CC BY
12УДК 575.234.2:633.11+633.14.324
И.А. Гордей1, О.М. Люсиков1, И.С. Гордей1, В.Е. Шимко1, А.В. Вершинин2, Е.В. Евтушенко2,
Ю.А. Липихина2
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ НОВОГО ГЕНОФОНДА РЖИ И РЖАНО-ПШЕНИЧНЫХ АМФИДИПЛОИДОВ
СЕКАЛОТРИТИКУМ
1Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: [email protected] 2Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН Россия, 630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 8/2
Представлены результаты исследований по созданию и молекулярно-генетической характеристике нового генофонда сортов, самофертильных линий и гетерозисных гибридов озимой ржи и их зиготической аутополиплоидизации закисью азота (N2O) в качестве исходного материала для создания нового генофонда ржано-пшеничных амфидиплоидов с цитоплазмой ржи - секалотритикум, результаты сравнительного моле-кулярно-генетического анализа структуры и функциональной активности центромерных районов хромосом их геномов.
Ключевые слова: рожь, пшеница, тритикале, секалотритикум, аллополиплоиды, геном, цитогенетика, мейоз, центромера, центромерный гистон H3 (CENH3), экспрессия генов.
Введение
Синтез секалотритикум является инновационным подходом к проблеме достижения сбалансированной экспрессии генетических систем исходных видов в условиях цитоплазмы ржаного типа, повышения адаптивности, расширения биоразнообразия и обогащения генофонда исходного материала гексаплоид-ных тритикале на основе включения генетического потенциала современных высококачественных сортов тетраплоидной ржи и ее цитоплазматических геномов.
В лаборатории цитогеномики растений Института генетики и цитологии НАН Беларуси проведены исследования по созданию новой формы гетероплазматических тритикале - гек-саплоидных ржано-пшеничных амфидиплои-дов секалотритикум с цитоплазмой ржаного типа (Secalotriticum, S/RRAABB, 2n=6x=42). Нами разработана оригинальная методология синтеза секалотритикум (S/RRAABB, 2n=6x=42) и тетраплоидных форм ржи с ин-трогрессией генетического материала пшеницы (RRRR, 2n=4x=28) на основе утилизации частично нередуцированных 21-хромосомных RAB-гамет ржано-тритикальных пентаплоид-
ных гибридов F1 (S/RRABR\ 5x=35) при бек-кроссе на гексаплоидные тритикале [1] и те-траплоидную рожь [2] соответственно.
Для создания генофонда исходного материала в работе по синтезу секалотритикум использовали современные высокопродуктивные диплоидные сорта, созданные нами перспективные самофертильные линии, а также гибриды диплоидной и новые формы те-траплоидной озимой ржи.
Материалы и методы
Секалотритикум создавали на основе гибридизации тетраплоидной ржи (S/RRRR, 2n = 4х = 28) с гексаплоидными тритикале (T/AAB-BRR, 2n = 6х = 42) с последующим однократным беккроссом ржано-тритикальных гибридов F1 (S/RRABR, 5х = 35) на тритикале (рис. 1).
Тритикале выступали в качестве вида-посредника (bridge species) - источника геномов пшеницы и ингибитора S-РНК-аз ржи, что позволило преодолеть одностороннюю прогамную несовместимость ржи с пшеницей.
Исходные формы тетраплоидной ржи создавали с использованием метода зиготи-ческой аутополиплоидизации (первое деление
S. cereale RRRR 2n = 4x = 28
Рис. 1. Схема создания секалотритикум
зиготы) закисью азота (N20) на материале современных высокопродуктивных сортов, созданных нами гетерозисных гибридов и СФ-линий озимой ржи [3]. Самофертиль-ные линии диплоидной ржи получали на основе скрещиваний перспективных сортов с источником генов самофертильности ^Г). Для выделения самосовместимых мужски стерильных (МС) форм на основе ЦМС Р- и G-типов и самофертильных (СФ) линий проведена идентификация S(1R)-, Z(2R)- и T(5R)-локусов с помощью молекулярных SSR- и STS-маркеров.
Цитологический анализ ключевых этапов микроспорогенеза и определение фертильности пыльцы проводили, соответственно, на давленых препаратах апикальных меристем корня и пыльников, окрашенных 2%-ным раствором ацетокармина в 45%-ной уксусной кислоте. Изучали следующие показатели цитогенетической стабильности генома аллоплоидов: ассоциации хромосом в прометафазе мейоза - униваленты, закрытые (кольцевые) и открытые (линейные) биваленты, мультиваленты; происхождение унивалентов (асинаптические, десинаптические); тип
деления и сегрегации унивалентов (эква-ционное, редукционное); специфичность, уровень и характер нарушений на стадиях мейоза - профаза (диакинез), метафаза I (MI), анафаза I (AI), метафаза II (MII), анафаза II (AII), тетрады микроспор (T); сегрегация и элиминация хромосом.
Молекулярный анализ проводили с выделением тотальной РНК, приготовлением на ее основе кДНК, Real-time PCR-амплификацией со специфическими праймерами для получения последовательностей консервативного и вариабельного доменов CENH3 (центромер-ная модификация гистона Н3 у растений). Клонировали и секвенировали кодирующие последовательности N-концевого участка последовательности гена CENH3 у пшенич-но-ржаных амфиплоидных растений и их родительских форм, так же, как из тетра-плоидной ржи, гексаплоидного тритикале и ржано-пшеничных гибридов, секалотри-тикум. Экспрессию гена CENH3 оценивали методом ПЦР в режиме реального времени, синтез белков in vitro осуществляли с использованием системы от New England Biolabs (США).
