводили с примене-
нием модифицированного С-метода дифференциального окрашивания хромосом ржи (С-бэндинг) [9].
Электрофорез запасных белков семян (се-калинов) проводили в полиакриламидном геле в вертикальных пластинах электрофо-ретической камеры «VE-4M», производства ООО «Биоклон» по методическим указаниям ВИР [10].
Специфичность геномов диплоидной и те-траплоидной озимой ржи на уровне ДНК устанавливали методом ПЦР с произвольными праймерами (RAPD-анализ). ДНК выделяли с помощью Genomic DNA Purification Kit фирмы Fermentas. В качестве маркера молекулярного веса использовали 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas) [11].
Результаты и обсуждение
Принимая во внимание повышенный уровень геномной нестабильности вновь созданных ау-тотетраплоидов и его влияние на их общую продуктивность, проведено изучение хромосомного состава тетраплоидных форм и исходных дипло-
идных сортов озимой ржи. Результаты цитологического анализа потомства тетраплоидных форм ржи представлены в табл. 1 и свидетельствуют о незначительном (до 9,7%) присутствии анеупло-идных растений в популяциях.
Таблица1
Содержание анеуплоидных растений у созданных тетраплоидных форм озимой ржи
Тетраплоидные формы Число хромосом у растений
28 27 28 + фрагм. хром.
растений, шт. % растений, шт. % растений, шт. %
Алькора 68 98, 6 1 1,4 - -
Зарница 56 93,3 3 5 1 1,7
Юбилейная 54 100 - - - -
Плиса 62 90,3 5 8,1 1 1,6
Выявленные анеуплоиды были представлены в основном 27-хромосомными гипотетраплоидами. Количество их у разных тетраформ ржи было различным и варьировало в интервале 0-8,1%. Наибольшее количество 27-хромосомных растений (8,1%) выщепилось в потомстве тетраплоидной формы ржи Плиса. У тетраплоидной ржи Юбилейная гипотетраплоидные растения отсутствовали.
Формирование гипертетраплоидных растений (28 хромосом + фрагмент хромосомы) отмечено в 3,3% случаев у тетраплоидных форм Зарница и Плиса.
Из исследованных тетраформ озимой ржи наибольшей стабильностью хромосомного состава характеризовалась форма Юбилейная, тогда как форма Плиса содержала максимальное количество анеуплоидных растений.
С целью изучения стабильности и сбалансированности кариотипов 28-хромосомных растений озимой ржи, а также выявления возможных хромосомных перестроек, вызванных дупликацией генома, проведен сравнительный анализ карио-типов созданных тетраплоидов с исходными диплоидными сортами с использованием С-метода
дифференциального окрашивания хромосом.
Установлено, что включенные в анализ 28-хромосомные растения являлись геномно сбалансированными тетраплоидами (RRRR, 4х=28) и не содержали видимых структурных изменений хромосом (рис. 1).
Для полученных форм тетраплоидной озимой ржи характерны следующие особенности стабилизации генома: • низкая частота содержания и узкий спектр выщепления в потомстве анеуплоидных растений;
• генотипическая специфичность частоты и спектра выщепления анеуплоидов.
Наблюдаемые особенности, на наш взгляд, обусловлены следующими факторами:
• разным уровнем нарушений в мейозе у исходных диплоидных сортов и созданных на их основе аутополиплоидов;
• гибелью анеуплоидов с числом хромосом, значительно отклоняющимся от эуплоид-ного в результате элиминации зигот;
• отсутствием мутагенного эффекта закиси азота при полиплоидизации растений.
Рис. 1. Кариотипы тетра (А) и исходной диплоидной (Б) форм озимой ржи Алькора
Для более полного исследования генетических эффектов дупликации генома у новых те-траплоидных форм проведен анализ процесса мейоза.
Мейоз является одним из важнейших и универсальных биологических процессов в жизненном цикле эукариотических организмов, размножающихся половым путем [12]. Поэтому только при глубоком и детальном изучении всех нарушений, возникающих на этапе микроспорогенеза, можно понять причины нарушения кроссинговера между гомологичными хромосомами, механизмы образования хромосомных перестроек и повышенного содержания анеуплоидов у аутотетраплоидов.
У созданных тетраплоидов озимой ржи наблюдаются значительные нарушения в мейозе, что приводит к «реверсии плоидности» и образованию клеток иных уровней плоидности, в том числе анеуплоидных [2,11].
