CC BY
17
УДК 636.4:636.082:575.827
Tonixa В.С., д. с.-г. н., професор; © Крамаренко С.С., к. б. н., доцент;
Луговий С.1., к. с.-г. н., доцент, [email protected] Миколагвський державный аграрный утверситет
ВПЛИВ АНТРОПОГЕННОГО НАВАНТАЖЕННЯ НА ДИНАМ1КУ ГЕНОФОНДУ СВИНЕЙ ЗА ГЕНОМ ЕСТРОГЕНОВОГО РЕЦЕПТОРА (ESR)
У статт1 наведено результаты анал1зу динамжи генофонду свиней за геном естрогенового рецептора (ESR) залежно в1д ступеню антропогенного впливу. Встановлено особливост1 пол1морф1зму даного гена у свиней в ргзних рег1онах Украти.
Ключовi слова: ген естрогенового рецептора (ESR), пол1морф1зм, свит.
Вступ. Людина завжди використовувала навколишне середовище, в основному, як джерело ресурав, однак протягом дуже тривалого часу його дiяльнiсть не робила пом^ного впливу на бюсферу. Лише в юнщ минулого стол^тя змши бюсфери тд впливом господарсько1' дiяльностi звернули на себе увагу вчених. У першш половит ХХ столбя цi змiни наростали i у даний час лавиною обрушилися на людську цивiлiзацiю. Прагнучи до покращення умов свого життя, людина постшно нарощуе темпи матерiального виробництва, не замислюючись про наслщки [21].
Однак, поява новiтнiх промислових технологiй та 1хньо1 продукцiï, попршення екологiчноï ситуацiï потребують принциповоï змши пщходу до оцiнки бiобезпечностi окремих регюшв планети. Це обумовлюе необхщшсть додаткового аналiзу комплексу живих органiзмiв - мiшенi ïхньоï дiï.
Наступною проблемою е добiр об'ективних бiомаркерiв, змiни частоти трапляння яких адекватно би вщображали популяцiйно-генетичнi процеси, iндукованi новою екологiчною ситуацiею i дали б змогу прогнозувати ïхнiй напрям.
Одним з таких потенцшних маркерiв, на думку багатьох вчених [4, 15] може бути генетичний полiморфiзм сучасних високополiморфних нейтральних та селекцiйно-залежних ДНК-маркерiв.
Враховуючи вищесказане, метою нашо1' роботи було вивчення динамжи генофонду свиней за геном естрогенового рецептора (ESR) залежно вщ антропогенного впливу (наслщки авари на Чорнобильськш АЕС) на ареал ix розведення.
Мaтерiaли та методи. Дослщження було виконано за тдтримки Державного фонду фундаментальних дослiджень Украши у рамках проекту Ф43/011 «Дослщження динамжи генофонду домашшх свиней Sus Scrofa за антропогенного впливу з використанням нейтральних та селекцшно-залежних ДНК-маркерiв» (№
© Тотха В.С., Крамаренко С.С., Луговий С.1., 2011
341
державно! реестраци 0111U006972).
Для дослщження нами було використано даш генетичного полiморфiзму генетичного маркера ESR_PvuII у свиней велико! бшо! породи, яю розводяться у племшних заводах Запорiзько! (ВАТ «Племзавод «Степной», n = 19), Херсонсько! (ТОВ «Тавршсью свиш», n = 19) та Микола!всько! областей (СГПП «Техмет-Юг», n = 15).
Матерiалом для видшення ДНК були зразки тканини (вушш вищипи) свиней.
Крiм власних даних, отриманих пiд час виконання проекту, нами до ан^зу також було залучено даш шших авторiв, якi вивчали мiнливiсть цього генетичного маркеру.
Вщповщно до ступеня антропогенного пресу (внаслщок авари на ЧАЕС в 1986 рощ) вс популяци свиней нами було подшено на двi групи.
До першо! групи увшшли популяцп свиней з тих територш, якi найбiльше постраждали внаслiдок Чорнобильсько! катастрофи - з Ки!всько! та Чершпвсько! областей. А до друго! - популяцп з територiй, яю зазнали меншого впливу радiацiйного забруднення - iз решти регiонiв Укра!ни.
