CC BY
9УДК 631.528.2:633.14.324
Н.Б. Белько1, И.С. Гордей1, И.А.Гордей1, Э.П.Урбан2
ДУПЛИКАЦИЯ ГЕНОМА ОЗИМОЙ РжИ (SECALE CEREALE L.) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЗАКИСИ АЗОТА (N2O)
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию», Республика Беларусь, 222160, г. Жодино, ул. Тимирязева, 1
Дупликация генома (полиплоидизация) и отдельных генов является основным источником новых генов (аллелей) и важнейшим фактором эволюции генома. Дупликация генома - больше, чем простое удвоение числа хромосом в геноме, она включает комплекс молекулярно-генетических процессов, ведущих к геномным перестройкам.
Интерес к изучению проблем, связанных с полиплоидией резко возрос начиная с 2000 года [1]. На основании анализа данных, полученных в результате секвенирования геномов, представления о роли полиплоидии в эволюции претерпели существенные изменения. Поли-плоидизация наряду с сегментной дупликацией хромосом рассматривается в настоящее время в качестве основного фактора в эволюции генома высших растений и некоторых позвоночных животных [2, 3]. Доля цветковых растений, претерпевших полиплоидизацию в процессе эволюционного развития, составляет более 50% [4], также он повторялся в филогенезе многих растений [5-7]. Установлено, что полиплоидия имела место в течение ранней эволюционной истории всех эукариот, а виды, ранее считавшиеся диплоидными, являются древними полиплоидами (палеополиплоидами), возникшими в результате дупликации геномов [8, 9]. Особенно часто полиплоидные роды и виды встречаются в ботанических семействах гречишных, толстян-ковых, розоцветных, мальвовых и злаковых.
Для генетики и селекции растений экспериментальная полиплоидия важна в решении следующих проблем:
• повышение продуктивности и адаптивности растений;
• расширение генетического разнообразия;
• индуцирование самосовместимости у самонесовместимых видов;
• преодоление межвидовой и межродовой нескрещиваемости;
• восстановление плодовитости у межвидовых и межродовых гибридов;
• закрепление гетерозиса;
• выявление происхождения и ресинтеза видов для создания более совершенных сортов.
В существующей в настоящее время структуре посевных площадей тетраплоидная рожь в Республике Беларусь занимает 430,0 тыс. га, что составляет 65% [10]. Однако следует признать, что практические результаты по применению полиплоидии в селекции озимой ржи значительно ниже ожидаемых и ее потенциальные возможности еще не раскрыты, по сравнению с результатом, достигнутым природой в эволюции растений.
Использование широко известного алколои-да колхицина (С22Н2506) для получения тетра-плоидных форм ржи оказалось сравнительно низкоэффективным. Выход тетраплоидов при обработке растений ржи колхицином составлял в среднем 0,5-4,0% [11-13]. У ржи перевод единичных растений на тетраплоидный уровень недостаточен. Биологические особенности культуры в связи с перекрестным способом опыления требуют массового получения тетраплоидных растений, что позволяет сохранить гетерозиготность исходных популяций [10]. Кроме того, колхицин угнетает растения и обладает мутагенными свойствами, что значительно снижает результативность метода и ценность полученных полиплоидов [14, 15].
Полиплоидия - важнейший источник генетической изменчивости и должна шире использоваться для создания исходного материала и селекции новых сортов. По мнению многих исследователей, задачу по созданию устойчивых к полеганию сортов ржи легче решить на
тетраплоидном уровне, поскольку данные формы имеют более прочный и несколько укороченный по сравнению с диплоидами стебель. с помощью полиплоидии можно избавиться от мелкозерности, которая коррелирует с корот-костебельностью на диплоидном уровне [16].
Полиплоиды также представляют значительный интерес в плане использования у озимой ржи гетерозиса. Они позволяют закрепить его на более продолжительное, чем у диплоидов время [17, 18]. Замедление падения гетерозиса у тетраплоидов связано с более продолжительным выщеплением гомозигот во втором и последующих поколениях [18], а также полиаллель-
ными взаимодействиями генов, в результате чего в отличие от диплоидов максимальным гетерозисом обладают двойные гибриды [19, 20].