В целом, нарушения мейоза, наблюдаемые в материнских клетках микроспор в первом и втором мейотических делениях у тетраплоидных форм и диплоидных сортов, были аналогичными. Однако у тетраплоидов мейоз протекал со значительно большими нарушениями (табл. 2), к числу которых относятся:
• мультивалентные и унивалентные ассоциации хромосом в метафазе I;
• отстающие униваленты, фрагменты хромосом и хромосомные мосты в анафазе I;
• присутствие микроядер в диадах и тетрадах микроспор;
• отстающие униваленты, фрагменты хромосом и хромосомные мосты в анафазе II;
• асинхронное деление в клетках диады;
• образование пентад, гексад и других типов полиад.
Проведенные исследования показали, что у тетраплоидных форм озимой ржи среди хромосомных ассоциаций преобладали биваленты. Помимо бивалентов, со значительной частотой встречались уни-, три- и квадриваленты, число которых на клетку варьирует.
Как видно из табл. 2, у полученных тетра-плоидов, в отличие от диплоидной ржи, в ме-тафазе I достаточно часто (от 7,9 до 19,2%) встречались микроспороциты с унивалентными хромосомами. При этом модальным классом у всех форм были материнские клетки пыльцы (МКП) с одним унивалентом. Частота МКП с унивалентными хромосомами у диплоидных форм на стадии метафазы I составила 1,2-3,3%.
Таблица 2
Частота нарушений по стадиям мейоза у новых тетраплоидных форм и исходных
диплоидных сортов ржи, %
Сорта и формы Метафаза I Анафаза I Метафаза II Анафаза II Тетрады
Тетраплоидные формы (КККЯ, 2п=28)
Плиса-тетра 10,4 5,8 26,9 24,6 18,3
Юбилейная-тетра 7,9 8,5 13,1 15,0 8,3
Зарница-тетра 11,8 9,0 23,4 23,4 20,7
Алькора-тетра 19,2 16,7 32,8 21,2 13,3
Среднее 11,7* 9,9* 22,2* 19,1* 14,0*
Диплоидные сорта (КЯ, 2п=14)
Плиса 3,1 1,7 1,6 2,1 0,9
Юбилейная 2,5 2,2 1,2 2,9 0,5
Зарница 3,3 1,8 1,1 2,5 1,0
Алькора 1,2 1,6 1,9 2,1 0,7
Среднее 2,5 1,8 1,5 2,4 3,1
* - различия достоверны при р < 0,05.
В литературе отмечается ряд причин, обуславливающих более высокую частоту возникновения унивалентов у тетраплоидных форм [13,14]:
• пространственная организация хромосом в интерфазном ядре тетраплоидов отличается от таковой у диплоидов;
• гомологичные хромосомы должны пересечь более длинный путь для конъюгации;
• некоторые хромосомы расположены таким образом, что силы притяжения гомологов с двумя другими настолько уравновешены, что хромосомы не в состоянии эффективно двигаться к любой гомологичной хромосоме, гомологичные хромосомы не конъюги-руют и остаются в виде унивалентов (истинные униваленты);
• многие ассоциации хромосом не прочны, что приводит к преждевременному образованию унивалентов еще до наступления позднего диакинеза или ранней мета-фазы (ложные, или псевдоуниваленты);
• тетраплоидное состояние может отличаться цитогенетической несбалансированностью, что также влияет на образование хромосомных ассоциаций.
В анафазе I в среднем количество МКП с нарушениями у тетраплоидных форм составило 9,9%, у диплоидных - 1,8%. Наибольшим
(16,7%) количеством МКП с нарушениями на этой стадии мейоза характеризуется форма тетраплоидной ржи Алькора, наименьшим (5,8%) - Плиса (табл. 2). Наиболее типичным нарушением для этой фазы мейоза является образование анафазных мостов.
Анафазные мосты предположительно могут образоваться по двум причинам [15]:
• напряжение в тетраплоидном микроспо-роците может оказаться больше, чем нити могут выдержать. Происходит разрыв хромосомной нити, а воссоединение осуществляется иным образом, вследствие чего возникает мост;
• специфичная гомологичная конъюгация четырех хромосом может иногда привести к негомологичному спариванию, которое сопровождается кроссинговером. При воссоединении может возникнуть различное расположение хромосомных сегментов, вследствие чего мосты могут образовываться в мейозе следующего поколения.