Лабораторнi дослiдження виконувалися в умовах лаборатори молекулярно! генетики та цитогенетики тварин Центру бютехнологи та молекулярно! дiагностики Всеросiйського iнституту тваринництва РАСГН та лаборатори генетики 1нституту свинарства iм. О. В. Квасницького НААНУ.
Видiлення ДНК здiйснювали шляхом лiзису в буферi Кавасакi [16] та перхлоратним методом з модифiкацiями, розробленими у Центрi бiотехнологi! та молекулярно! дiагностики Всеросiйського iнституту тваринництва РАСГН [3, 5].
Аналiз полiморфiзму генетичного маркера ESR_PvuII здiйснювали методом ПЛР з наступним гiдролiзом утворених фрагментiв ендонуклеазою рестрикцп PvuII [19] (ПЛР-ПДРФ) та !х роздiленням методом електрофорезу.
Електрофоретичне роздшення проводили при напрузi 120... 130В в 2,5...3,0% агарозному гелi в буферi ТАЕ з додаванням бромистого димiдiю до кiнцево! концентраци 30 нг/мл.
Вiзуалiзацiю продуктiв ПЛР-ПДРФ здшснювали в ультрафiолетовому свiтлi з використанням транciлюмiнатора UVT1 Biometra. Документащю результатiв проводили за допомогою цифрово! вiдеокамери з використанням програмного забезпечення BioTestD.
Весь статистичний аналiз проведений на пiдставi загальноприйнятих методик [12] з використанням програми GenAIEx [17].
Результати дослщження. Ген естрогенового рецептора (ESR) свиней розташований на першш хромосомi (SSC1) [22]. Механiзм генетичного впливу естрогенового рецептора полягае в контролi вироблення жiночого статевого гормону - естрогену, який визначае вщтворювальш якостi.
В 1991 роцi М. Rothschild та ствавтори [18] описали наявшсть однiе! точково! мутаци (SNP) в третьому iнтронi гена естрогенового рецептору свиней (ESR), яка проявляеться при ди рестриктази PvuII. Сайтом рестрикцп для ще! рестриктази е
дшянка CAGfCTG [20]. При цьому формувалися двi алелi довжиною 4,3 тис. п. н. та 3,7 тис. п. н.
Однак, умови ПЛР-ПДРФ, яю були запропоноваш М. Rothschild 3i ствавторами використовували не дуже вдалий rn6ip праймерiв, внаслiдок чого продукти рестрикци не дуже легко було штерпретувати. Тому, в 1997 роцi Т. Short i3 спiвавторами [19] розробили новий набiр праймерiв, що дав можлившть покращити вiзуалiзацiю результатiв ПЛР-ПДРФ-аналiзу. Вони запропонували для аналiзу полiморфiзму за рестриктазою PvuII праймери:
ESR F: 5'-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3';
ESR R: 5'-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3'.
В цьому випадку двi алелi мали наступну довжину: 120 п. н. (алель А) та 65+55 п. н. (алель В). Тварини з генотипом АА мають гшофункщю, а ВВ -гшерфункцш вироблення естрогену. В гетерозиготному варiантi (АВ) його вироблення мае середне значення.
Нараз^ в генi естрогенового рецептора свиней (ESR) встановлено наявшсть декшька точкових мутацiй (SNP). При цьому, найбшьш вивченою е SNP ESR_PvuII.
В таблицi 1 наведено вихiднi данi для геногеографiчноi характеристики та проведення аналiзу рiвня генетичного рiзноманiття свиней Украiни за геном естрогенового рецептора (ESR).