Создание новых тетраплоидных форм озимой ржи на генетической основе современных диплоидных сортов и гибридов существенно расширит генофонд культуры, а молекулярно-цитогенетическое исследование созданных тетраплоидов с использованием современных методов анализа чрезвычайно важно в связи с функционированием полиплоидного генома, выявлением эффектов дупликации генома, и рациональным использованием созданного исходного материала в практической селекции.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили новые диплоидные сорта и гибриды (ЯЛ, 2х = 14) и созданные на их основе тетраплоидные формы (ЛЯЛЯ, 4х = 28) озимой ржи (Беса1е cerealе L.). Тетраплоиды ржи получали с использованием в качестве полиплоидизирующего реагента закиси (оксида) азота (N20), химически инертного газа в нормальных условиях [21]. Цитологический анализ числа хромосом, ключевых этапов микроспорогенеза и определение фертильно-сти пыльцы проводили на давленых препаратах апикальных меристем корня и пыльниках, окрашенных 2%-ным раствором ацетокармина в 45%-ной уксусной кислоте. Анализ хромосомного состава ди- и тетраплоидных форм
проводили с применением модифицированного С-метода дифференциального окрашивания хромосом ржи (С-бэндинг) [22]. Электрофорез запасных белков семян (секалинов) проводили в полиакриламидном геле в вертикальных пластинах электрофоретической камеры «VE-4M», производства ООО «Биоклон» по методическим указаниям ВИР [23]. Специфичность геномов диплоидной и тетраплоидной озимой ржи на уровне ДНК устанавливали ПЦР-анализом с произвольными праймерами (RAPD-анализ). ДНК выделяли с помощью Genomic DNA Purification Kit (Fermentas). В качестве маркера молекулярного веса использовали 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas) [24].
Результаты и обсуждение
Нами усовершенствован метод и разработаны методические рекомендации по полиплоидизации генома ржи с использованием закиси азота (N20) применительно к современным сортам и гибридам диплоидной озимой ржи [25]. Схема создания те-траплоидов ржи (ЯЯЯЯ, 4х = 28) и параметры обработки диплоидных растений закисью азота приведены на рис. 1. В табл. 1 представлены данные по результативности данного метода полиплоиди-зации растений. Так, завязываемость зерен у обработанных закисью азота растений ржи варьировала от 11,1 до 52,3% и составляла в среднем 23,9%.
Зерна сравнительно мелкие (14,5-27,8 г) и характеризуются пониженной жизнеспособностью. Всхожесть их варьировала от 8,4 до 75,0% и зависела от сорта или гибрида диплоидной ржи.
Сравнительно низкая фертильность цветков при искусственном опылении и обработке рас-
тений азота закисью может быть обусловлена следующими факторами:
• повреждением завязей при механической кастрации цветков;
• часть цветков может быть не опылена в результате искусственного опыления;
• гибелью зигот в атмосфере азота закиси под давлением.
Основной причиной пониженной массы 1000 зерен и сравнительно низкой жизнеспособности семян является физиологическая незрелость образовавшихся зерновок вследствие нарушения питания из-за пересадки растений при обработке закисью азота. Сортовые различия по всхожести семян обусловлены ге-нотипической специфичностью сортов формировать жизнеспособные зерновки после воздействия на растения закиси азота.
Рис. 1. Схема создания тетраплоидных форм озимой ржи (RRRR, 4х = 28) с использованием закиси азота (^О)
Диплоидная рожь
2х = 14)
- Подбор перспективных диплоидных сортов
и гибридов F1;
- контролируемые скрещивания.
Факторы, определяющие эффективность:
- давление в камере (6 атм.);
- временной интервал от опыления растений до обработки 1Ч20 (17-19 часов);
- продолжительность экспозиции растений в атмосфере 1Ч20 (24 часа).
Кариотипы потомства
ч4х = 28/
- Цитологический анализ;
- выделение тетраплоидов.
- Селекционно-генетическое изучение; -формирование популяций;
- включение
в селекционный процесс.
