CC BY
58
УДК 636.082:575
Почерняев К.Ф., к.б.н., с.н.с. © E-mail: pochernyaev@mail.ru 1нститут свинарства i АПВ НААН, Полтава, Украгна
ГЕНЕТИЧНА ЕКСПЕРТИЗА ЧИСТОПОРОДНОСТ1 СВИНЕЙ ЗА ДОПОМОГОЮ МАРКЕР1В М1ТОХОНДР1АЛЬНОГО ГЕНОМУ
Окреслено необхiднiсть генетичног експертизи чистоnородностi свиней та зроблено огляд способiв гг проведення. Приведена методика i приклади практичного використання генетичног експертизи чистопородностi свиней за допомогою маркерiв мiтохондрiального геному. Виконат до^дження продемонстрували можливкть та необхiднiсть залучення маркерiв мiтохондрiального геному до проведення генетичног експертизи чистопорiдностi свиней. У випадку виключення чистопородностi висновок категоричний а при тдтвердженш зауважуеться про чистопорiднiсть, по материнськт лтп. Наголошено на необхiдностi пошуку полiморфiзму на дтянщ нерекомбтуючого регюну Y-хромосоми для визначення чистопородностi по батьювськт лтп.
Ключовi слова: свит, породи, чистопородтсть, експертиза, ДНК-маркери, мiтохондрiальний геном, KIT, MC1R, SNP мжросателти, Y-хромосома, гаплотип.
УДК 636.082:575
Почерняев К.Ф.
Институт свиноводства и АППНААН
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА ЧИСТОПОРОДНОСТИ СВИНЕЙ ПРИ ПОМОЩИ МАРКЕРОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА
Обозначенная необходимость генетической экспертизы чистопородности свиней и сделан обзор способов ее проведения. Приведена методика и примеры практического использования генетической экспертизы чистопородности свиней с помощью маркеров митохондриального генома. Выполненные исследования показали возможность и необходимость привлечения маркеров митохондриального генома к проведению генетической экспертизы чистопородности свиней. В случае исключения чистопородности вывод категоричен, а при подтверждении отмечается чистопородность, по материнской линии. Указано на необходимость поиска полиморфизма участка нерекомбинирующего региона Y-хромосомы для определения чистопородности по отцовской линии.
Ключевые слова: свиньи, породы, чистопородность, экспертиза, ДНК-маркеры, митохондриальный геном, КИТ, MC1R, SNP микросателлиты, Y-хромосома, гаплотип.
© Почерняев К.Ф., 2014
170
UDC 636.082:575
Pochernyaev K.F.
Institute of Pigbreeding andAIP NAAS
GENETIC TESTING OF PUREBRED PIGS WITH USING MARKERS OF
MITOCHONDRIAL GENOME
The outlined need of genetic testing the purity of breed in pigs and it has done the overview of its performing methods. It has been presented methods and examples of a practical use of genetic testing of purebred pigs with using markers of mitochondrial genome. The research demonstrated the possibility and the need to involve mitochondrial genome markers for the genetic testing purebred pigs. By excluding the purity of breed then the conclusion is categorical and at the confirmation it is observed the purity of breed through the maternal line. It is noted the necessity of finding polymorphisms at the site of non- recombining region Y-chromosome for definition of the purity of breed through paternal line.
Key words: pigs, breed, pure breeding, testing, DNA markers, the mitochondrial genome, KIT, MC1R, SNP microsatellite, Y-chromosome haplotype.
Вступ. З бюлопчно! точки зору порода - це сукупшсть тварин, яка рiзниться вщ шших груп даного виду певними, генетично обумовленими ознаками [1]. Характерш для породи ознаки можуть бути яккними або кшьккними. Оскшьки породи неможна розглядати як чист лши, тому специфiчною характеристикою породи можуть бути тшьки ознаки, що визначаються генами, яю знаходяться у гомозиготному сташ. За звичай це яккш ознаки, таю як наприклад, забарвлення волосяного покрову. Для визначення чистопородност свиней залучають ан^з алельного стану гешв -домшантного бшого та домшантного чорного [2]. Молекулярно-генетична основа домшантного бшого фенотипу полягае у двох нуклеотидних замшах в геш К1Т кодуючого рецептор фактора росту стволових кл^ин [3], та домшантного чорного - у рядi несинономiчних нуклеотидних замшах гену рецептору меланокортину 1 (MC1R) [4]. Мiжнародний консорщум дослщниюв з покращення генетики свиней, нещодавно опублжували у науковому журналi Nature повну нуклеотидну послщовшсть 70 геномiв свиней. У результат секвенування були щентифжоваш бшьше 10 мшьйошв нових однонуклеотидних полiморфiзмiв (SNP). Бшьш точна шформащя про гомозиготний стан гешв рiзних порщ зробить можливим залучити !х до генетично! експертизи чистопородност свиней.