Во втором мейотическом делении нарушения встречались чаще, чем в первом, и частота их была выше у тетраплоидов, в сравнении с соответствующими фазами мейоза у диплоидной ржи (табл. 2). В среднем в метафазе II у тетраплоидных форм количество аномальных МКП почти в 2 раза больше, чем в метафазе I
и составило 22,2%. У диплоидных форм этот показатель на данной стадии составлял 1,5%. В анафазе II количество МКП с нарушениями у тетраплоидных форм озимой ржи превышало соответствующий показатель в анафазе I почти в 2 раза (19,1%). У диплоидных форм этот показатель составлял 2,4%.
В целом для всех исследованных тетраформ характерна тенденция к увеличению количества аномальных МКП на последующих стадиях мейоза. У большинства созданных тетраплоидных форм ржи нарастание мейоти-ческой нестабильности продолжалось вплоть до стадий метафазы II - анафазы II. На стадии же тетрад отмечается повышение количества нормальных МКП, общее для всех форм.
Попытки объяснить причины нарушения процесса мейоза у индуцированных аутотетраплои-дов предпринимали ряд исследователей [15, 16]. Авторы предполагают, что удвоение хромосом приводит к нарушению тонко сбалансированной системы взаимодействия генов контроля мейо-за у диплоидных растений. В настоящее время картирован ряд мейотических мутаций ^у1, sy9 sy10, sy18, sy19), контролирующих отдельные
Необходимо отметить, что у тетраплоидной ржи Зарница (рис. 2) наиболее высокий показатель фертильности пыльцы по сравнению с другими тетраплоидами. Пониженная фер-
этапы процесса мейоза у озимой ржи [17].
Главным недостатком экспериментально полученных полиплоидов, существенно ограничивающим использование их в селекции, является, как известно, пониженная семенная продуктивность, обусловленная нарушениями формирования микроспороцитов. Эта особенность аутополиплоидов представляет собой серьезное препятствие в селекционной работе, за исключением вегетативно размножаемых форм, когда бессемянность является желательным товарным признаком (арбузы).
Фертильность пыльцы является показателем нарушения формирования микроспороцитов. Из данных, представленных в табл. 3, видно, что в целом показатель фертильности пыльцы у тетраплоидных форм озимой ржи варьировал от 48,2% (Юбилейная) до 77,3% (Зарница). Фертильность пыльцы у анализируемых тетраплоидных форм составила в среднем 62,0%. У диплоидных сортов озимой ржи этот показатель находился на уровне 95,0-98,6%. В среднем фертильность пыльцы по диплоидам составила 96,8%, что достоверно выше ф < 0,05), чем у тетраплоидных форм (табл. 3).
тильность аутотетраплоидов ржи обусловлена гаметической и зиготической стерильностью. В гаметической стерильности различают пыльцевую стерильность, стерильность ма-
Таблица 3
Фертильность пыльцы у диплоидных (КН, 2х=14) и тетраплоидных (RRRR, 4х=28)
форм озимой ржи
Сорта и формы Плоид-ность Пыльцевых зерен
Всего Фертильные Стерильные Промежуточные
Кол-во, шт % Кол-во, шт % Кол-во, шт %
Плиса 4х=28 710 374 52,7 39 5,5 297 41,8
2х=14 809 784 96,9 25 3,1 - -
Алькора 4х=28 1117 781 69,9 192 17,2 144 12,9
2х=14 859 816 95,0 43 5,0 - -
Зарница 4х=28 845 653 77,3 58 6,8 134 15,9
2х=14 779 768 98,6 11 1,4 - -
Юбилейная 4х=28 1245 600 48,2 57 4,6 588 47,2
2х=14 839 810 96,5 29 3,5 - -
Среднее 4х=28 - - 62,0* - 8,5* - 29,5*
2х=14 - - 96,8 - 3,3 - -
* - различия достоверны при р < 0,05
кроспор и зародышевых мешков. Гаметиче- ниями мейоза, которые возникают в результате ская стерильность и неполноценность гамет в дисбаланса генетической системы контроля значительной степени определяются наруше- мейоза у индуцированных аутополиплоидов.