Анализ числа хромосом у проростков показал, что доля тетраплоидов варьировала от 3,9 до 85,7% в зависимости от сорта и продолжительности периода «от опыления пыльцой колосьев растений до начала обработки их закисью азота» (табл. 1). Так, у гибрида F1 Плиса получено 85,7% полиплоидных проростков после обработки растений закисью азота спустя 17 часов после опыления их колосьев. С увеличением продолжительности этого периода до 19 часов, выход тетраплоидных проростков снизился до 27,5%, т.е. больше чем в 3 раза. В то же время обработка закисью азота растений сорта Юбилейная спустя 17 часов после опыления позволила получить лишь 19,7% тетраплоидов. С увеличением продолжительности этого периода до 19 часов доля те-
траплоидов у сорта Юбилейная повысилась до 23,1%. Установлено [25, 29], что первое митотическое деление зиготы у озимой ржи в зависимости от сорта наступает через 1719 часов после опыления.
Использование закиси азота в качестве вещества, удваивающего число хромосом, основано на ингибировании формирования веретена первого деления зиготы в митозе. При проникновении в клетку закиси азота веретено деления не формируется, вследствие чего в первом митотическом делении зиготы не происходит расхождение хромосом. Показано, что закись азота влияет на белки, активирующие или репрессирующие гены митоза [26]. Причем это влияние осуществляется не только на уровне транскрипции, но и на уровне трансляции, т.е. на уровне рибосом.
Таблица 1
Эффективность полиплоидизации растений диплоидных сортов озимой ржи
закисью азота (N2O)
Диплоидная рожь Время экспозиции, ч Завязываемость зерен,% Масса 1000 семян, г Bсхожесть, % Выход тетраплоидых проростков, %
Алькора 17,5 23,7 27,2 57,9 3,9
18 22,3 26,3 51,8 34,0
Заречанская зеленоукосная 17 18,0 14,5 42,9 15,7
Юбилейная 17 14,4 21,4 44,6 19,7
19 15,1 20,8 29,5 23,1
Зарница 17 52,3 20,5 48,1 83,7
Диамант 17,5 18,6 26,2 29,4 48,9
F1 Плиса 17 31,7 27,8 42,0 85,7
17,5 26,4 26,8 50,6 52,4
19 28,1 26,0 75,0 27,5
Fl Валдай х Каупо 16 11,1 20,3 20,8 43,7
DC-2 17,5 21,5 13,2 8,4 82,5
Среднее 23,6 22,6 41,8 43,4
Закись азота может подавлять ферменты, ответственные за синтез ДНК. Сорта ржи существенно различаются по продолжительности периода покоя зиготы. Исходя из полученных данных, у одних сортов диплоидной ржи первое митотическое деление зиготы происходит через 17 часов после оплодотворения, у других продолжительность этого периода достигает 24 часов. Поэтому различия у сортов ржи по эффективности полиплоидизации растений закисью азота обусловлены определением времени «от опыления цветков до начала деления зигот», что является определяющим фактором эффективности удвоения числа хромосом. На эффективность данного метода может оказывать влияние генотипическая специфичность сортов
ржи сохранять жизнеспособность зигот в закиси азота, а также их способность к удвоению числа хромосом в первом делении зигот.
Проведено изучение мейоза, хромосомного состава потомства и фертильности созданных тетраплоидных форм ржи.
Нарушения мейоза, наблюдаемые в материнских клетках микроспор в первом и втором мейотических делениях у тетраплоидов и диплоидов ржи, аналогичны. Однако у тетра-плоидов мейоз протекал с большими нарушениями (табл. 2). Среди хромосомных ассоциаций преобладали биваленты, со значительной частотой встречались уни-, три- и квадрива-ленты, число которых на клетку варьировало.
Таблица 2
Частота нарушений по стадиям мейоза у тетраплоидных форм и исходных
диплоидных сортов ржи, %
Сорта и формы Метафаза I Анафаза I Метафаза II Анафаза II Тетрады
Тетраплоидные формы (КЯКЯ, 2п = 28)
Плиса-тетра 10,4 5,8 26,9 24,6 18,3
Юбилейная-тетра 7,9 8,5 13,1 15,0 8,3
Зарница-тетра 11,8 9,0 23,4 23,4 20,7
Алькора-тетра 19,2 16,7 32,8 21,2 13,3
Среднее 11,7* 9,9* 22,2* 19,1* 14,0*
Продолжение табл. 2
Сорта и формы Метафаза I Анафаза I Метафаза II Анафаза II Тетрады
Диплоидные сорта (КЯ, 2п = 14)
Плиса 3,1 1,7 1,6 2,1 0,9
Юбилейная 2,5 2,2 1,2 2,9 0,5
Зарница 3,3 1,8 1,1 2,5 1,0
Алькора 1,2 1,6 1,9 2,1 0,7
Среднее 2,5 1,8 1,5 2,4 3,1
* - Различия достоверны при P < 0,05.
