CC BY
32
DOI 10.31588/2413-4201-1883-238-2-4-9
УДК 636.082.2:636.034
ГЕН МАННОЗА-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЛЕКТИНА (MBL), И ВЛИЯНИЕ ЕГО ПОЛИМОРФИЗМА НА УСТОЙЧИВОСТЬ КОРОВ К МАСТИТУ
Абдуллина Л.В. - к.б.н., *Юсупова Г.Р. - д.б.н., доцент
АНОО ВО Центросоюза Российской Федерации «Российский университет кооперации» Казанский
кооперативный институт (филиал) *ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: ген, аллель, полиморфизм, ПЦР-ПДРФ, лактоферрин, MBL, крупный рогатый скот, мастит, соматические клетки, удой, жир, белок
Key words: gen, allele, polymorphism, PCR-RLFP, MBL, mannose binding lectin cattle, mastitis, somatic cells, yield, fat, protein
Маннозосвязывающий лектин
(англ. mannose binding lectin, MBL), также известный как маннан-связывающий белок (МВР), представляет собой кальций-зависимый коллагеновый белок, который участвует в активации комплемента через лектиновые пути [1]. Известно, что для формирования быстрой иммунной реакции организма при условии, что он еще не продуцировал антитела против инфекционного агента, лектиновый путь активации комплемента является антителонезависи-мым [7].
Система комплемента является одной из главных защитных систем организма, представляющая собой некий комплекс сывороточных белков крови [1]. Данная система комплимента относится к неспецифическим факторам устойчивости, обеспечивая при этом немедленную защиту организма от инфекции, включая также противовоспалительные эффекты. Важнейшей функцией маннозасвязываю-щий лектин белка - опсонизирующая [6], нейтрализирующая и активирующая систему комплимента [5]. Данная функция характеризуется секрецией опсонизирую-щих компонентов вскоре после активации системы комплемента, которые в свою очередь покрывают патогенные микроорганизмы либо иммунные комплексы, увеличивая при этом процесс фагоцитоза. Еще одной важной функцией системы комплимента является участие его в воспалительных процессах организма.
Белок манноза-связывающий лек-
тин вырабатывается в печени под влиянием цитокинов воспаления. Выработка MBL происходит в качестве ответной реакции на инфекцию, при этом попадая в кровь, он становиться частью механизма антиген-специфического иммунитета [3].
Данный белок является частью многих факторов, определяемых как белки острой фазы. [4]. Он играет важную роль во врожденном иммунитете. Недостаточность MBL связывают с низкой выживаемостью новорожденных в возрасте до года, которые в связи с незрелостью иммунитета очень чувствительны к инфекционным заболеваниям. Манноза-связывающий белок относиться к группе белков коллектинов, являющимися белками суперсемейства лектинов. При этом важнейшей их функцией в организме млекопитающих является распознавание чужеродноподобных агентов, имеющие бактериальную, грибковую, вирусную природу [3]. Установлено, что маннозосвязывающий лектиновый путь активации врожденного иммунитета, обусловлен связыванием данного белка с углеводными остатками - маннозой и фу-козой, которые находятся на поверхности патогенов. Также известно, что
MBL связывается на поверхности апоптозных клеток, что облегчает их поглощение фагоцитами. Ген MBL1 крупного рогатого скота локализован на 26 хромосоме Bos taurus и состоит из 3 ин-тронов и 4 экзонов, кодирует 249 аминокислот. Установлено, что однонуклеотид-ная замена в позиции 2651 аденина на гуа-
нин приводит к возникновению мутации в гене [7]. Мутации М^ гена клинически проявляются повышенной восприимчивостью к инфекционным агентам. Подобные точковые мутации, происходящие в гене М^, могут влиять на структуру самого маннозасвязывающего лектин белка, тем самым уменьшая уровень концентрации М^ в сыворотке крови и способствуя восприимчивости к различного рода инфекций. У большинства млекопитающих есть 2 гена манноза-связывающего лектина - это М^1 и М^2 [3], которые кодируют белки М^-А и М^-С, соответственно. Показано, что мутации в обоих генах изменяют восприимчивость животных к различного рода инфекциям. Так, например, у различных пород свиней, ослабленная резистентность к болезням связана с тремя однонуклеотидными заменами (SNP) в кодирующей области.