Результаты и обсуждение
Исследования по созданию качественно нового генофонда самофертильных форм ржи проводили с целью дальнейшего использования в селекции на гетерозис. Попытки получения инцухт-линий путем принудительного самоопыления популяционных сортов ржи не приводили к желаемым результатам из-за самонесовместимости ржи и сильной инбредной депрессии. Преодолеть барьеры несовместимости удалось путем использования источников самофертильности (СФ), найденных в ряде популяций ржи.
С целью исследования S-локуса самонесовместимости мужски стерильных и само-фертильных линий проведено тестирование SSR-маркеров SCM9, SCM39, разработанных B. Saal и G. Wricke (1999) [4] и маркеров R1-R2, разработанных P. Wehling и др. (1994) [5]. SSR-маркеры SCM9, SCM39 расположены близко к изозимному локусу Perl, который связан с S-локусом (1R) несовместимости ржи. Известно о наличии 5 аллелей для SSR-маркера SCM9. В наших исследованиях SSR-маркер SCM9 детектировал фрагменты 209 п.о. и 220 п.о. Пшеница Кавказ и попу-ляционный сорт ржи Зарница детектировали фрагменты 209 п.о. и 220 п.о. (табл. 1). У большинства МС-линий на основе ЦМС G-типа выявлен фрагмент 220 п.о. МС-линии на основе ЦМС Р-типа характеризовались наличи-
ем фрагментов 209 п.о. и 220 п.о. Показано наличие 2 аллелей SSR-маркера SCM9 у трех СФ-линий (А56, Па74, 476/8).
Известно, что SSR-маркер SCM39 расположен на расстоянии 4-5 сМ от центромеры, имеющей невысокий уровень рекомбинаци-онных процессов. По данным Saal и Wricke (1999) SSR-маркер SCM39 детектировал фрагмент 230 п.о. [4]. В наших исследованиях данного маркера определялись два фрагмента длиной 188 п.о. и 239 п.о. В большинстве исследуемых линий показано наличие фрагмента 239 п.о. и только у двух линий (МС51, О25) выявлен фрагмент размером 188 п.о. Маркерные последовательности SCM39 не определялись в сорте пшеницы Кавказ, поскольку данный маркер находится в прицентромерной области плеча 1RL хромосомы ржи.
Маркеры R1-R2, использованные для идентификации S-локуса несовместимости у ин-бредных линий ржи, детектировали фрагмент размером 280 п.о., полностью коррелирующий с исходными S-генотипами. В наших исследованиях наблюдаемые фрагменты этого маркера варьировали от 167 п.о. до 320 п.о. изучаемых форм (табл. 1). Выявленный полиморфизм анализируемых маркеров подтверждает многоал-лельность S-локуса несовместимости озимой ржи, и связан как с различным генетическим происхождением исследуемых форм, так и с перекрестным способом опыления растений.
Таблица 1
Аллельный состав МС- и СФ-форм по SSR-маркерам, ассоциированным с S-локусом
несовместимости
№ МС/СФ-линии Маркеры
SCM9, п.о. SCM39, п.о. R1-R2, п.о.
МС-линии
1 МС1 220 239 167, 320
2 МС8 220 239 167, 320
3 МС10 220 239 167, 320
4 МС12 220 239 167, 290, 320
5 МС16 209, 220 239 320
6 МС22 220 239 167, 320
7 МС51 209 188 167, 320
8 МС98 220 239 167, 320
9 МС5с 209, 220 239 320
Окончание табл. 1
№ МС/СФ-линии Маркеры
SCM9, п.о. SCM39, п.о. R1-R2, п.о.
СФ-линии
10 Н5 220 239 167, 290, 320
11 Н14 220 239 320
12 О25 220 188 -
13 О27 220 239 320
14 Т40 209 239 167, 290, 320
15 А56 209, 220 239 167, 290, 320
16 Пл71 220 239 290, 320
17 Па74 209, 220 239 167, 290, 320
18 469/3 209 239 320
19 469/8 209, 220 239 320
20 476/8 209 239 320
Контроль
Зарница (рожь) 209, 220 239 167, 320
Кавказ (пшеница) 209, 220 - -
Одним из важных факторов при селекции гибридов F1 является их способность давать стабильную урожайность в изменяющихся условиях окружающей среды. Сравнительный анализ гибридов F полученных с использованием маркированных МС-линий на основе ЦМС Р- и G-типа и СФ-линий озимой ржи, позволил выявить различия гибридных форм по некоторым количественным признакам зерновой продуктивности растений (табл. 2).
Снижение высоты растений отдельных гибридов F1 связано с наличием генов доминантной короткостебельности (Hl/Ddw1) у родительских СФ-линий (Т40, Па74, 469/3). Отмечено
увеличение кустистости на 12% у исследуемых гибридов на основе ЦМС G-типа, что оказывало влияние на общую продуктивность растений. Озерненность колоса у исследуемых гибридов на основе ЦМС G-типа варьировала от 73% до 88%, и зависела от материнского генотипа МС-формы. Установлено, что снижение озерненно-сти на 31% у гибридов F1 на основе ЦМС Р-типа связано с более сложным контролем Р-ЦМС ядерных генов и выраженными нарушениями в митохондриальном геноме. Гибриды F полученные на основе МС-форм G-типа, превышали гибриды на основе ЦМС Р-типа по массе зерна с колоса в среднем в 1,6 раза.