У тетраплоидов в отличие от диплоидов в метафазе I достаточно часто (от 7,9 до 19,2%) встречались микроспороциты с унивалентны-ми хромосомами. У диплоидных форм они составили 1,2-3,3%.
В анафазе I в среднем количество МКП с нарушениями у тетраплоидных форм составило 9,9%, у диплоидных - 1,8%. Наиболее типичным нарушением для этой стадии мейоза является образование анафазных мостов.
Во втором мейотическом делении нарушения встречались чаще, чем в первом, и частота их достоверно (Р < 0,05) выше у тетраплоидов по сравнению с диплоидами. В среднем в мета-фазе II у тетраплоидных форм количество аномальных МКП составило 22,2%, у диплоидных
Выявленные анеуплоиды были представлены в основном 27-хромосомными гипотетраплои-дами. Количество их у разных тетраформ ржи различно и варьировало в интервале 0-8,1%. Наибольшее количество 27-хромосомных растений (8,1%) выщепилось в потомстве тетра-плоидной формы ржи Плиса. У тетраформы Юбилейная гипотетраплоидные растения отсутствовали. Формирование гипертетрапло-
сортов - 1,5%. В анафазе II количество МКП с нарушениями у тетраплоидных форм находилось на уровне 19,1%, у диплоидных - 2,4%.
Удвоение хромосом приводит к нарушению сбалансированной системы взаимодействия генов контроля мейоза [27, 28]. В настоящее время картирован ряд мейотических мутаций ^у1, sy9 syl0, sy18, sy19), контролирующих отдельные этапы процесса мейоза у озимой ржи.
Результаты цитологического анализа созданных тетраплоидных форм ржи показали относительно низкий уровень формирования (до 8,1%) анеуплоидных растений, что свидетельствует об эффективности дупликации генома ржи в первом делении зиготы (табл. 3).
идных растений (28 хромосом + фрагмент хромосомы) отмечено в 3,3% случаев у тетраформ Зарница и Плиса. Наибольшей стабильностью хромосомного состава из исследованных тетра-форм озимой ржи характеризовалась Юбилейная, тогда как Плиса содержала максимальное количество анеуплоидных растений.
Выщепление анеуплоидов в потомстве экспериментально полученных тетраплоидов свя-
Таблица 3
Содержание анеуплоидных растений у созданных тетраплоидных форм озимой ржи
Число хромосом у растений
Тетраплоидные формы 28 27 28 + фрагм. хром.
растений, % растений, % растений, %
шт. шт. шт.
Алькора 68 98,6 1 1,4 - -
Зарница 56 93,3 3 5 1 1,7
Юбилейная 54 100 - - - -
Плиса 62 90,3 5 8,1 1 1,6
зано с «реверсией плоидности», обусловленной нарушениями в мейозе. У полиплоидных видов злаков количество анеуплоидных особей с различными числами хромосом может составлять до 14%. У тетраплоидной ржи число анеуплоидов составляет в среднем 15-30%.
Генотипическая специфичность созданных полиплоидных форм ржи по содержанию анеуплоидов обусловлена следующими факторами:
• ранним (С1) поколением потомства анализируемых тетраплоидных форм;
• разным уровнем нарушений в мейозе у исходных диплоидных сортов и созданных на их основе аутотетраплоидов;
• уровнем стабильности полиплоидных геномов;
• гибелью анеуплоидов с числом хромосом значительно отклоняющимся от эуплоид-ного в результате зиготической селекции;
• отсутствием мутагенного эффекта закиси азота при полиплоидизации растений.
Проведен сравнительный анализ кариотипов созданных тетраплоидов с использованием С-метода дифференциального окрашивания хромосом. Установлено, что 28-хромосомные растения являлись геномно сбалансированными тетраплоидами (RRRR, 4х = 28) и не содержали видимых структурных изменений хромосом (рис. 2).