Таблиця 1
Частоти генотншв за геном естрогенового рецептора (ESR) __ у ^ свиней pi3HHx порщ_
Область Поро-да n Генотип Джерело
AA AB BB
Кшвська ВБ 60 0,48 0,27 0,25 О.Коновал, С.Костенко, 2008
? ВЧ 37 0,54 0,38 0,08 А.Саенко, В.Балацький, 2009
? ВБ 50 0,14 0,43 0,43
? ВБ 47 0,32 0,57 0,11
? ВБ 105 0,60 0,22 0,18 О.Коновал та ш., 2008
Кшвська Л 30 0,39 0,42 0,19 О.Сидоренко, 2009
Кшвська УМ 16 0,19 0,81 0,00
Микола!вська ЧБПП 20 0,50 0,50 0,00 В.Бугаевський та ш., 2010
Кшвська ВБ 62 0,58 0,10 0,32 С.Костенко та ш., 2010
Кшвська ВБ 47 0,15 0,60 0,25
Кшвська ВБ 29 0,14 0,76 0,10 С.Костенко, О.Сидоренко, 2010
Кшвська Л 7 0,29 0,71 0,00
Дшпропетровська УМ 6 0,00 0,83 0,17
Запор1зька ВБ 100 0,26 0,57 0,17 В.Балацький та ш., 2010
Кшвська ВБ 123 0,60 0,22 0,18 О. Коновал та ш., 2008
Херсонська ВБ 19 0,53 0,42 0,05 власш даш
Микола!вська ВБ 15 0,53 0,47 0,00
Запор1зька ВБ 19 0,58 0,26 0,16
Чершпвська ВБ 45 матер1али знахо-дяться на лабораторному анал1з1
Чершпвська Л 25
Чершпвська Д 25
Як бачимо iз даних, що наведено в таблиц 1, оцшку генетично! структури популяцш свиней та рiвня полiморфiзму 1х генофонду на територи Укра1ни проведено дуже нерiвномiрно. Найкраще вивчено популяци тих господарств, якi розташованi на територи Кшвсько! областi. Менш дослщженими е генотипи тварин iз господарств, що розташоваш в центральних областях Укра1ни -Днiпропетровськiй та Запорiзькiй. Нарештi, в рамках даного проекту вперше системно були дослiдженi свиш iз господарств Чершпвсько! областi та господарств, як розташованi в твденних областях - Микола1'вськш та Херсонськш.
Найбiльш вивченим е генофонд велико! бшо! породи (ВБ). Значно менше даних виявлено щодо генофонду свиней порщ ландрас (Л) та украшська м'ясна (УМ). Поодинокi дослiдження проведет серед свиней порщ велика чорна (ВЧ), дюрок (Д), червоно-бiлопояса (ЧБПП).
В таблицi 2 наведено оцiнки частот алелей А та В за геном Е8Я серед свиней рiзних порiд iз рiзних регюшв Укра1ни.
Таблиця 2
Частоти алелей гену естрогенового рецептора (Е8Я) __ у свиней рйннх порщ_
Область Порода п Частота алел1 Джерело
А В
Ки1вська ВБ 60 0,617 0,383 О.Коновал, С.Костенко, 2008
? ВЧ 37 0,730 0,270 А.Саенко, В.Балацький, 2009
? ВБ 50 0,350 0,650
? ВБ 47 0,606 0,394
? ВБ 105 0,710 0,290 О.Коновал та ш., 2008
Ки!вська Л 30 0,617 0,383 О.Сидоренко, 2009
Ки!вська УМ 16 0,594 0,406
Микола!вська ЧБПП 20 0,750 0,250 В.Бугаевський та ш., 2010
Ки!вська ВБ 62 0,629 0,371 С.Костенко та ш., 2010
Ки!вська ВБ 47 0,447 0,553
Ки!вська ВБ 29 0,517 0,483 С.Костенко,О. Сидоренко, 2010
Ки!вська Л 7 0,643 0,357
Дшпропетровська УМ 6 0,417 0,583
Запор1зька ВБ 100 0,545 0,455 В.Балацький та ш., 2010
Ки!вська ВБ 123 0,711 0,289 О.Коновал та ш., 2008
Херсонська ВБ 19 0,737 0,263 власш даш
Микола!вська ВБ 15 0,767 0,233
Запор1зька ВБ 19 0,711 0,289
Черн1г1вська ВБ 45 матер1али знаходяться на лабораторному анал1з1
Черн1г1вська Л 25
Черн1г1вська Д 25
Частота алелi В коливаеться у вщносно незначних межах - вщ 0,233 до 0,650. В середньому, частота алелi В для свиней iз дослiджених популяцiй Укра1ни складае 0,381 ± 0,012.