Рис. 2. Пыльца тетраплоидной формы Зарница (КККЯ, 4х=28)
По белкам-маркерам можно оценивать три главных типа изменчивости: геномную, генную и аллельную. Геном как генетическая система особенно отчетливо выражен на уровне вида, и для его идентификации и экспрессии наиболее эффективны видоспецифичные запасные белки. У ржи такими белками являются секалины.
С целью выявления различий в экспрессии генетических систем геномов новых тетрапло-
идных форм озимой ржи в сравнении с исходными диплоидными сортами проведен электрофорез запасных белков секалинов семян.
У изученных генотипов ржи идентифицировано 66 типов спектра секалина зерновок, неравномерно распределенных среди диплоидных сортов и тетраплоидных форм: от 7 до 19, в зависимости от сорта и формы, для каждого из которых характерен специфический состав (табл. 4).
Таблица 4
Состав и интенсивность компонентов секалина у исходных диплоидных сортов
и тетраплоидных форм озимой ржи
Диплоидные сорта и тетраплоидные формы Состав и интенсивность полипептидов секалина
в 1 ю
Зарница (ЯЛЯЯ, 2п=28) 12345 45 2345 78910111213
Зарница(КЯ, 2п=14) 2345 5 234 7891011
Юбилейная(КККЯ, 2п=28) 12345 1 45 123456789101112
Юбилейная (ЯЯ, 2п=14) 2345 5 234 78 1011
Алькора (ЯЯ^, 2п=28) 2345 5 1234 67891011
Алькора(ЯЯ, 2п=14) 2345 1 1234 7891011
Плиса (ЯЯ^, 2п=28) 2345 1234 678910111213
Плиса (ЯЯ, 2п=14) 2345 234 7891011
Для всех ЭФ-спектров секалина изучаемых сортов и форм ди- и тетраплоидной озимой ржи (рис. 3, табл. 4) характерно наличие совместно наследуемого триплета компонентов
ю 234, кодируемых кластером генов, локализованных в коротком плече 1Я хромосомы, а также 45 компонента в Р-зоне. Внутрисор-товой полиморфизм секалина у исследуемых
сортов и форм проявляется по компонентам понентов, причем в сорте или форме, как
Р-, у - и ю-зон. Сорта и формы отличаются правило, преобладает 2-3 характерных для
друг от друга соотношением типов спектра них ЭФ-типа. секалина и интенсивностью отдельных ком-
Рис. 3 Электрофоретические спектры секалина диплоидных сортов и созданных на их основе тетраплоидных форм озимой ржи: 1 - Зарница (ЯЯЯЯ, 4п=28); 2 - Зарница (ЯЯ, 2п=14); 3 - Алькора (ЯЯЯЯ, 4п=28); 4 - Аль-кора (ЯЯ, 2п=14); 5 - Юбилейная (ЯЯЯЯ, 4п=28); 6 - Юбилейная (ЯЯ, 2п=14); 7 - Плиса (ЯЯЯЯ, 2п=28); 8 - Плиса (ЯЯ, 2п=14). St - стандартный спектр (пшеница Кавказ)
Наибольшей изменчивости подвержены компоненты ю-зоны. У ряда генотипов отмечена элиминация компонентов ю 7, ю 11, ю 12, появление ю 1 и ю 6. В Р-зоне часто происходит элиминация компонентов Р 1, Р 2 и р 3.
Сравнение ЭФ-спектров секалина показало, что у тетраплоидных форм внутрисортовой полиморфизм значительно шире и достигает 10-19, у исходных диплоидных сортов - от 7 до 10 типов спектра. В электрофоретическом спектре секалина большинства тетраплоидных генотипов появляются у4 и у5 компоненты, отсутствующие у исходных диплоидных сортов, а компонент у1, присущий исходному диплоидному гибриду, может быть элиминирован у полученного тетраплоида. У ряда тетраплои-дов наблюдается появление в ЭФ-спектре компонентов ю1213, не выявленных у исходных диплоидов.
Современные молекулярно-генетические методы позволяют исследовать внутривидовой и межвидовой полиморфизм ДНК с целью изучения специфичности генома, генетического маркирования и идентификации селекционного материала [11].
Для выявления изменений на уровне ДНК, произошедших в результате дупликации генома, проведен RAPD-анализ ДНК тетрапло-идных форм и исходных диплоидных сортов озимой ржи.