Рис. 2. Кариотипы озимой ржи Алькора: а - тетра-форма, б - исходная диплоидная форма
Главным недостатком экспериментально полученных полиплоидов, существенно ограничивающим использование их в селекции, является пониженная семенная продуктивность. Эта особенность полиплоидов представляет серьезное препятствие в селекционной работе с ними, за исключением вегетативно размножаемых форм и тех редких случаев, когда бессемянность является желательным товарным признаком.
Фертильность пыльцы у полученных те-траформ ржи составляла от 29,1 до 43,3%, что существенно ниже по сравнению с ди- и тетраплоидными сортами озимой ржи. Рожь отличается довольно высокой пыльцевой фер-тильностью (в среднем 92-98% у диплоидов и 86-87% у коммерческих тетраплоидных сортов). Озерненность колоса у тетраформ варьировала от 32,9 до 46,7% и оказалась ниже на 15,9-22,9% этого же показателя у диплоидного сорта ржи Павлинка.
Пониженная фертильность тетраплоидов ржи обусловлена гаметической и зиготической стерильностью. В гаметической стерильности различают пыльцевую стерильность, стериль-
ность макроспор и зародышевых мешков. Несмотря на частичную пыльцевую стерильность, у тетраплоидов достаточно образующейся фертильной пыльцы для того, чтобы обеспечить нормальное опыление [10]. Следовательно, стерильность пыльцы не оказывает существенного влияния на озерненность растений или это влияние незначительно. Нарушения в макроспорогенезе и макрогамето-генезе, приводящие к частичной деградации или неполноценности макроспор и зародышевых мешков, непосредственно снижают озерненность.
Для выявления различий в экспрессии генетических систем геномов новых тетрапло-идных форм озимой ржи в сравнении с исходными диплоидными сортами проводили электрофорез запасных белков секалинов семян. У исходных диплоидных сортов и созданных тетраплоидов ржи идентифицировано 66 типов спектра секалина, которые неравномерно распределены (от 7 до 19) и характеризуются специфическим составом для каждого сорта и тетраплоидной формы (табл. 4).
70 I Н.Б. Белько и др. Дупликация генома озимой ржи (Secale cereale L.) c использованием закиси азота...
Таблица 4
Состав и интенсивность компонентов секалина у исходных диплоидных сортов
и тетраплоидных форм озимой ржи
Диплоидные сорта и тетраплоидные формы Состав и интенсивность полипептидов секалина
ß Y ю
Зарница (RRRR, 2п = 28) 12345 45 2345 78910111213
Зарница 2п = 14) 2345 5 234 7891011
Юбилейная (RRRR, 2п = 28) 12345 1^5 Ï23456789101112
Юбилейная 2п = 14) 2345 5 234 78 1011
Алькора (RRRR, 2п = 28) 2345 5 1234 67891011
Алькора 2п = 14) 2345 1 1234 7891011
Плиса (RRRR, 2п = 28) 2345 1234 678910111213
Плиса 2п = 14) 2345 234 7891011
Установлено, что наибольшей изменчивости подвержены компоненты ю-зоны. У ряда генотипов отмечена элиминация компонентов ю 7, ю 11, ю 12, проявление ю1 и ю 6. В ß-зоне часто происходит элиминация компонентов ß 1, ß 2 и ß 3. Внутрисортовой полиморфизм ЭФ-спектров секалина у тетраплоидных форм значительно шире и достигает 10-19, у исходных диплоидных сортов - от 7 до 10 типов спектра. В электрофоретическом спектре секалина большинства тетраплоидных генотипов появляются у4 и у5 компоненты, отсутствующие у исходных диплоидных сортов, а компонент у1, присущий исходному диплоидному гибриду, может быть элиминирован у полученного те-траплоида. У ряда тетраплоидов наблюдается появление в ЭФ-спектре компонентов ю1213, не выявленных у исходных диплоидов.