Специфiчна характеристика свиней певно! породи може бути також встановлено з використанням мжросател^них маркерiв. Так в рамках проекту Pig Gene Mapping Project (PiGMaP) було оцiнено з використанням 18 мжросател^них маркерiв одинадцять порiд в тому числi i популяцiй дико! свинi, з шести европейських кра!н, загалом 483 зразюв ДНК [5]. Були визначенi достовiрнi вiдмiнностi мiж породами, а кластерний аналiз на основi генетичних вщстаней мiж окремими особами, визначив, що вс тварини згрупованi у 11 кластерiв, якi вiдповiдають 11 породам.
171
1нший пщхщ до одержання специфiчноl характеристики породи можливо отримати за рахунок ан^зу частини геному в якш вщсутш або обмежеш рекомбiнацiйнi процеси. В практищ використовують ДНК-маркери Y-хромосоми та м^охондрш. Особливiсть Y-хромосоми пов'язана з гаплощшстю И дiлянки NRY (нерекомбiнуючий регiон Y), яка не приймае участь у рекомбiнацiйних процесах через вщсутшсть гомолопчно! дiлянки на Х-хромосомi. В iнших хромосомах вщбуваеться обмiн iнформацiею мiж гомолопчними дiлянками пiд час мейозу. Таким чином, тшьки мутаци впливають на мшливють ще! частини Y-хромосоми i вона передаеться iз поколiння у поколшня у виглядi одного гаплотипу. На дшянщ NRY Y-хромосомi свинi, знайдено 10 генiв, яю можливо було б залучити у якост генетичних маркерiв [6]. Нажаль, на вiдмiну вiд скотарства та конярства в свинарствi використання гаплотитв Y-хромосом обмежено незначним полiморфiзмом [7]. В той же час, специфiчнi для порщ свиней гаплотипи мiтохондрiального геному, вже встановлена серед найбшьш поширених евро-американських та азшських порiд домашнiх та пiдвидiв диких свиней [8,9]. На вщмшу вщ маркерiв Y-хромосоми, що успадковуються по батьювськш лши, маркери мiтохондрiального геному передаються виключно по материнськiй лши. Закон Украши про племiнну справу, який вщображае бачення чистопородностi головними фахiвцями в галузi тваринництва, дае наступне юридичне визначення чистопородно! тварини. Племшна тварина -чистопородна або одержана за затвердженою програмою породного вдосконалення тварина, що мае племшну (генетичну) щншсть i може використовуватися в селекцшному процесi вiдповiдно до дiючих загальнодержавних програм селекци. В крашах з традицшно високою культурою тваринництва, чистопорщшсть тварин визначають дещо по шшому. Так в статтi 1 «Директиви Ради по зоотехнiчних стандартах у свинарствi (88/661ЕЕС)» зазначено - чистопородш свинi, це свинi, у яких ус предки занесенi до племшно! книги ие! ж породи i якi самi зареестрованi i можуть бути вдабраними для запису до тако! ж племшно! книги. Пбридш свинi, це свинi отриманi у результат цiлеспрямованого схрещування мiж чистопородними свинями рiзних порiд чи лшш та мiж тваринами, що самi походять вiд схрещування рiзних порщ чи лшш [10]. При порiвняннi Закону Украши та Директиви Евросоюзу стае видно, що в Украшському закош зроблено шпарину, яка дозволяе пбридних тварин називати племiнними тваринами, а племшш тварини автоматично стають чистопорщними. 1ншою причиною необхiдностi такого виду експертиз е завезення за кордону пбридних тварин та отримання за них вщшкодування, як за племшних. Для виконання нащональних програм iз збереження генетичного рiзноманiття вкрай важливо знати, що вiдiбранi для збереження тварини (сперма, ооцити, ембрюни) чистопородш. У зв'язку з цим для виршення кола практичних, наукових та правових питань постае необхщшсть розробки способiв генетично! експертизи чистопородност свиней.