Некоторые исследования показали, что у коров, вымя которых поражено клиническим маститом, более высокая экспрессия гена Ы^, по сравнению со здоровыми животными.
Данные результаты могут свидетельствовать о том, что белок маннозосвязывающий лектин, кодируемый геном MBL может служить молекулярным маркером устойчивости коров к маститу [6].
ваны в качестве потенциальных маркеров устойчивости коров к маститу. По результатам молекулярно-генетического тестирования крупного рогатого скота в раннем возрасте, возможно вести селекционно-племенную работу, направленную на уве-
метить, что молекулярно-генетические исследования проводились на ограниченном числе пород крупного рогатого скота, поэтому необходимо провести подобный анализ и относительно других пород в частности на отечественном скоте, с целью подтверждения ассоциативности данных маркеров с устойчивостью коров к маститам и, соответственно, дальнейшем наращивании маститорезистентных особей в
Материал и методы исследований. Для проведения исследований и оценки по генам-кандидатам устойчивости коров к маститам были отобраны племенные первотёлки из СХПК им. Ленина Ат-нинского района Республики Татарстан (РТ) (n=387). За период проведения исследований все опытное поголовье крупного рогатого скота СХПК им. Ленина находилось в одинаковых условиях кормления, технологического содержания, ветеринарного обслуживания.
Анализ происхождения, продуктивности коров был проведен с помощью программного пакета «Селекс 3.1» (АРМ Плинор, Санкт-Петербург).
Молочную продуктивность определяли путём проведения контрольных доек. Анализ качества молока производили на приборе «Лактан 1-4» в соответствии с инструкциями производителя. Для измерения использовали свежее молоко. Для определения количества соматических клеток в молоке использовали прибор «Соматос-В» согласно рекомендациям производителя.
Кровь, полученную утром до кормления из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.
Выделение ДНК из цельной крови крупного рогатого скота проводили с использованием комплекта реагентов «ДНК-Сорб-В» согласно инструкции изготовителя по применению (ЦНИИ Эпидимиоло-гии Роспотребнадзора, Россия). Фрагменты ДНК амплифицировали на программируемом термоциклере MyCycler и Т-100 (Bio-Rad, США). Для ПЦР использовали Taq ДНК полимеразу (5 ед./мкл) (MBI Fermentas, Германия) с поставляемым буфером - 10х Taq буфер. Смесь де-зоксинуклеозидтрифосфатов (2,5 мМ каждого из dNTP) (MBI Fermentas, Германия) была добавлена в реакционную смесь в конечной концентрации 0,25 мМ. Прай-меры, использованные в работе, были синтезированы фирмой СибЭнзим (г. Новосибирск, Россия). Праймеры применяли в концентрации 1 мкМ. Матричную ДНК добавляли в количестве 10-100 нг на одну реакцию. Были оптимизированы протоколы и режимы проведения полимеразной
цепной реакции (ПЦР) для каждого из исследуемых генов, с соответствующими изменениями температурных и временных профилей реакции, что обеспечило оптимальную амплификацию участков генов. Гидролиз ПЦР-проб проводили эндо-нуклеазами рестрикции БсоМ для гена лактоферрина (ЬТБ), и НаеШ для гена манноза-связывающего лектина (MBL1), фирмы СибЭнзим (г.Новосибирск, Россия) в соответствии с рекомендациями изготовителя. ПЦР-смесь с амплифи-цированными фрагментами составляла 3/5 общего объёма реакционной смеси.