С целью выявления изменений, произошедших в результате дупликации генома на уровне ДНК, проведен RAPD-анализ ДНК тетрапло-идных форм и исходных диплоидных сортов озимой ржи. У исследуемых сортов и форм ди- и тетраплоидной ржи выявлено по 66 фрагментов ДНК соответственно. Число амплифи-цированных фрагментов ДНК (ампликонов) в
суммарной выборке растений варьировало от 6 до 12 в зависимости от праймера, их размер составлял от 300 до 3000 п.н. Из 8 прайме-ров наиболее эффективными для озимой ржи оказались ОРА 5 и Р 36. На рис. 3 представлен спектр амплифицированных фрагментов ДНК растений ди- и тетраплоидной ржи c использованием праймера ОРА 5. В изученных ди- и тетраплоидных популяциях выявлено 10 и 11 фрагментов ДНК соответственно. Элек-трофоретический анализ амплифицируемых фрагментов ДНК созданных тетраплоидов в сравнении с их исходными диплоидными сортами выявил в спектрах существенные различия в 70% случаев. У тетраплоидов в 25% спектров обнаружено появление 1-3 фрагмента ДНК размером от 300 до 4000 п.н., отсутствующих у исходных диплоидных сортов. RAPD-анализ выявил у тетраплоидов потерю (20%) или одновременно потерю и появление (30%) отдельных полиморфных фрагментов ДНК. Чаще элиминировали фрагменты ДНК размером от 700 до 1700 п.н.
Полученные результаты свидетельствуют об изменениях генома ржи при дупликации, которые обусловлены структурными измене-
ниями ДНК, дифференциальной элиминацией последовательностей, метилированием ДНК и диверсификацией генов, перегруппировкой и блочными перестройками.
Рис. 3. RAPD-спектр амплифицированных фрагментов ДНК растений ди- (1 - Алькора, 2 - Плиса, 3 - Зарница, 4 - Юбилейная, 5 - Заречанская зеленоукосная) и тетраплоидной (6 - Алькора-тетра, 7 - Плиса-тетра, 8 - Зарница-тетра, 9 - Юбилейная-тетра, 10 - Заречанская зеленоукосная-тетра) озимой ржи, полученный
с использованием праймера ОРА 5. SP - фрагменты ДНК с известным числом пар оснований
На генетической основе сортов и гибридов диплоидной ржи путем дупликации в зиготе их геномов с использованием закиси азота создано 8 тетраплоидных форм (Зарница, Юбилейная, Зареченская зеленоукосная, Алькора, Плиса, Валдай х Каупо, Диамант и ДС-2). С целью селекционной оценки созданные нами тетраплоиды ржи анализировали по степени выраженности важнейших хозяйственно-ценных признаков и урожайности в сравнении с исходными диплоидами и стандартом в селекционном питомнике и в мелкоделяночных посевах. По результатам комплексной оценки в качестве перспективных признаны Зарница, Юбилейная, Алькора-тетра и Зареченская зе-леноукосная. Заречанская зеленоукосная-тетра характеризуется высокой интенсивностью весенней вегетации и представляет интерес в качестве исходного материала для создания сортов зеленоукосного направления. Для селекции сортов зернового направления наиболее подходят Зарница, Юбилейная, Диамант и Алькора, которые характеризуются вырав-ненностью стеблестоя, высокой устойчивостью к болезням и короткостебельностью. На основе тетраплоидной формы Зарница нами совместно с РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию» создан и передан в ГУ «Государственная инспекция по испытанию и охране сортов растений Республики Беларусь» сорт
тетраплоидной озимой ржи Фламинго (RRRR, 4х = 28). Схема создания сорта Фламинго представлена на рис. 4.
Сорт продовольственного, технического и кормового назначения. Создан путем перевода диплоидного сорта Зарница (RR, 2х = 14) на тетраплоидный уровень с последующими индивидуально-семейными отборами на высокий уровень озерненности колоса, устойчивость к снежной плесени, зимостойкость, продуктивность, устойчивость к предуборочному прорастанию и качество зерна. Сорт с рецессивным типом короткостебельности (Ы), высота растений составляет 140-150 см. Сорт устойчив к полеганию (8-9 баллов), характеризуется высоким уровнем зимостойкости (87-95%). Масса 1000 зерен варьирует от 41,0 до 47,8 г, натура зерна - 660-690 г/л. Сорт Фламинго по урожайности зерна превысил стандарт (сорт Пуховчанка) в среднем на 2,9 ц/га за три года испытаний в питомниках КСИ.
Тетраплоидные формы Юбилейная, Алькора, Плиса, Валдай х Каупо, Диамант и ДС-2 включены в селекционный процесс. Проводится гибридизация их с другими сортами с целью создания оптимально сбалансированных генетических систем с новым сочетанием генов хозяйственно-полезных признаков.
2008 г.
2009-2011 гг.
2012 г.
2013-2015 гг.