Матер1али та методи. На замовлення агрофiрми «АгроРось» Черкасько! област та ПП «Аграрна компанiя 2004» Хмельницько! областi у примiщеннi лаборатори генетики 1нституту свинарства i АПВ НААН виконано генетичнi дослiдження з тестування племiнних тварин за мiтохондрiальними ДНК-
172
маркерами. На виршення дослщження поставлено питання: «Чи можуть надаш зразки бюлопчного матерiалу належати свиням велико! бiлоï породи або ландрас»? Аналiз виконаний згщно «Iнструкцiï з геномного типування в свинарствi для проведення генетичних дослщжень за ДНК-маркерами», затвердженоï Технiчною радою МАП Украши. Видiлення ДНК проводили з використанням iонообмiнноï смоли «Chelex-100». Амплiфiкацiю фрагменту D-петлi, що знаходиться мiж позицiями 15534 та 15962 мiтохондрiального геному, проводили на програмованому термостат ТЕРЦИК-2 (ДНК-Технологии, РоЫя) з використанням набору реагентiв («ТАПОТИЛИ», Росiя) та олiгонуклеотидних праймерiв власного дизайну [11]: MITPRO2F: CAT ACA AAT ATG TGA CCC CAA, MITPROR: GTG AGC ATG GGC TGA TTA GTC. Алжвоту продукту ПЛР (5 мкл ) гiдролiзували ендонуклеазою TasI (MBI Fermentas, Литва). Продукти амплiфiкацiï й гiдролiзу ДНК аналiзували у 8% полiакриламiдному гелг Як маркер молекулярно1' маси використовували ДНК плазмiди pBR322, гiдролiзованоï ендонуклеазою MspI. Вiзуалiзацiю продуктiв амплiфiкацiï та гiдролiзу ДНК здiйснювали шляхом фарбування гелiв бромистим етидieм i фотографуванням на транс-iлюмiнаторi в ультрафiолетовому свгглг
Результати дослщжень. Даний методичний пщхщ дозволяе одночасно визначати однонуклеотиднi полiморфiзми мiтохондрiального геному свинi 15558 Т >А, 15580 С > Т, 15616 Т > С, 15714 С > Т та 15758 С > Т. Нуклеотидш замши в цих позищях мiтохондрiального геному свиш змшюють можливiсть розщеплення ДНК i визначаються електрофоретичним роздiленням рестриктних фрагмента амплжошв. Рiзнi комбiнацiï полiморфiзмiв визначають 18 варiантiв (гаплотипiв) мтДНК позначених латинськими лiтерами вiд A до P. Для двох гаплотишв визначають тдтипи B1, B2 та J1, J2. Визначеш гаплотипи характеризують наступнi породи свиней: A - дюрок (европейський тип), мангалицька; B1, B2 - миргородська; C - ландрас, гемпшир, уельс (схщноевропейський тип) дика свиня (Украша, Польща); D, E, F - не знайдеш серед порщ свiйськоï свинi; G - уельс (захщноевропейський тип), дика свиня (Тгалш); H - не знайдеш серед порщ свиней; I - ландрас (европейський тип); J1
- велика бша (азшський тип I), мейшан, азшська дика свиня (швшч Япони); J2
- велика чорна; K - не знайдеш серед порщ свиней; L - велика бша (захщноевропейський тип); M - дюрок (азшський тип); N - велика бша (азшський тип II), беркшир, азшська дика свиня (твдень Япони); O - ландрас (схщноевропейський тип), дика свиня (Швещя); P - азшська дика свиня (твдень Япони).