Таблица 2
Характеристика количественных признаков зерновой продуктивности межлинейных
гибридов F1 озимой ржи
Комбинации скрещивания Высота растений, см Кустистость, ст./раст. Озерненность колоса, % Масса Зерновая продуктивность, г/м2
МС-формы СФ-линии Колоса, г 1000 зерен, г
ЦМС в-типа Н5 136 6 83,7 2,3 37,3 768,7
Н14 148 9 74,4 1,5 30,3 383,0
О25 142 11 76,1 1,7 30,5 503,0
О27 140 13 79,5 1,8 33,8 572,3
Окончание табл. 2
Комбинации скрещивания Высота растений, см Кустистость, ст./раст. Озерненность колоса, % Масса Зерновая продуктивность, г/м2
МС-формы СФ-линии Колоса, г 1000 зерен, г
Т40 100 10 74,3 1,9 28,6 436,6
А56 105 8 79,9 1,9 29,5 632,5
ЦМС G-типа Пл71 128 6 73,6 1,8 37,6 563,3
Па74 101 9 88,9 2,3 32,3 649,9
469/3 101 8 81,4 1,9 26,9 514,8
469/8 145 8 87,7 2,3 29,2 510,9
476/8 142 9 84, 3,1 28,5 561,4
Среднее 126,1 ± 5,8 8,8 ± 0,6 80,4 ± 1,6 2,0 ± 0,1 31,3 ± 1,1 560,2 ± 35,1
Н5 140 7 62,3 1,4 33,1 292,3
Н14 140 6 81,5 1,8 31,6 391,0
О25 141 9 47,3 1,4 37,2 111,1
О27 125 5 27,0 0,5 29,2 230,9
ЦМС Р-типа Т40 85 5 58,3 0,9 20,9 310,4
А56 134 6 47,9 1,2 35,5 414,9
Пл71 132 7 74,9 2,0 38,7 628,1
Па74 100 14 71,6 1,6 30,2 218,1
469/3 105 8 57,2 1,3 33,8 180,6
469/8 142 8 51,0 1,2 33,2 355,6
476/8 141 10 29,5 0,8 34,9 396,5
Среднее 126,5 ± 6,1 7,7 ± 0,7 55,3 ± 5,2 1,3 ± 0,1 32,6 ± 1,4 332,6 ± 38,8
Сорт Зарница 128 10 37,9 1,2 47,0 453,1
Масса 1000 зерен составляла в среднем 31,2 г у гибридов F1 на основе форм ЦМС G-типа и 32,6 г - у гибридов F1 на основе ЦМС Р-типа, но не превышала этот показатель у сорта Зарница. Зерновая продуктивность гибридов на основе ЦМС G-типа превышала сорт-контроль у 81% образцов. Установлено, что по признакам зерновой продуктивности показатели большинства исследуемых гибридов F1 на основе ЦМС Р-типа не превышали сорт Зарница. Наиболее стабильной зерновой продуктивностью характеризовались гибриды F полученные на основе скрещиваний МС-форм Р-, G-типов и СФ-линии Пл71, что обусловлено их генетической совместимостью.
Проведенные исследования позволили выявить генотипическую специфичность ядерно-цитоплазматических взаимодействий генетических систем ЦМС (Ms) и самофертильности
(Sf) у озимой ржи при формировании гетеро-зисных гибридов, что будет способствовать целенаправленному созданию высокопродуктивных гетерозисных гибридов. Совместно с РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию» создан первый отечественный гибридный сорт озимой ржи Плиса F
Созданные нами СФ-линии и гибриды, а также современные высокопродуктивные диплоидные сорта использовали для создания нового генофонда тетраплоидной ржи. Дупликацию генома ржи осуществляли с использованием метода зиготической аутопо-липлоидизации (первое деление зиготы) закисью азота (N2O). Выход тетраплоидов составил в среднем 43,5% и до 85,7% в зависимости от генотипической специфичности сорта и гибрида F Метод характеризуется низким уровнем анеуплоидии, не превышающим 10%.
Осуществлен перевод на тетраплоидный уровень лучших современных сортов (Алькора, Юбилейная, Зарница и др.) и гибридов Плиса, F1 Валдай х Каупо) озимой диплоидной ржи [3]. Однако селекционно-генетические эффекты зиготической аутополиплоидизации ржи не исследованы: недостаточно изучена эффективность метода зиготической аутопо-липлоидизации закисью азота (N20); не исследована генотипическая специфичность современных сортов, гибридов F1 и самофертильных (^ линий по реакции на ау-тополиплоидизацию.
Нами проведено молекулярное генотипи-рование диплоидов и тетраплоидов ржи с использованием RAPD-праймеров, которое позволило выявить у них общие и специфические фрагменты ДНК. Получено 82 ампликона (амплифицированных фрагментов ДНК), число которых варьировало от 8 до 15 в зависимости от генотипа и праймера. Их электрофоретическая подвижность составляла от 200 до 3000 п.н., но подавляющее большинство фрагментов находились в пределах 500-1500 п.н. Наиболее высокой долей полиморфных локусов характеризовался праймер Р 36 (83,3%), наименее высокой -RLZ 7 (25,0%). Средняя доля полиморфных ампликонов по всем 7 RAPD-праймерам со-
ставила 45,9%. Количество уникальных ДНК-спектров (Тр) для каждого праймера варьировало от 3 до 8, средний показатель по всем праймерам составил 5,6 спектра/праймер (рис. 2).