Слщ вiдмiтити, що свинi iз популяцш, розташованих в регiонах зi значним
антропогенним пресом, мають частоту алелi В дещо вище, шж свинi iз популяцiй, розташованих у вiдносно чистiй зонi.
Так, iз 8 популяцiй iз першо! групи, в п'яти частота алелi В переважала середнiй по Укра!ш показник (62,5%), тодi як iз 6 популяцiй, що входять до друго! групи, лише двi популяци мали оцiнки частоти алелi В, що переважали середнiй по Укра!ш показник (33,3%). Таким чином, можна припустити, що алель В гену ЕвЯ може бути пов'язана iз пiдвищенням резистентностi до рiзноманiтних факторiв антропогенного пресу.
Крiм безпосередньо, частоти окремих алелей рiзних генетичних маркерiв, не менш важливе значення мае також оцшка генетичного рiзноманiття популяцiй свиней та рiвень генетично! рiвноваги в них.
В таблиц 3 наведено показники фактично! та очжувано! гетерозиготностi, оцшку iндексу iнбридингу та ступiнь вщповвдносп структури дослiджених популяцiй стану генетично! рiвноваги.
Таблиця 3
Фактнчна та очжувана гетерознготнiсть за геном Е8Я __ у свиней р^зних порщ _
Область Порода Но Не Джерело
Ки!вська ВБ 0,267 0,477 0,441 11,40 Коновал, С.Костенко, 2008
? ВЧ 0,378 0,400 0,054 0,06 А.Саенко, В.Балацький, 2009
? ВБ 0,420 0,460 0,086 0,30
? ВБ 0,574 0,482 -0,191 1,94
? ВБ 0,219 0,414 0,471 23,06 О.Коновал та ш., 2008
Ки!вська Л 0,433 0,481 0,099 0,21 О.Сидоренко, 2009
Ки!вська УМ 0,813 0,498 -0,632 7,49
Миколавська ЧБПП 0,500 0,385 -0,300 2,22 В.Бугаевський та ш., 2010
Ки!вська ВБ 0,097 0,470 0,794 38,95 С.Костенко та ш.., 2010
Ки!вська ВБ 0,596 0,500 -0,192 1,98
Ки!вська ВБ 0,759 0,508 -0,493 7,81 С.Костенко, О.Сидоренко, 2010
Ки!вська Л 0,714 0,495 -0,444 2,16
Дн1пропетровська УМ 0,833 0,530 -0,571 3,06
Запор1зька ВБ 0,570 0,498 -0,144 2,23 В.Балацький та ш., 2010
Ки!вська ВБ 0,220 0,412 0,468 26,65 О.Коновал та ш., 2008
Херсонська ВБ 0,421 0,398 -0,057 0,14 власш даш
Миколш'вська ВБ 0,467 0,370 -0,261 1,39
Запор1зька ВБ 0,263 0,422 0,377 2,47
Черн1г1вська ВБ матер1али знаходяться на лабораторному анал1з1
Черн1г1вська Л
Чершпвська Д
Примггка. Жирним курсивом видшеш в1ропдш оцшки критерш х2, для яких р < 0,05.
Оцшки iндексу iнбридингу свiдчать про те, що в рiзних популящях свиней iз рiзних регiонiв Укра!ни генетична структура (насамперед, спiввiдношення частот окремих генотитв) значно коливаеться вщ надмiрного дефiциту гетерозигот до значного !х надлишку.
Лише у 6 випадках iз 18 дослщжених популяцш щ вщхилення мали високовiрогiдне значення. Але характерно, що всi щ популяцп (за виключенням одно!, для яко! вiдсутнi данi що територiально! належностi) входять до першо! групи, тобто розташоваш на територп, яка зазнала значного антропогенного пресу. Крiм того, в п'яти випадках iз 6 для таких популяцш вiдмiчаeться значний дефщит гетерозигот.
Висновки.