Результаты исследований. С помощью метода ПЦР-ПДРФ-анализа ДНК, экстрагированной из крови крупного рогатого скота, нами были исследованы аллели и генотипы гена манноза-связывающего лектина. По результатам амплификации ДНК крупного рогатого скота с парой праймеров 5 -
атоатоасллАтаттоастлААс-з1 и мвLlr: 5-таастстсссттттстссстт-
3 / получен специфический фрагмент гена лактоферрина длиной 255 п.н. При последующем ПДРФ-анализе продуктов амплификации в тестируемых препаратах ДНК исследуемого поголовья крупного рогатого скота выявлено два аллеля гена лак-тоферрина - С и Т, и отмечено наличие трех генотипов - MBL1CC, MBL1TC и MBL1TT (рисунок 1).
Генотипирование крупного
рогатого скота по гену маннозасвязы-вающего лектина осуществляли с учётом схемы выравнивания и картирования амплифицируемых с помощью праймеров MBL1f и MBL1r нуклеотидных последовательностей ДНК локуса MBLl-гена Bos taurus (рисунок 2).
Таким образом, исследования показали возможность применения использованных праймеров MBL1f и MBL1r, эндо-нуклеазы рестрикции HaeIII и соответствующего ПЦР-ПДРФ-протокола в целом для генотипирования крупного рогатого скота по гену MBL1.
8 7 654321 М
Рисунок 1 - Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ-анализа манноза-связывающего лектина крупного рогатого скота с праймерами
На основании анализа полиморфизма гена манноза-связывающего лек-тина 387 первотёлок голштинской породы установлено, что 161 животное или 41,6 %
гена
TC
CC
несут гомозиготный генотип MBL1 , 168
коров или 43,4 % имели генотип MBL1
и у 58 первотёлок или 15,0 % выявлен ге
тт
нотип MBL1 . Частота встречаемости ал лелей С и Т составила 0,63 и 0,37, соответ ственно (таблица 1 ).
Таблица 1 - Полиморфизм гена MBL1 у голштинских первотёлок
Генотип n Частота генотипов Частота аллелей Х2
Наблюдаемая частота (Но) Ожидаемая частота (Не) С Т
MBL1CC 161 41,6 40,1 0,63 0,37 2,27
MBL1TC 168 43,4 46,5
MBL111 58 15,0 13,4
Рисунок 2 - Полиморфизм гена манноза-связывающего лектина у голштинских первотёлок
По гену MBL1 выражено преимущество аллеля С над аллелем Т. Его частота среди исследованных животных составила 0,63. Среди изученных коров пре-
»-» хс
обладал гетерозиготный генотип МВЬ1 .
Генетическое равновесие в данной популяции крупного рогатого скота несколько находится в равновесии. Анализ ассоциации полиморфизма гена манноза-
связывающего лектина с молочной продуктивностью 387 первотёлок показал, что наибольшим удоем обладали коровы с гетерозиготным генотипом Их
удой составил в среднем 6425 кг молока. В отношении к сверстницам с генотипами MBL1CC и MBL1TT разница составила 320 кг (Р<0,01) и 157 кг молока, соответственно (таблица 2).