Данный набор RAPD-праймеров использовали для определения уровня полиморфизма между диплоидами ржи и созданными на их основе тетраплоидами (табл. 3). Наибольший полиморфизм обнаружен между диплоидом и тетраплоидом Зарница (25,6%), наименьший - между диплоидом и тетраплоидом Плиса (14,0%). Средний уровень полиморфизма между всеми анализируемыми диплоидами и тетраплоидами составил 20,4%. Обнаруженные различия в спектрах амплифицированных фрагментов ДНК диплоидов и тетраплоидов свидетельствуют о структурных изменениях генома ржи при дупликации. На основе те-траплоидного образца Юбилейная совместно с РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию» получен сорт Камея 16, который с 2016 года проходит испытание в ГУ «Государственная инспекция по испытанию и охране сортов растений». Созданные тетраплоиды современных высокопродуктивных сортов и гетерозисных гибридов ржи использовали для синтеза новых форм ржано-пшеничных амфидиплоидов секалотритикум, скрещивая в качестве мате-
3000 2000 1500
1000 750
500 250
М
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Рис. 2. RAPD-спектр амплифицированных фрагментов ДНК растений с использованием праймера ОРА 5 1 - Юбилейная 4х; 2 - Плиса 4х; 3 - Алькора 4х; 4 - Зарница 4х; 5 - Валдай х Каупо 4х; 6 - Юбилейная 2х; 7 -Плиса 2х; 8 - Алькора 2х; 9 - Зарница 2х; 10 - Валдай х Каупо 2х; М - маркер молекулярного веса M1KB DNA
Ladder Plus (Fermentas)
ринской формы с гексаплоидными тритикале. На основе полученных ржано-тритикальных 35-хромосомных гибридов F при цитогене-тическом контроле особенностей мейоза всех гибридных генотипов, получали первичные секалотритикум путем однократного беккрос-са на исходные тритикале.
Следует отметить, что цитогенетические исследования у ржано-тритикальных гибридов F1 с необычным дипло-гаплоидным составом генома ^КЛАВЯ, 5х = 35) наиболее информативны, тогда как специфичность мейоза у диплоидов (полиплоидов) выявляется трудно из-за единообразия гамет по хромосомному составу, а полигаплоиды практически стерильны. Нами показано, что у ржано-трити-кальных гибридов F1 формируется широкий спектр функциональных (жизнеспособных и фертильных) гамет различного хромосомного состава. При этом основным фактором нормализации мейоза и частичной фертильности гибридных растений F1 (а также ржано-пшенич-ных амфиплоидов F1BC1) является наличие базового генома ржи в диплоидном состоянии, а геномно-хромосомный состав их гамет определяется генотипической специфичностью мейоза гибридов F1 различных комбинаций скрещивания в условиях цитоплазмы ржаного типа. Установлено, что генотипическая специфичность взаимодействия систем контроля мейоза пшеницы и ржи (Ph, Sy, Edu и др.)
является основой реализации у ржано-трити-кальных гибридов цитогенетического механизма частичной мейотической нередукции в гаметогенезе с частотой 15-20% (до 35% на комбинацию и до 50% и более на растение в зависимости от генотипа гибрида). При этом имеет место неслучайная сегрегация и формирование гамет с полным набором хромосом Я-, А-, В-геномов (п = 21). Частично нередуцированные ЯАВ-гаметы (чНГ) участвуют в формировании сбалансированного генома секало-тритикум уже в первом поколении возвратного скрещивания ржано-тритикальных гибридов F1 на тритикале (АВЯ-гаметы) [1, 6, 7].
Специфичность мейоза ржано-тритикаль-ных гибридов F1 определяется комплексом ци-тогенетических факторов, которые наследуются и определяют мейотическую стабильность последующих поколений ржано-пшеничных амфиплоидов F1BC1-2 и линий амфидиплоидов секалотритикум:
• происхождение унивалентов - преимущественно поздние униваленты в проме-тафазе в результате десинапсиса бивалентов в условиях цитоплазмы ржаного типа;
• тип полярной ориентации центромер унивалентов - сохранение униполярной ориентации центромер поздних десинап-тических унивалентов;
• тип деления унивалентов - преимущественно редукционное первое мейоти-
Таблица 3
Образец Мономорфных ампликонов, шт. Полиморфных ампликонов, шт. Уровень полиморфизма, %
Алькора 2х 49 11 22,4
Алькора 4х
Плиса 2х 50 7 14,0
Плиса 4х
Зарница 2х 43 11 25,6
Зарница 4х
Юбилейная 2х 49 8 16,3
Юбилейная 4х
Валдай х Каупо 2х 46 11 23,9
Валдай х Каупо 4х
Сравнительная характеристика тетраплоидов и диплоидов по полиморфизму ДНК с использованием набора из 7 RAPD-праймеров
ческое деление десинаптических уни-валентов в условиях генотипически специфичного взаимодействия генетических систем контроля мейоза пшеницы и ржи (Ph, Sy, Edu);
• особенности сегрегации и элиминации хромосом - эквационное второе деление мейоза и регулярная полярная сегрегация хромосом.
Указанные факторы частичной фертильно-сти ржано-тритикальных гибридов Fj реализуются на основе ненарушенных цитогенети-ческих и регуляторных механизмов мейоза. В итоге для секалотритикум характерна высокая динамика мейотической стабилизации генома: уже в F5-7 (15,2-16,7% аномальных мейоцитов в среднем) - на уровне исходных форм гексаплоидных тритикале (~14,6-15,3%) и тетраплоидной ржи (~12,9%) и завершающаяся в F7-9 (менее 9,4% аномальных мейоцитов в среднем).
Формы секалотритикум, созданые на основе частично нередуцированных 21-хромосомных RAB-гамет ржано-тритикальных гибридов F наследуют от них генотипически обусловленный характер взаимодействия систем контроля мейоза исходных видов, от которых зависят динамика стабилизации и мейотическая стабильность генома. С использованием данной методологии на основе высокоурожайных сортов ржи и тритикале созданы и переданы в селекционный процесс в лабораторию тритикале НПЦ НАН Беларуси по земледелию уникальные линии секалотритикум. В настоящее время создан генофонд и проведена селекционно-генетическая оценка более 50 образцов секалотритикум. Созданные стабильные сека-лотритикум по продуктивности сравнимы или превосходят исходные тритикале, характеризуются сравнительно более широким диапазоном изменчивости и по некоторым признакам морфотипа более близки ко ржи. Линии идентифицировали с использованием дифференциального окрашивания хромосом (C-бэндинг) и рестрикционного анализа видоспецифических последовательностей цитоплазматической ДНК хлоропластов и митохондрий. Генофонд исходного материала ржи, тритикале и созданные формы секалотритикум маркировали по аллельному составу хозяйственно ценных генов короткостебельности (Hl/Ddw1 - у ржи,
Rht-B1 - у тритикале и секалотритикум) и устойчивости к предуборочному прорастанию зерна (Vp1B).