При здшсненш геногеографiчно! характеристики та аналiзу рiвня генетичного рiзноманiття свиней, якi розводяться в рiзних регiонах Укра!ни, за геном Е8Я встановлено, що на територiях зi значним антропогенним пресом (внаслiдок аварп на ЧАЕС) вiдмiчаeться збiльшення частоти алелi В, яке може бути пов'язаним iз пщвищенням резистентностi особин-носпв дано! алелi до рiзноманiтних факторiв антропогенного пресу.
В рiзних популяцiях свиней iз рiзних регiонiв Укра!ни генетична структура (насамперед, стввщношення частот окремих генотипiв) значно коливаеться вiд значного дефiциту гетерозигот до значного надлишку гетерозигот. Найчастше генетична рiвновага у популяцiях свиней порушена внаслщок значного дефiциту гетерозигот.
Л1тература
1. Балацький В. М. Асощацп генiв у популяцп свиней велико! бшо! породи англiйсько! селекцi! / В. М. Балацький, Т. В. Овсяник, С. М. Коршний // Свинарство. М1жвщомчий тематичний науковий збiрник. — 2008. — Вип. 56. - С. 41—45. — Режим доступу до журн.:
http://www.nbuv.gov.ua/portal/Chem_Biol/Smtnz/2008_56/Article.pdf/10_Balat sky_Ovsyanyk_Korinyy.pdf.
2. Бугаевський В. М. Селекщя на тдвищення продуктивност свиней червоно! бiлопоясо! породи за допомогою генетичних маркерiв плодючостi / В. М. Бугаевський, В. М. Балацький, М. С. Косой, Л. В. Онищенко // Науковi пращ: Науково-методичний журнал. - Т. 132. — Вип. 119. Еколопя. — Микола!в: Вид-во ЧДУ iм. Петра Могили, 2010. — С. 62—64 — Режим доступу до журн.:.
http://www.nbuv.gov.ua/portal/Soc_Gum/Npchdu/Ecology/2010_119/119-
15.pdf
3. Гладырь Е. А. / Е. А. Гладырь, Н. А. Зиновьева, А. Н. Попов, Н. С. Марзанов, Л. К. Эрнст, Г. Брем. Методические рекомендации по определению вариантов каппа-казеина и бета-лактоглобулина крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ анализа // Дубровицы, 2001. — 15 с.
4. Глазко Т. Чорнобиль: новий фактор еволюцп. Нез'ясоваш популящйно-генетичш наслщки / Т. Глазко, В. Глазко // Вкник НАН Укра!ни. — 2006. —№ 4. — С. 39—51.
5. Зиновьева Н. А. / Н. А. Зиновьева, А. Н. Попов, Л. К. Эрнст, Н. С. Марзанов, В. В. Бочкарев, Н. И. Стрекозов, Г. Брем. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве // Дубровицы, 1998. — 47 с.
6. Коновал О. М. Дослщження полiморфiзму свиней велико! бшо! породи за генами господарсько-корисних ознак / О. М. Коновал, С. О. Костенко, К. Бшек, Ж. Фшкукова // Науковi доповвд НАУ, 2008. - № 1(9). — Режим доступу до журн.:
http://www.nbuv.gov.ua/e-Journals/nd/2008-1/08komevt.pdf
7. Коновал О. М. Молекулярно-генетичний аналiз гешв, асоцшованих i3 господарсько-корисними ознаками свиш свшсько! (Sus Scrofa) / О. М. Коновал, С. О. Костенко, В. Г. Спиридонов, С. Д. Мельничук // Вюник укра!нського товариства генетикiв i селекцiонерiв. — 2008. — № 2. — Т. 6. — С. 240—245.
8. Коновал С. М. Генетична структура укра!нсько! популяцп свиней породи велика бша за геном естроген-рецептора / С. М. Коновал, С. О. Костенко, В. Г. Спиридонов, С. Д. Мельничук, I. П. Григорюк // Доповвд Нащонально! академп наук Украши. — 2008. — № 3. — С. 149—151.