2016-2018 гг.
Рис. 4. Схема создания сорта тетраплоидной ржи Фламинго
Заключение
Проведенные исследования позволяют заключить, что закись азота (№2О) является высокоэффективным реагентом дупликации (полиплои-дизаци) генома сортов и гибридов диплоидной озимой ржи. При соблюдении оптимальных параметров обработки растений (давление в 6 атм, экспозиция растений в атмосфере N20 составляет 24 ч и обработка растений в первом делении зиготы, т.е. через 17-19 ч после искусственного опыления) метод обеспечивает получение до 85,7% тетраплоидов. Эффективность метода определяется завязываемостью зерен у обработанных закисью азота растений, жизнеспособностью полученных семян и частотой тетрапло-идных проростков. Образование тетраплоидов лимитируется в основном состоянием зигот в момент обработки растений закисью азота. Установлено [25, 29], что первое митотическое деление у озимой ржи в зависимости от сорта наступает через 17-19 часов после опыления. Показана генотипическая специфичность сортов и гибридов диплоидной озимой ржи по реакции растений на полиплоидизацию закисью азота, которая обусловлена:
• продолжительностью периода «от оплодотворения до начала деления зигот» у исследуемых сортов;
• генотипической специфичностью сортов ржи сохранять жизнеспособность зигот в атмосфере закиси азота и после прекращения его воздействия;
• разной способностью генотипов ржи к удвоению числа хромосом в первом делении зиготы под воздействием закиси азота.
Дупликация генома у ржи приводит к нарушению генетической системы регуляции мейоза (sy), изменению экспрессии генов видоспецифических запасных белков семян (секалинов, Sec) и структурным изменениям ДНК, что оказывает влияние на проявление признаков и свойств у тетраплоидов. Индуцированные на основе высокопродуктивных диплоидных сортов и гибридов тетраплоиды ржи сравнительно цитологически стабильны, ценны для расширения генофонда культуры и являются новым исходным материалом для селекции. Путем индивидуально-семейных отборов на озерненность колоса, устойчи-
вость к болезням, зимостойкость, продуктивность и качество зерна на их основе можно создавать тетраплоиды с новым сочетанием генов хозяйственно-полезных признаков путем гибридизации и селектировать коммерческие сорта в сравнительно короткие сроки.
Дальнейшие исследования будут направлены на изучение изменения аллельного состава генов хозяйственно-полезных признаков при дупликации генома в связи с селекцией на продуктивность, устойчивость к полеганию, листовым болезням, прорастанию зерна в колосе и качество продукции.
Список использованной литературы
1. Першина, Л.А.Оролиотдаленнойгибри-дизации и полиплоидии в эволюции растений / Л.А. Першина. - Вестник ВОГиС. - 2009. -Т. 13, № 2. - С.336-344.
2. Ware, D. Comparison of genes among cereals / D. Ware, L. Stein // Curr. Opin. Plant Biol. - 2003. - V. 6. - P. 121-127.
3. Adams, K.L. Polyploidy and genome evolution in plants. / K.L. Adams, J.F. Wendel // Curr. Opin. Plant Biol. - 2005. - V. 8. -P. 135-141.
4. Ramsery, A. The effect of the wheat Ph1 locus on chromatin organization and meiotic chromosome pairing analyzed by genome painting / A. Ramsery // Chromosoma. - 1998. -V. 107, № 6. - P. 339-350.
5. Masterson, J. Stomatal Sire in Fossil Plants: Evidence for Polyploidy in Majority of Angiosperms / J. Masterson // Science. - 1994 -V. 264. - P. 421-424.
6. Seoighe, C. Turning the clock bask on ancient genome duplication / C. Seoighe // Curr. Opin. Genet. Dev. - 2003. - V. 13. - P. 636-643.
7. Wendel, J.F. Genome evolution in polyploids / J.F. Wendel // Plant Mol Biol. - 2000. -V. 42. - P. 225-249.
8. Wolfe, K.N. Yesterday's polyploidization and mystery of diploidization / K.N. Wolfe // Nat. Rev. Genet. - 2001. - V. 2. - P. 333-341.
9. Widerspread duplications throughout the history of flowering plants / L. Cui [et al.] // Genome Res. - 2006. - V. 16. - P. 738-749.