В результате проведенных цитогенетических исследований экспериментально обосновано, что подавляющее большинство цитологических нарушений в мейозе отдаленных гибридов связано с центромерой - участком хромосом, отвечающим за точное распределение хромосом во время клеточного деления. Специфичность мейоза у отдаленных гибридов в значительной степени определяется мейоти-ческим поведением и структурно-функциональной организацией центромер родительских хромосом и связанных с ними структур (кинетохоры, клеточные центры) в гибридном полигеноме.
Совместно с лабораторией молекулярной генетики Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН начаты исследования молекулярной структуры и функциональной активности центромерных районов хромосом основных зерновых культур России и Беларуси - пшеницы, ржи и их гибридов, включая ржано-тритикальные амфиплоиды и стабильные линии гетероплазматических гексапло-идных тритикале и секалотритикум. Установление видо- и генотипически специфичных факторов и возможных механизмов взаимосвязи уровня цитогенетической стабильности и продуктивности гетероплазматических тритикале со структурно-функциональным состоянием центромер их хромосом, имеющих различное родительское происхождение, имеет фундаментальное значение для целенаправленного синтеза продуктивных гибридов.
С молекулярной точки зрения центромера представляет собой многокомпонентный комплекс, состоящий из разнообразных классов последовательностей ДНК и белков. Если цен-тромерная ДНК показывает вариабельность между видами и даже между хромосомами одного кариотипа, то многие центромерные белки консервативны [8]. Среди таких белков, согласно исследованиям последнего десятилетия, особое место отводится центромерной модификации гистона Н3, у растений обозначаемой как СЕМНЗ. Это особое положение обусловлено тем, что на молекулярном уровне наиболее специализированной, универсальной характеристикой активной центромеры явля-
ется присутствие CENH3 вместо канонического гистона Н3 в нуклеосомах центромерного хроматина. CENH3 можно рассматривать как эпигенетическую «метку» центромеры [9]. В случае его потери не происходит формирования кинетохора и правильного расхождения хромосом в ходе деления клеток.
Белок CENH3, подобно каноническому гистону Н3, состоит из двух доменов: консервативного, С-терминального (или HFD, histone-fold domain) и N-терминального, вариабельного. Нуклеотидные последовательности HFD CENH3 и канонического гистона показывают высокую степень подобия. Значительные отличия отмечены в N-терминальном домене, как по нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей домен, так и по размеру домена [10]. Столь же существенны и межвидовые различия в структуре данного домена. В составе консервативного домена находится район, ответственный за хромосомную локализацию центромеры - centromere targeting domain (CATD) [11]. CENH3 необходим для правильного формирования кинетохора в активной центромере - белковой структуры, к которой прикрепляется веретено деления [12]. Любая ошибка в транскрипции генов, кодирующих CENH3, трансляции, модификации или транспорте молекулы может повлиять на процесс сборки интактного центромерного хроматина, следствием чего будет потеря CENH3 из центромер и, соответственно, потеря идентичности центромер. В отличии от канонического гистона Н3, CENH3 проявляет способность к быстрой адаптивной эволюции у некоторых видов [13]. Свойства аминокислотной последовательности белка CENH3 отличают его от канонических гистонов Н3. Канонические ги-стоны Н3 из различных видов высококонсервативны. Гистоны CENH3 высоко дивергиро-ваны, особенно в их N-терминальных доменах (N-terminal tail, NTT), которые не поддаются выравниванию из различных видов.
В последние годы накапливаются данные, указывающие, что CENH3 является одним из важнейших регуляторов взаимодействия двух различных родительских наборов хромосом в ядре, возникающем при межвидовой, межродовой (отдаленной) гибридизации. Как известно, одной из основных проблем отдаленной гибридизации является элиминация хромосом одного
из родительских видов, наблюдаемая даже после успешного оплодотворения и объединения двух геномов в гибридной клетке. Получение, размножение и поддержание таких гибридов, а также замещенных и дополненных линий часто затруднительно вследствие невозможности прохождения у них нормального мейоза. Получены экспериментальные подтверждения, что процесс элиминации хромосом у межвидовых гибридов ячменя H. vulgare х H. bulbosum сопровождается потерей CENH3 белков [14]. Молекулярные исследования показали, что элиминация последовательностей ДНК из генома ржи или потеря экспрессии генов ржи характерны для тритикале [15]. Приведенные данные указывают на важную функциональную роль гистона CENH3, в связи с чем исследование первичной структуры CENH3 у пшеницы, ржи и их аллополиплоидных гибридов, в частности, у секалотритикум с цитоплазмой ржаного типа, наследуемой от материнской формы ржи (Secale cereale L), представляет большой научный и практический интерес.
В настоящее время нами отработана методология комплексного молекулярно-генети-ческого анализа структуры консервативного и вариабельного доменов центромерного гистона H3/CENH3 и видоспецифичной ин-трон-экзонной структуры кодирующих их генов, транскрипционного профиля вариантов CENH3 и специфичности уровня межвидового кросс-включения молекул CENH3 в состав центромер хромосом у родительских форм и гибридов [16].