У результат дослщження вибiрки десяти зразюв бюлопчного матерiалу було встановлено, що вс надаш для дослщження зразки АФ «АгроРось» та 1111 «Аграрна компашя 2004» належать тваринам виду Sus scrofa domestica (свиня домашня). Для восьми дослщжених бюлопчних зразюв АФ «АгроРось» визначений мiтохондрiальний гаплотип С не характерний для великоï бiлоï породи, що виключае походження по материнськш лши вщ породи велика бiла. Для двох дослщжених бюлопчних зразюв АФ «АгроРось» визначеш мiтохондрiальнi гаплотипи свиш L та N, як характерш для породи велика бша, що пщтверджуе походження по материнськш лши вщ породи велика бша. Для двох дослщжених бюлопчних зразюв ПП «Аграрна компашя 2004» визначеш
173
мiтохондрiальнi гаплотипи свиш L та J1, яю не характерш для породи ландрас, що виключае походження по материнськш лши вiд породи ландрас. Для трьох дослiджених бiологiчних зразкiв 1111 «Аграрна компанiя 2004» визначенi мiтохондрiальнi гаплотипи свинi L та J1, яю характернi для породи велика бша, що пiдтверджуе походження по материнськш лши вiд породи велика бша.
Висновки. Виконанi дослiдження продемонстрували можливiсть та необхiднiсть залучення маркерiв мiтохондрiального геному до проведення генетично! експертизи чистопорiдностi свиней. У випадку виключення чистопородностi висновок категоричний а при пщтвердженш зауважуеться про чистопорщшсть, по материнськiй лши.
Перспективи подальших досл1джень. Очевидна необхiднiсть пошуку полiморфiзму на дiлянцi нерекомбiнуючого регiону Y-хромосоми свинi, оскiльки на прикладi досягнень генетики велико! рогато! худоби та коней, встановлення чистопорщност по батьювськш лши е цшком можливе.
Л1тература
1. Иогансон И. Генетика и разведение домашних животных / И.Иогансон, Я.Рендель, О.Граверт // Колос. - М. - 1970. - с.351.
2. U.S. Patent: 6183955 - Methods for determining the coat color genotype of a pig - February 6, 2001.
3. Marklund S., Kijas J., Rodriguez-Martinez H., Ronnstrand L., Funa K., Moller M., Lange D., Edfors-Lilja I., Andersson L. Molecular Basis for the Dominant White Phenotype in the Domestic Pig // Genome Research. - 1998. - V. 8. - P. 826-833.
4. Kijas J. M. H., Wales R., Tornsten A., Chardon P., Moller M., Andersson L. Melanocortin Receptor 1 (MC1R) Mutations and Coat Color in Pigs // Genetics -1998. - V.150. - Р.1177-1185.
5. Archibald.The PiGMaP consortium linkage map of the pig (Sus scrofa) / A. Archibald, C.S. Haley, J. Brown, S. Couperwhite, H.A. McQueen, et al. // Mamm. Genome. - 1995. - V. 6. - P.157-175.
6. Quilter C. R. A mapping and evolutionary study of porcine sex chromosome gene / C. R., Quilter, S. C. Blott, A. J. Mileham, N. A. Affara, C. A. Sargent, D.K. Griffin // Mammalian Genome. - 2002. - V. 13. - N.10. - P. 588-594.
7. Почерняев К.Ф. Консерватившсть транслюемо! дшянки гену SRY домашшх та диких свиней / К.Ф. Почерняев // Науковий вкник Нащонального ушверситету бюресурЫв i природокористування Укра!ни / Редкол: Д.О.Мельничук (вщп. ред.) та ш. - К., 2009. - Вип. 138. - С. 265-269.
8. Giuffra E. The Origin of the Domestic Pig: Independent Domestication and Subsequent Introgression / E.Giuffra, J.M.H.Kijas, V.Amarger, O.Carlborg Jeon J-T., Andersson L. // Genetics. - 2000. - V. 154. - P. 1785-1791.
9. Fang M. Mitochondrial haplotypes of European wild boars with 2n=36 are closely related to those of European domestic pigs with 2n=38 / M.Fang, F.Berg, A.Ducos L.Andersson // Animal genetics. - 2006. - V.37. - P.459-464.
10. COUNCIL DIRECTIVE of 19 December on the zootechnical standards applicable to breeding animals of the porcine species (88/661/EEC).
11. Почерняев К.Ф. Визначення гаплотитв свиней з використанням методу породоспецифiчного ПЛР-ПДРФ мiтохондрiальноl ДНК // Ветеринарна бютехнолопя. - 2005. - №6. - С.138 - 143.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Щербатий З.£.
174