9. Костенко С. О. Генетичний аналiз кнурiв-плiдникiв рiзних порщ за геном естроген-рецептора / С. О. Костенко, О. В. Сидоренко // Режим доступу:
http://www.btsau.kiev.ua/files/list/edition/ed_mjhxckydsd.pdf
10. Костенко С. О. Генетичний аналiз лшш свиней велико! бшо! породи за генами рецепторiв естрогену та меланокортину-4 / С. О. Костенко, О. В. Сидоренко // Науковий вюник Нащонального ушверситету бюресурав i природокористування Украши. Серiя: Технологiя виробництва i переробки продукци тваринництва. — 2011. — Вип. 160. — Ч. 1. — Режим доступу до журн.:
http://www.nbuv.gov.ua/portal/chem_biol/nvnau_tvppt/2011_160_1/11kso.pdf
11. Костенко С. О. Генетичний мошторинг свиней велико! бшо! породи за генами ESR та MC4R / С. О. Костенко, О. М. Коновал, О. В. Сидоренко, В. Г. Спиридонов // Фактори експериментально! еволюцп органiзмiв: зб. наук. пр. НАН Украши, НААН Украши, АМН Украши, Укр. т-во генетиюв i селекцiонерiв iм. М. I. Вавилова; редкол.: В. А. Кунах (голов. ред.) [та ш.]. — К.: Логос, 2010. — Т. 8. — С. 148—154.
12. Ли Ч. Введение в популяционную генетику / Ч. Ли. — М.:, 1978. — 356 с.
13. Саенко А. М. Полiморфiзм QTL-гешв в породах свиней рiзного напряму продуктивност / А. М. Саенко, В. М. Балацький // Науковий вюник Нащонального ушверситету бюресурав i природокористування Украши. — 2009. —Вип. 138. — Режим доступу до журн.:
http://www.nbuv.gov.ua/portal/chem_biol/nvnau/2009_138/09sem.pdf
14. Сидоренко О. В. Полiморфiзм естроген-рецептора у свиноматок м'ясного напряму продуктивност / О. В. Сидоренко // Науковий вюник Нащонального ушверситету бюресурав i природокористування Украши. — 2009. —Вип. 138. — Режим доступу до журн.:
http://nbuv.gov.ua/portal/chem_biol/nvnau/2009_138/09sov.pdf
15. Эрнст Л. К. Биологические проблемы животноводства в XXI веке / Л. К. Эрнст, Н. А. Зиновьева. — М.: РАСХН, 2008. — 501 с.
16. Kawasaki E. S. Sample preparation from blood, cells and other fluids // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications / Eds М. A. Innis, D. Н. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. While. — San Diego, 1990. — P. 146—152.
17. Peakall R., Smouse P. GENAIEX 6: genetic analysis in Excel. Population
genetic software for teaching and research // Molecular Ecology Notes. — 2006. — № 6. — Р. 288—295.
18. Rothschild M.F., Larson R.G., Jacobson C., Pearson P. (1991): PvuII polymorphisms at the porcine estrogen-receptor locus (ESR). Anim. Genet., 22, 448— 448.
19. Short T.H., Rothschild M.F., Southwood O.I., McLaren D.G., De Vries A., van der Steen H., Eckardt G.R. Tuggle C.K., Helm J., Vaske D.A., Mileham A.J., Plastow G.S. (1997): Effect of oestrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines. J. Anim. Sci., 75, 3138—3142.
20. http://molbiol.edu.ru/re/PvuII.html
21. http://schools.keldysh.ru/sch1952/Pages/Timokhina04/Biolog/03.htm
22. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 214220.1
Summary Topiha V., Kramarenko S., Lugovyi S.
INFLUENCE HUMAN PRESSURE ON PIG GENOFOND DYNAMICS OF ESTROGEN RECEPTOR GENE (ESR)
The article contains an results of analysis dynamics of genofond of the pig estrogen receptor gene (ESR), depending on the degree of human impact. The peculiarities of this gene polymorphism in pigs in different regions of Ukraine.
Key words: estrogen receptor gene (ESR), polymorphism, pig.
Рецензент - д.с.-г.н., проф. Параняк Р.П.