10. Урбан, Э.П. Озимая рожь в Беларуси: Cелекция, семеноводство, технология возделывания / Э.П. Урбан. - Минск: Беларус. навука, 2009. - 269 c.
11. Врублевский, Л.А. К вопросу о методике получения тетраплоидов озимой ржи / Л.А. Врублевский, С.Д. Лаврукович // Тез. докл. III Всесоюзного совещания по полиплоидии. - Минск, 1970. -С. 35-36.
12. Тороп, А.А. Создание и отбор тетрапло-идных форм озимой ржи / А.А. Тороп, Е.Б. Панина // Селекция и семеноводство. - 1971. -Т. 1. - С. 21-24.
13. Получение тетраплоидной озимой ржи от совместного действия колхицина и папаина / А.А. Морозов [и др.] // Труды. НИИСХ. Центр. р-нов Нечерноземной Зоны. - 1977. -Т. 41. - С. 42- 44.
14. Петрушина, М.П. Митозные аномалии в тканях первичной меристемы у полиплоидной сахарной свеклы в Со и последующих генерациях / М.П. Петрушина // Вопросы генетики, селекции и цитологии сахарной свеклы. - Киев, 1971. - С. 110-115.
15. Давоян, Н.И. Диплоидизирующее и мутагенное действие колхицина / Н.И. Давоян, В.С. Тырнов // Гаплоидия у покрытосеменных растений. - Саратов, 1974. - С. 92-97.
16. Мухин, Н.Д. Эффективность метода полиплоидии в селекции озимой ржи на устойчивость к полеганию / Н.Д. Мухин, С.Д. Лав-рукович // Земледелие и растениеводство в БССР: Сб. науч. тр. БелНИИЗК. -Минск,1981. - Вып. 24. - С. 6-10.
17. Дубинин, Н.П. Генетика популяций и селекция / Н.П. Дубинин, Я.Л. Глембоцкий. -М., 1967. - 570 с.
18. Дубинин, Н.П. Теоретические вопросы и достижения при использовании полиплоидии в селекции растений / Н.П. Дубинин, В.К. Щербаков // Полиплоидия и селекция. -М.:Л., 1965. - С.8-42.
19. Demarly, Y Genetique des tetraploids et amelioration des plantes / Y. Demarly. // Ann. Ame-lir. Plantes. - 1963. - Vol. 13, N 4. - P. 377-400.
20. Lundqvist, A. Heterosis and inbreeding depression in autotetraploidy rye / A. Lundqvist // Heredity. - 1966. - Bd. 56. N 2-3. - P. 317-366.
21. Бахарев, А.Л. Полиплоидизация озимой ржи закисью азота: автореф. дис. канд. биол. наук. / А.Л. Бахарев. - Харьков., 1983 г. - 20 с.
22. Бадаева, Е.Д. Изменение хромосом ржи в кариотипе тритикале: дис ... канд. биол. наук: 03.00.15 / Е.Д. Бадаева. - М., 1984. - 181 с.
23. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / В.Г. Конарев [и др.]. - СПб, 2000. - С. 38-48.
24. Сиволап, Ю.М. Вариабельностьиспеци-фичность геномов сельскохозяйственных растений / Ю.М. Сиволап, Н.Э. Кожухова, Р.Н. Календарь. - Одесса: Астропринт, 2011. - С 49-74.
25. Методические рекомендации по поли-плоидизации (дупликация генома) ржи (S.cereale L.) с использованием закиси азота (N20) / Н.Б. Белько, И.С. Гордей, И.А. Гордей
// Институт генетики и цитологии НАН Беларуси. - Минск: Право и экономика, 2012. - 28 с.
26. Kitamura, S. Mechanism of action of nitrous oxide gas applied as a polyploidizing agent during meiosis in lilies / S. Kitamura // Sex. Plant Reprod. 22 - 2009 - P. 9-14.
27. Соснихина, С.П. Изучение генетического контроля мейоза у ржи / С.П. Соснихина [и др.] // Генетика. - 1994. - Т. 30. - С 1043-1056.
28. Национальный Интернет-портал РФФИ [Электронный ресурс] / Книги, изданные при поддержке РФФИ - Режим доступа: http:// www.rfbr.ru/old/pub/knigi/janus/golub.htm. -Дата доступа: 12.03.2010.
Дата поступления статьи 26 июня 2013 г.