В табл. 4 и 5 представлены результаты сравнительного анализа экспрессии N-терминальной части гена CENH3 у тритикале различного происхождения и плоидности и их родительских форм.
N-терминальный участок aScCENH3 последовательности имеет длину 213 п.о. Сек-венирование случайно отобранных клонов из пшеницы и ржи показало 99% идентичности между CENH3 на нуклеотидном уровне. Но практически идентичные CENH3 ржи и пшеницы имеют специфические позиции. У пшеницы основные такие замещения расположены на позициях 82 и 84. Внутри открытой рамки считывания CENH3 ржи были идентифицированы четыре специфические замены (28, 73, 122 и 145 п.о.), эти замены несинонимичны.
Таблица 4
Распределение специфичных несинонимических по позициям открытой рамки считывания К-терминального конца СЕКНЗ у пшеницы (_), диплоидной ржи (^
и октоплоидного тритикале
Растение Число клонов Количество форм CENH3 с SNP на следующих позициях ORF, %
28 32 50 56 73 82 84 88 99 122 130 145 176 182 188
Мягкая пшеница Triple Dirk D (AABBDD, 2n = 42) 18 11,1 5,6 55,6 55,6 27,8
Диплоидная рожь Короткостебельная 69 (RR 2n = 14) 23 8,7 7,4 7,4 30,4 21,7 4,3 8,7
Октоплоидное тритикале S3:
Растение 1 (2n = 56) 18 5,6 5,6 16,7 5,6 5,6 11,1 5,6 5,6
Растение 2 (2n = 52) 6 16,7 16,7 16,7 33,3 16,7
Растение 3 (2n = 54) 10 30 10 10
Октоплоидное тритикале S4 (полученное из S3 растения 1):
Растение 1 (2n = 56) 20 5 5 35 10 10 10 15 5 10
Растение 2 (2n = 56) 20 10 5 30 10 10 10 20
Растение 3 (2n = 49) 15 6,7 33,3 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7
Октоплоидное тритикале S5 (полученное из S4 растения 2):
Растение 1 (2n = 56) 14 7,1 50 7,1
Таблица 5
Распределение специфичных несинонимических SNP по позициям открытой рамки считывания N-терминального конца CENH3 у тетраплоидной ржи, тритикале, секалотритикум и пентаплоидных гибридов
Растение Число клонов Число форм CENH3 с заменами на позициях ORF, % от общего количества секвенированных клонов
28 32 38 56 73 82 84 88 99 122 130 145 193 198
Тетраплоидная рожь Верасень (S/RRRR, 2n = 28) 15 6,7 73,3 6,7 6,7
Гексаплоидное тритикале Мiхась (T/AABBRR, 2n = 42) 13 7,7 7,7 15,4 15,4 15,4 7,7
Секалотритикум F12 STr1 (S/RRAABB, 2n = 42) 16 93,8 6,3
Секалотритикум F12 STr2 (S/RRAABB, 2n = 42) 12 8,3 50 8,3
Секалотритикум F12 STr3 (S/RRAABB, 2n = 42) 15 6,7 53,3 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7
Ржано-тритикальный гибрид Fj Фламинго x Балтика (S/RRABR, 5x = 35) 8 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 25 37,5 12,5
Окончание табл. 5
Растение Число клонов Число форм CENH3 с заменами на позициях ORF, % от общего количества секвенированных клонов
28 32 38 56 73 82 84 88 99 122 130 145 193 198
Ржано-тритикальный гибрид Fj Фламинго х Вольтарио (S/RRABR, 5x = 35) 5 20 20 20 60
Типично пшеничные замены на позициях 82 и 84 присутствуют у родительской формы ржи Короткостебельная 69, это может быть связано с высокой гетерогенностью этого сорта, эта замена очень редко встречается у СЕИНЗ ржи.
Наблюдали, что в пшенично-ржаных ам-фиплоидах присутствуют все нуклеотидные замены, специфические для родительской формы ржи, несмотря на наличие материнской цитоплазмы пшеницы, а это значит, что синтез СЕИНЗ белка ржи идет в цитоплазме пшеницы.
Распределение ржаных и пшеничных специфичных БЫР в последовательностях СЕИНЗ из растений тетраплоидной ржи и секалотритикум указывает на предпочтительный синтез копий И-концевых последовательностей СЕИНЗ, характерных для ржи, хотя экспрессия отдельных форм может варьировать у разных растений.
Особый интерес представляет специфичное для ржаных последовательностей замещение в позиции 73 нуклеотидной последовательности аСЕИНЗ, отсутствующей у родительского сорта пшеницы. У стабильных пшенично-ржаных амфидиплоидов, как правило, происходило накопление этой мутации. А у гибридных растений с цитоплазмой ржаного типа мы наблюдаем существенные изменения в представленности этой мутации. В результате этой замены протеин СЕИНЗ теряет единственный предсказанный для И-концевого домена ржи сайт фосфорили-рования серина. Накопление этой замены наблюдается как у стабильных 56-хромосомных растений тритикале, так и у секалотритикум.
Из двух вариантов пентаплоидных гибридов первый является более фертильным. Возможно, именно отсутствие пострансляционной модификации СЕИНЗ, уменьшая разнообразие форм СЕИНЗ, способствует прохождению мейоза в условиях сложного гибридного генома.
Таким образом, в результате комплексного молекулярно-генетического анализа структуры консервативного и вариабельного доменов центромерного гистона H3/CENH3 и видоспе-цифичной интрон-экзонной структуры кодирующих их генов у секалотритикум не были обнаружены копии NTT CENH3 с делециями. В полных последовательностях выявлены две специфические для ржи нуклеотидные замены, частота встречаемости которых значительно превышает таковую у гексаплоид-ного тритикале сорта Мiхась, что указывает на предпочтительный синтез полных копий NTT CENH3, характерных для родительской формы ржи, в геноме секалотритикум (рис. 3).