Результаты молекулярно-генетического анализа созданных тетраплоидных форм озимой ржи с использованием RAPD-метода представлены в табл. 5 и на рис. 4, 5.
С использованием RAPD-метода у исследуемых сортов и форм ди- и тетраплоидной ржи выявлено по 66 фрагментов ДНК соответственно. Число амплифицированных фрагментов ДНК (ампликонов) в суммарной выборке растений варьировало от 6 до 12 в зависимости от праймера, их размер составлял от 300 до 3000 п.н. (табл. 5). В среднем при RAPD-анализе ДНК анализируемых образцов ржи один праймер инициировал синтез 8 фрагментов ДНК. Из 8 праймеров наиболее эффективными для озимой ржи оказались ОРА 5 и Р 36. С их помощью в изученных ди- и тетраплоид-ных популяциях выявлено 10 и 11 фрагментов ДНК соответственно (рис. 4, 5).
Наличие до 80,0% полиморфных фрагментов ДНК в спектрах исследуемых генотипов демонстрирует относительно высокий внутри-подвидовой и индивидуальный полиморфизм у ди- и тетраплоидов ржи, который объясняется присутствием в их геномах высокоповто-ряющихся последовательностей ДНК.
Специфических фрагментов ДНК, которые являлись бы видоспецифическими маркерами и могли бы использоваться в генотипировании диплоидов или тетраплоидов, не обнаружено (рис. 4, 5).
Таблица 5
Характеристика праймеров и амплифицированных с их помощью фрагментов ДНК у растений тетраплоидной ржи, полученных в результате полиплоидизации диплоидных сортов
RAPD-праймер Нуклеотидная последовательность Размер фрагментов, п. н. Число фрагментов
Учитываемых Полиморфных (всего/частота, %)
Диплоиды Тетра-плоиды Диплоиды Тетра-плоиды
ОРА 5 AGGGGTCTTG 400-2000 10 10 6/60,0 6/60,0
ОРА 20 AGGTCTTGGG 500-2500 7 8 3/42,8 4/50,0
OPV 02 CTGAGGTCTC 300-1500 6 6 3/50,0 3/50,0
Р 136 AGCCTCGATT 500-2000 8 8 5/62,5 6/75,0
Р 36 CCGAATTCGC 700-2800 9 10 7/77,8 8/80,0
Р 39 CCAGTTCGCC 800-3000 6 6 4/67,6 3/50,0
АРГ 22 TCGCCCCATT 380-1900 8 7 5/62,5 4/57,1
В 220700 GTCGATGTCG 380-2500 12 11 9/75,0 8/72,7
Всего - - 66 66 42/63,6 42/63,6
Рис. 4 RAPD-спектр амплифицированных фрагментов ДНК растений ди- (1 - Алькора, 2 - Плиса, 3 - Зарница, 4 - Юбилейная, 5 - Заречанская зеленоукосная) и тетраплоидной (6 - Алькора-тетра, 7 - Плиса тетра, 8 -Зарница-тетра, 9 - Юбилейная-тетра, 10 - Заречанская зеленоукосная-тетра) озимой ржи, полученный с использованием праймера ОРА 5. SP - фрагменты ДНК с известным числом пар оснований
Электрофоретический анализ амплифицируе-мых фрагментов ДНК созданных тетрааналогов в сравнении с их исходными диплоидными сортами в 70% случаев выявил существенные различия в спектрах. У тетраплоидов у 25% спектров обнаружено появление 1-3 фрагмента ДНК размером от 300 до 4000 п.н., отсутствующих у исходных диплоидных сортов. RAPD-анализ выявил у тетраплоидов потерю (20%) или одновременно потерю и появление (30%) отдельных полиморфных фрагментов ДНК. Чаще элиминировали фрагменты ДНК размером от 700 до 1700 п.н. (рис. 4, 5).
Обнаруженные различия в спектрах ампли-фицированных фрагментов ДНК диплоидов и тетраплоидов свидетельствуют о структурных изменениях генома ржи при дупликации [18, 19]. Они могут быть обусловлены [20, 21]:
• структурными изменениями ДНК в результате ее избыточности при дупликации генома;
• дифференциальной элиминацией и диверсификацией генов дублированного генома;
• перегруппировкой последовательностей ДНК, метилированием ДНК;
• блочными перестройками, которые приво-
Рис. 5 ЯАРБ-спектр амплифицированных фрагментов ДНК растений ди- (1 - Алькора, 2 - Плиса F1, 3 - Зарница, 4 - Юбилейная, 5 - Заречанская зеленоукосная) и тетраплоидной (6 -Алькора-тетра, 7 - Плиса тетра, 8 -Зарница-тетра, 9 - Юбилейная-тетра, 10 - Заречанская зеленоукосная-тетра) озимой ржи, полученный с использованием праймера Р36. SP - фрагменты ДНК с известным числом пар оснований
дят к комбинированию фрагментов из раз- ские эффекты дупликации генома у озимой ржи.