Таблица 2 - Влияние полиморфных вариантов гена манноза-связывающего лектина на показатели молочной продуктивности первотёлок_
Генотип Удой, кг Белок, % Выход белка, кг Жир, % Выход жира, кг Содержание соматических клеток, тыс./мл
М^1сс 61 6105 ±74,6 2,91 ±0,024 177,7 ±2,48 3,90 ±0,035 238,1 ±3,43 269,6 ±14,28
м^1тс 68 6425 ±98,3 3,00 ±0,021 192,8 ±3,19 3,89 ±0,031 249,9 ±4,07 283,6 ±13,70
MBL1TT 8 6268 ±139,7 2,88 ±0,046 180,5 ±4,67 3,84 ±0,046 240,7 ±5,83 279,4 ±23,83
MBL110 к MBL10С +320** +0,09** +15 1*** - 0,01 +11,8* +14,0
М^11С к MBL1ТГ +157 +0,12* +12,3* +0,05 +9,2 +4,2
* - P<0,05; ** - P<0,01, *** - P<0,001
По содержанию белка в молоке значительно превосходили особи с генотипом
ТС
. Их преимущество над коровами с другими генотипами составляло
0,09-0,12 % (Р<0,05-0,01). При этом по содержанию жира в молоке выгодно отлича-
СС
лись животные с генотипом MBL1 (3,90%). Они превосходили по этому
показателю сверстниц с другими генотипами на 0,01-0,06 %. Наибольшие показатели по выходу молочного белка и жира имели животные с генотипом
ТС
Они превосходили по этим данным первотёлок с другими генотипами М^1 на 12,3-15,1 кг (Р<0,05-0,001) и 9,211,8 кг, соответственно. Причём межгрупповая разница по выходу жира, составлявшая 11,8 кг (Р<0,05), была статистически достоверная. Содержание соматических клеток в молоке было в
пределах от 269,6 тыс./мл в группе коров с
сс
генотипом MBL1 ; до 283,6 тыс./мл в
ТС
группе сверстниц с генотипом MBL1 . У
ТТ
аналогов с генотипом MBL1 этот показатель был промежуточный (279,4 тыс./мл).
Заключение. Таким образом, по результатам сравнительного анализа первотёлок голштинской породы преимущество по основным показателям молочной продуктивности было у животных с геноти-
ТС
пом MBL1 Однако, по содержанию соматических клеток в молоке выгодно от-
СС
личались животные с генотипом MBL1 . ЛИТЕРАТУРА:
1. Кремянский, В.И. Генетические основы разведения крупного рогатого скота / В.И. Кремянский // Обзор иностр. лит. М.: 1965. - 199 с.
2. Ставикова, М. Методические рекомендации по контролю числа соматических клеток в молоке при селекции на ус-
тойчивость к маститу и качеству молока / М. Ставикова, Л. Ллойда // ВНИИ разведения и генетики с.-х. животных.-1990. - 32с.
3. Шамсиева, Л.В. Генотипирование ремонтного молодняка крупного рогатого скота для определения племенной ценности / Л.В. Шамсиева, Г.Р. Юсупова, Ф.Ф. Зиннатова // Ученые записки КГАВМ. -2015.- Т.223. - С. 243-248.
4. Agah, A. Isolation, cloning and functional characterization of porcine mannose-binding lectin / A. Agah, M.C. Montalto, K. Young, G.L. Stahl // Immunology. - 2011. - V. 102. - P. 338-343.
5. Bouwman, LH. Mannose binding lectin: The Dr. Jekyll and Mr. Hyde of the innate immune system / L.H. Bouwman // Thesis. In: Department of surgery, Leiden University. - Leiden, 2016. - P. 153.
6. Ip, W.K. Serum mannose-binding lectin levels and mbl2 gene polymorphisms in different age and gender groups of southern Chinese adults / W.K. Ip, Y.F. To, S.K. Cheng, Y.L. Lau // Scand. J. Immunol. -2004. - V. 59. - P. 310.
7. Karakolev, R. Experiments on immune prevention of mastitis in cows. Pt 1. Cytological studies / R. Karakolev, F. Filev // Med.weter.-2008. -V. 12. - N. 3-4. - P. 28-31.
8. Lillie, B.N. Comparative genetics and innate immune functions of collagenous lectins in animals / B.N. Lillie, A.S. Brooks, N.D. Keirstead, M.A. Hayes // Vet. Immunol. Immunopathol. - 2005. - V. 108. - P. 97-110.