Заключение
В результате проведенных исследований выявлен полиморфизм, подтверждающий много-аллельность S- и Z-локусов несовместимости озимой ржи. Сравнительный анализ гибридов F полученных с использованием МС-линий ЦМС Р- и G-типов и СФ-линий показал снижение озерненности (на 31%) у гибридов Fj на основе ЦМС Р-типа, что связано с более сложным контролем Р-ЦМС ядерных генов и нарушениями в митохондриальном геноме. Выявлена генотипическая специфичность ядерно-цитоплазматических взаимодействий генетических систем ЦМС (Ms) и самофертильности (Sf) у озимой ржи при формировании гетерозисных гибридов.
Созданные СФ-линии и гибриды, наряду с современными высокопродуктивными сортами диплоидной ржи, после дупликации генома с использованием высокоэффективного метода зиготической (первое деление зиготы) аутополиплоидизации закисью азота (N2O) (выход тетраплоидов от 43,5% в среднем и до 85,7% в зависимости от генотипической специфичности сорта при уровне анеуплоидии, не
Plants
Triple Dirk D (wheat) Triple Dirk D (wheat) K69 (diploid rye, 2n=14) K69 (diploid rye, 2n-14) K69 (diploid rye, 2n=14) Octoploid triticale (2n=56) Octopioid triticale (2n-56) Octoploid triticale (2rt-56) Octoploid triticale (2n=56) Octoploid triticale (2n=56) Verasen' (tetraploid rye, 2n=28) Verasen' (tetraploid rye, 2rr=28) Mikhas' (hexap/oid triticale, 2n=42) Mikhas' (hexapioid triticale. 2n-42) Secalotriticum (2n=42) Secalotriticum (2n=42) Rye-triticale F1 hybrid (5x=35) Rye-triticale F1 hybrid (5x=35) Rye-triticale hybrid (5x=35)
Arginine 10
10
20
|Threonine^8] i 30
/IARTKH /IARTKH yiARTKH dARTKH /IARTKH /IARTKH MRTKH MRTKH /IARTKH MRTKH MRTKH MRTKH yiARTKH /IARTKH /lARTKH MRTKH IARTKH /IARTKH /IARTKH
PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVGKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP PAVRKTKVP
Mdiiiiic
4oj
Alanine 49
50
60
PKKK LGT RPSGGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQP KQRKPHRF PKKK LGT RPSGGAQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQP KQRKPHR F PKKKLGTRPSGGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPPBGTQRRQETDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGTQRRQETDGAGTSATPRRAGRTAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPPBGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGTQRRQETDGAGTSATPRRAGRTAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGAQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKK LGT R PSGGTQR RQETDGAGTSAT P RRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGTQRRQDTDGAGTSVTPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPPBGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGTQRRQDTDGAGTSATPGRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKK LGT RPSGGTQR RQETDGAGTSAT P R RAGRTAAPGAAEGATGQP KQRKPH R F PKKKLGTRPSGGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPPSGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGAQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPPBGTQRRQDTDGAGTSATPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF PKKKLGTRPSGGTQRRQDTDGAGTSVTPRRAGRAAAPGAAEGATGQPKQRKPHRF
position 73 / \ position 82*84 \ position 122+123 It розМопНбИ ^_ \ ■
CCCTCSS CCCCCGS
У \
GGGACGC GGGGCT С
. 120
CGGCGA CGGTTA
14SL
GGCGGGCG GGCGGACG
Рис. 3. Протеиновые замены в ^терминальной части центромерного белка CENH3 у гексаплоидной пшеницы, диплоидной и тетраплоидной ржи, октоплоидных тритикале, гексаплоидных секалотритикум и пентаплоидных
ржано-тритикальных гибридов F1
превышающем 10%), являются качественным материалом для создания нового генофонда секалотритикум.
Генезис полиплоидных форм сопровождается различными генетическими и эпигенетическими изменениями, которые свидетельствуют о структурно-функциональных изменениях генома у полиплоидов и возможности создания исходного материала для селекции с разнообразным сочетанием хозяйственно-ценных признаков и свойств.
Проведенные исследования показали, что линии секалотритикум наследуют от исходных генотипов ржано-тритикальных гибридов Fj цитогенетические особенности взаимодействия систем контроля мейо-за исходных видов и стабильности генома. Поэтому рекомбинационная селекция сека-лотритикум на продуктивность, по хозяйственно ценным признакам и показателям ООС (тест на отличимость, однородность, стабильность) наиболее эффективна в рамках подвида (ssp. Secalotricum Rozenst. et Mittelst., син. Secalotriticum), а скрещивания с тритикале приводят к снижению мейоти-ческой стабильности. Следовательно, селекция гексаплоидных ржано-пшеничных амфидиплоидов с цитоплазмой ржи должна развиваться в рамках самостоятельного направления. Секалотритикум могут выступать
новым источником стабильности генома в рекомбинационной селекции классических тритикале.
В результате сравнительного молекулярно-генетического анализа структуры и функциональной активности центромерных районов хромосом отмечены различия в молекулярной структуре N-терминального домена белка CENH3 у пшеницы и ржи, но они невелики. У гибридов происходит экспрессия обоих родительских форм CENH3. При этом существуют характерные различия в молекулярной структуре NTT CENH3 у мейо-тически стабильных и нестабильных гибридных форм. Окончательные выводы о том, какую роль играет молекулярная структура CENH3 в поддержании стабильности гибридных комбинаций ржи и пшеницы, делать рано. Неясно, происходит ли встройка всех экспрессируемых вариантов CENH3 в центромеры хромосом гибридов, хотя их участие в формировании новых гибридных геномов несомненно. Полученные экспериментальные результаты в изучении важнейших механизмов формирования гибридных растительных геномов являются обоснованием необходимости продолжения и углубления начатых совместных молекулярно-цитогенетических исследований.
Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке гранта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований №Б15СО-022, Российской программой фундаментальных научных исследований (проект 0310-2016-0005) и гранта Российского фонда фундаментальных исследований №17-04-00748a.
Список использованных источников
1. Гордей, И.А. Секалотритикум (*Seca-lotriticum): генетические основы создания и формирования генома / И.А. Гордей, Н.Б. Белько, О.М. Люсиков. - Минск: Беларуская навука, 2011. - 214 с.
2. Способ получения формы ржи с интрогрессией генетического материала пшеницы: пат. 20798 Респ. Беларусь, МПК А 01Н 1/00 / Н.Б. Белько, И.А. Гордей, И.С. Гордей // Афщыйны бюл. / Нац. цэнтр штэлектуал. Уласнасщ. - 2017. - № 1. - С. 48.
3. Гордей, И.С. Создание тетраплоидов ржи (S. cereale L., 4x=28) путем дупликации генома в зиготе / И.С. Гордей // Вести Национальной академии наук. Конференция «Молодежь в науке - 2013», 19-22 ноября 2013 г, Минск: Беларуская навука, 2014. - С. 39-42.
4. Saal, B. Development of simple sequence repeat markers in rye (Secale cereale L.) / B. Saal, G. Wricke // Genome. - 1999. -Vol. 42. - P. 964-972.
5. Wehling, P. Phosphorylation of pollen proteins in relation to self-incompatibility in rye (Secale cereale L.) / P. Wehling, B. Hackauf, G. Wricke // Sex. Plant Reprod. - 1994. -Vol. 7. - P. 67-75.
6. Люсиков, О.М. Анализ мейотической стабилизации генома ржано-пшеничных амфидиплоидов (xSecalotriticum, S/RRAABB, 2n=42) / О.М. Люсиков, И.А. Гордей // Генетика. - 2014. - Т. 50, № 7. - С. 794-801.
7. Люсиков, О.М. Цитогенетическая
стабилизация генома секалотритикум (xTriticosecale derzhavinii secalotriti-cum Rozenst., et Mittelst., S/RRAABB, 2n = 42) / О.М. Люсиков, И.А. Гордей // Цитология и генетика. - 2015. - Т. 49, № 2. - С. 48-55.
8. Building the centromere: from foundation proteins to 3D organization / D.J. Amor [et al.] // Trends Cell Biol. -2014. - Vol. 14. - P. 359-368.
9. Allshire, R.C. Epigenetic regulation of centromeric chromatin: old dogs, new tricks? / R.C. Allshire, G.H. Karpen // Nat Rev Genet. -2008. - Vol. 9. - P. 923-937.
10. Talbert, P.B. Evolution of centromeres and kinetochores: A two-part fugue / P.B. Talbert, J.J. Bayes, S. Henikoff // Kinetochore. - Berlin: Springer, 2008. - P. 1-37.
11. Loading of Arabidopsis centromeric his-tone CENH3 occurs mainly during G2 and requires the presence of the histone fold domain / I. Lermontova [et al.] // The Plant Cell. - 2006. -Vol. 18. - P. 2443-2451.
12. Henikoff, S. The centromere paradox: Stable inheritance with rapidly evolving DNA // S. Henikoff, K. Ahmad, H.S. Malik // Science. -2001. - Vol. 293. - P. 1098-1102.
13. Malik, H.S. Major evolutionary transitions in centromere complexity / H.S. Malik, S. Henikoff // Cell. - 2009. - Vol. 138. - P. 10671082.
14. Loss of centromeric histone H3 (CENH3) from centromeres precedes uniparental chromosome elimination in interspecific barley hybrids / M. Sanei [et al.] // PNAS. -2011. Vol. 108. -P. 498-505.
15. Identification and characterization of rye genes not expressed in allohexaploid triticale / H.B. Khalil [et al.] // BMC Genomics. - 2015. -Vol. 16. - P. 281-291.
16. Проявление активности гена центро-мерного гистона H3 у аллополиплоидных гибридов пшеницы и ржи / Ю.А. Липихина [и др.] // Цитология. - 2016. - Т. 58. № 4. -С. 324-329.
I.A. Gordei1, O.M. Lyusikov1, I.S. Gordei1, V.E. Shimko1, A.V. Vershinin2, E.V. Evtushenko2,
Yu.A. Lipikhina2
MOLECULAR GENETIC BASIS FOR THE DEVELOPMENT OF THE NEW GENE POOL OF RYE AND WHEAT-RYE AMPHIDIPLOIDS OF SECALOTRITICUM
institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus
Minsk BY-220072, the Republic of Belarus 2Institute of Molecular and Cellular Biology SB RAS Novosibirsk, 630090, Russia
The research results on the development and molecular genetic characteristics of the new gene pool of cultivars, self-fertile lines and heterotic winter-rye hybrids and their zygotic autopolyploidization with nitrous oxide (N2O) as a starting material for the development of the new gene pool of wheat-rye amphidiploids with rye cytoplasm - Secalo-triticum, the results of the comparative molecular genetic analysis of the structure and functional activity of the chromosome centromeric regions of their genomes are presented.
Key words: rye, wheat, triticale, Secalotriticum, allopolyploids, genome, cytogenetics, meiosis, centromere, centromere histone H3 (CENH3), gene expression.
Дата поступления статьи: 23 августа 2017 г.