ных генов и к появлению белков с разными Выявленные факторы оказывают влияние на
функциями при дупликации генома. степень проявления морфологических и хозяй-
На рис. 6 представлены основные генетиче- ственно полезных признаков полиплоидов [22].
Рис. 6 Генетические эффекты дупликации генома у озимой ржи (X сегеа1е L.)
Заключение
Проведенные исследования эффектов дупликации генома у озимой ржи на клеточном (ка-риотип, процесс мейоза, фертильность пыльцы), белковом (полиморфизм запасных белков семян секалинов) и на уровне ДНК (полиморфизм ядерной ДНК) позволили сделать ряд выводов: • индуцированные с использованием закиси азота (N20) 28-хромосомные растения озимой ржи являются геномно сбалансированными аутотетраплоидами (ЯЯЯЯ,
4х=28) и не содержат видимых структурных изменений хромосом. Уровень содержания анеуплоидов в их потомстве относительно низкий (до 9,7%) и представлены они, в основном, 27-хромосом-ными гипотетраплоидами; • в ранних поколениях (№-N3) аутотетра-плоидов озимой ржи, индуцированных закисью азота (N20), выявлена достоверно (р < 0,050) более высокая частота нару-
шений мейоза по сравнению с исходными диплоидами, что связано с нарушением тонко сбалансированной у диплоидов генетической системы контроля мейоза. Количество материнских клеток микроспор с нарушениями у тетраплоидов варьировало в зависимости от стадии мейоза от 9,9 до 22,2%, у диплоидов - от 1,5 до 3,1%;
• дупликация генома у ржи может приводить к элиминации отдельных компонентов секалина, присущих исходным диплоидным сортам, проявлению новых компонентов, не выявленных у исходных сортов, а также к значительному увеличению сортового полиморфизма ЭФ-спектра секалина у тетраплоидов, что обусловлено изменениями экспрессии дуплицированных генов;
• RAPD-анализ полиморфизма ядерной ДНК у тетраплоидных форм и исходных диплоидных сортов озимой ржи выявил
существенные различия в их электро-форетических спектрах. У тетраплоидов обнаружено появление 1-3 фрагментов ДНК размером от 300 до 4000 п.н., отсутствующих у исходных диплоидных сортов, а также элиминация отдельных фрагментов ДНК. Чаще элиминировали фрагменты ДНК от 700 до 1700 п.н. Выявленные различия в электрофорети-ческих спектрах амплифицированных фрагментов ДНК у тетраплоидов свидетельствуют о структурных изменениях ДНК при дупликации генома ржи.
Таким образом, дупликация генома у ржи приводит к нарушению генетической системы регуляции мейоза ^у1, sy9 sy10, sy18, sy19), изменению экспрессии генов видоспецифичес-ких запасных белков семян (секалинов) и к структурным изменениям ДНК, что оказывает влияние на проявление признаков и свойств у полиплоидов.
Список использов
1. Жуковский, П.М. Эволюция культурных растений на основе полиплоидии / П.М. Жуковский // В кн: Полиплоидия и селекция. -Москва-Ленинград, 1963. - С. 5-10.
2. Оно, С. Генетические механизмы прогрессивной эволюции / С. Оно // под ред. и с предисл. д-ра биол. наук. Б.Н. Сидорова. -М.: «Мир», 1973. - 227 с.
3. Тороп, А.А. Направления, методы и результаты селекции озимой ржи в Центрально-Черноземной зоне / А.А. Тороп, В.Г. Дедяев, В.В. Чайкин // Новые методы селекции озимых колосовых культур. - Уфа, 2001. - С. 48-54.
4. Adams, K.L. Polyploidy and genome evolution in plants / K.L. Adams, J.F. Wendel // Curr. Opin. PlantBiol, 2005. - V. 8. - P. 135-141.