ГЕН МАННОЗА-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЛЕКТИНА (MBL), И ВЛИЯНИЕ ЕГО ПОЛИМОРФИЗМА НА УСТОЙЧИВОСТЬ КОРОВ К МАСТИТУ
Абдуллина Л.В., Юсупова Г.Р. Резюме
Многочисленные исследования показывают, что некоторые гены ассоциируются с продуктивностью животных, качеством их продукции, а также с устойчивостью к различным заболеваниям. В частности, такой генотип гена, как манноза-связывающий лектин (MBL1) связан с молочной продуктивностью и качеством молока коров, а также с устойчивостью к маститам. Проведённые исследования ассоциации полиморфизма гена с
хозяйственно-полезными признаками коров показали, что аллели и генотипы по гену связаны с молочной продуктивностью, составом молока и содержанием соматических клеток в молоке. По результатам сравнительного анализа первотёлок голштинской породы преимущество по основным показателям молочной продуктивности было у животных с
TC
генотипом MBL1 . Однако, по содержанию соматических клеток в молоке выгодно
CC
отличались животные с генотипом MBL1 .
GENE MANNOSE BINDING LECTIN (MBL) AND ITS INFLUENCE OF POLYMORPHISM
ON RESISTANCE OF COWS TO MASTITIS
Abdullina L. V., Yusupova G. R.
Summary
Numerous studies show that some genes are associated with animal productivity, product quality, and resistance to various diseases. In particular, such gene genotype as mannose-binding lectin (MBL1) is associated with milk productivity and quality of cow milk, as well as with resistance to mastitis. Studies of the Association of MBL1 gene polymorphism with economically useful traits of cows showed that alleles and genotypes in mbll gene are associated with milk productivity, milk composition and somatic cell content in milk.
According to the results of the comparative analysis of Holstein heifers, the main indicators of milk productivity were the advantage in animals with the MBL1TC genotype. However, the content of somatic cells in milk favorably differed animals with genotype MBL1CC.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-238-2-9-13 УДК 619:616-085.37:636.4
ОТЕЧЕСТВЕННЫЙ ПРОБИОТИК СПОРОБАКТЕРИН И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА
ЗДРОВЬЕ МОЛОДНЯКА СВИНЕЙ В УСЛОВИЯХ СВИНОВОДЧЕСКОГО
КОМПЛЕКСА
Алексеев И.А. - д.в.н., профессор, Царевский И.В. - к.в.н., доцент, Варламова Н.Н. - ветеринарный врач
ФГБОУ ВО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»
Ключевые слова: естественная резистентность, молодняк свиней, пробиотик, Споробактерин, иммунологические показатели, общий белок, гамма-глобулины
Keywords: natural resistance, young pigs, probiotic, Sporobacterin, immunological parameters, total protein, gamma globulins
В последние годы, в ветеринарной медицине в связи с понижением лечебно-профилактической эффективности антибиотиков, исследователи создали ряд новых препаратов на основе пробиотических микроорганизмов. Чаще всего для этой цели используют штаммы спорообразую-щих бактерий рода Bacillus Subtilis и Bacillus Licheniformis [2].
Выявлено, что использование про-биотических препаратов и пробиотических кормовых добавок оказывает противомик-робное, антивирусное, иммуностимулирующее воздействие на организм животных, особенно на молодняк животных и птицы. Кроме того они способствуют профилактике многих болезней желудочно-кишечного тракта, повышению терапевтической эффективности, продуктивности
сельскохозяйственных животных и птиц [8]. Указанные штаммы микроорганизмов взаимодействуют с сообществом бактерий кишечника, выделяют метаболиты, влияющие на активность неспецифического иммунитета, гормональной, пищеварительной систем организма [3,7].
Представленные литературные данные свидетельствуют практическую значимость применения пробиотических препаратов.
По данным ученых и практиков, среди множества пробиотических кормовых добавок и пробиотических препаратов, по своей эффективности выделяется «Споробактерин», созданный научным объединение ООО «Бакорен» (г. Оренбург). В его состав входит взвесь живых бактерий штамма Bacillus Subtilis 534.