5. Wendel, J. Genome evolution in plants / J. Wendel // Plant. mol. boil, 2000. - P. 225-249.
6. Adams, K.L. Organ-specific silencing of duplicated genes in a new synthesized cotton allo-tetraploid / K.L. Adams, R. Percifield, J. Wendel // Genetics, 2004, №168. - P. 2217-2226.
7. Стегний, В.Н. Пространственная организация хромосом в ядре. Эпигенетические и эволюционные аспекты / В.Н. Стегний // Факторы экспериментальной эволюции организмов:
нной литературы
сб. науч. ст. - Т. 10. - Киев: Логос, 2011. -С.73-78.
8. Белько, Н.Б. Создание тетраплоидных форм озимой ржи с использованием закиси азота и генетические эффекты дупликации генома / Н.Б. Белько, И.А. Гордей, И.С. Щетько, И.С. Гордей // Факторы экспериментальной эволюции организмов: сб. науч. ст. - Т. 10 -Киев: Логос, 2011. - С. 14-19.
9. Бадаева, Е.Д. Изменение хромосом ржи в кариотипе тритикале: дис.... канд. биол. наук: 03.00.15 / Е.Д. Бадаева. - М., 1984. - 181 с.
10. Конарев, В.Г. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / В.Г. Конарев, И.П. Гаврилюк, Н.К.Губарева и др. - Санкт-Петербург, 2000. -С. 38-48.
11. Сиволап, Ю.М. Вариабельность и специфичность геномов сельскохозяйственных растений / Ю.М. Сиволап, Н.Э. Кожухова, Р.Н. Календарь. - Одесса: «Астропринт», 2011. - С. 49-74.
12. Куварин, В.В. Цитологическая и селекционная особенность анеуплоидов и реверсивных диплоидов ржи / В.В. Куварин // Тез. докл. ГУ Всесоюзного совещания по полиплоидии. - Киев, 1975. - С. 63-64.
13. Шкутина, Ф.М. Мейоз у отдаленных гибридов и амфиплоидов / Ф.М. Шкутина // В сб.: Цитология и генетика мейоза. - М., 1975. - С. 28-36.
14. Moens, P. Molecular perspectives of chromosome pair in gatmeiosis // Bioessays, 1994. -Vol. 16, №2. - Р. 101-106.
15. Соснихина, С.П. Изучение генетического контроля мейоза у ржи / С.П. Соснихина, Ю.С. Федотова, В.Г. Смирнов, Е.И. Михайлова, Ю.Ф Богданов. - Генетика, 1994. - Т.30. -С.1043-1056.
16. Национальный Интернет-портал РФФИ [Электронный ресурс] / Книги, изданные при поддержке РФФИ - Режим доступа: http:// www.rfbr.ru/old/pub/knigi/j anus/golub.htm. Дата доступа: 12.03.2010.
17. Долматович, Т.В. Молекулярно-генети-ческий анализ и картирование мейотических мутаций у ржи (Secale cereale L.): автореф.
дис........канд. биол. наук: 03.01.07 /
Т.В. Долматович. - Минск, 2011. - 21 с.
18. Madlung, A. Remodeling of DNA methyla-
tion and phenotypic and transcriptional changes in synthetic Arabidopsis allotetraploids / A. Mad-lung, R. Masuelli, B. Watson and others // Plant Physiol., 2002. - P. 733-746.
19. Pontes, O. Chromosomal locus rearrangements are a rapid response to formation of the allotetraploid Arabidopsis suecica genome / O. Pontes, N. Neves, M. Silva and others // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004. - V. 101. -P. 18 240-18 245.
20. Wang, J. Stochastic and epigenetic chandes of gene expression in Arabidopsis poliploids / J. Wang, L. Tian, A. Madlung and others // Genetics, 2004. - №167. - P. 1961-1973.
21. Luciano, G. A comprehensive analysis of gene expression alterations in a new synthesized Paspalum notatum autotetraploid / G. Luciano, A. Juan-Pablo, S. Juliana and others // Plant Sci, 2005. - P. 211-220.
22. Урбан, Э.П. Озимая рожь в Беларуси: селекция, семеноводство, технология возделывания / Э.П. Урбан. - Минск: «Беларуская навука», 2009. - 269 с.
Дата поступления статьи 17 октября 2011 г.
