CC BY
225. Каурова, З. Г. Влияние рыборазведения на химический состав воды озера Вельё в 2015-2021 гг / З. Г. Каурова, М. С. Петрова, Э. Н. Таймусова // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2021. - № 4. - С. 115-119.
6. Каурова, З. Г. Результаты многолетних исследований малых озер Новгородской области / З. Г. Каурова // Вестник науки и образования. - 2019. - № 20-1(74). - С. 17-19.
7. Приказ Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 13 декабря 2016 года № 552 «Об утверждении нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения»
8. РД 52.24.309-2016. Организация и проведение режимных наблюдений за состоянием и загрязнением поверхностных вод суши
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ RHIZOBIUM GALEGAE В
ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ
Картыжова Л.Е.
ведущий научный сотрудник лаборатории взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений
кандидат биологических наук Институт микробиологии НАН Беларуси КондрацкаяИ.П. старший научный сотрудник отдела биохимии и биотехнологии растений лаборатории клеточной биотехнологии Центральный ботанический сад НАН Беларуси
PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PROPERTIES AND FUNCTIONING FEATURES OF RHIZOBIUM GALEGAE NODULE BACTERIA UNDER EXTREME CONDITIONS
Kartyzhova L.
Leading Researcher of Laboratory ofplant-microbial interactions,
Ph.D. in biology Institute of Microbiology. NAS of Belarus Kondratskaya I.
Researcher
of Departament of biotechnology ofplants Central botanical Garden of NAS of Belarus DOI: 10.5281/zenodo.7049532
Аннотация
Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов играют определяющую роль при отборе наиболее активных штаммов для использования их в сельскохозяйственном и промышленном производстве и восстановления загрязненных объектов окружающей среды. Изучены физиолого-биохимические свойства штаммов клубеньковых бактерий Rhizobium galegae: способность штаммов клубеньковых бактерий к синтезу экзополисахаридов и Р-ИУК, термоустойчивость, толерантность к углеводородам нефти, способность использовать нефть в качестве единственного источника углерода, солеустойчивость, а также изучено влияние инокуляции семян клубеньковых бактерий R. galegae на синтез растительных белков. Отобраны наиболее перспективные штаммы R. galegae, обладающие спектром физиолого-биохимических свойств, обеспечивающих устойчивость и активность функционирования в экстремальных условиях. Установлено, что штаммы клубеньковых бактерий R. galegae в ассоциации с растением-хозяином Galega orientalis Lam. способствуют увеличению экспрессии белка, способствуют ускорению синтеза полипептидов с молекулярной массой 56,0кД и 12,ОкДРБФКО.
Abstract
Physiological and biochemical properties of microorganisms play a decisive role in the selection of the most active strains for their use in agricultural and industrial production and restoration of polluted environmental sites. Physiological and biochemical properties of Rhizobium galegae strains were studied: ability of rhizobia strains to synthesize exopolysaccharides and P-IUC, thermal stability, tolerance to oil hydrocarbons, ability to use oil as a single source of carbon, salt tolerance, and the effect of R. galegae seed inoculation on plant proteins synthesis was studied. The most promising strains of R. galegae possessing a spectrum of physiological and biochemical properties providing stability and activity of functioning under extreme conditions have been selected. It was found
that strains of R. galegae nodule bacteria in association with the host plant Galega orientalis Lam. increase protein expression, promote acceleration of polypeptide synthesis with molecular masses of 56.0 kD and 12.0 kDRBFCO.
Ключевые слова: Биотехнология, микробо-растительные ассоциации, галега восточная, клубеньковые бактерии, физиолого-биохимические свойства, экзополисахариды, гетероауксины, выживаемость, нефть, нефтепродукты, засоление, растительные белки.
Keywords: Biotechnology, microbial-plant associations, Galega orientalis Lam., nodule bacteria, physiological and biochemical properties, exopolysaccharides, heteroauxins, survival, oil, oil products, salinity, plant proteins.
В настоящее время загрязнение окружающей среды химическими веществами, разработка солевых месторождений, добыча соли, применение противогололедных химических средств для автомобильных дорог в зимний период наносят ощутимый вред. В связи с этим идет поиск эффективных экологически-безопасных методов восстановления почвы. Исследования, проводимые в данном направлении, сфокусированы на использовании микробо-растительных ассоциаций, обеспечивающих восстановление загрязненных химическими веществами почв и как следствие - окружающей среды. Полученные данные позволяют обосновать и успешно использовать с целью восстановления почв относительно новую технологию - фитореме-диацию. Она связана с очисткой загрязненных почв, путем использования растений, способных участвовать в превращениях загрязняющих веществ. По сравнению с другими технологиями фи-торемедиация — наиболее рентабельная экобио-технология. При ее использовании нет необходимости снимать загрязненный слой почвы, использовать большое количество сорбентов и биомассы микроорганизмов-деструкторов. Она применяется на последнем этапе очистки почвы [1-7].
Исследования по изучению и использованию многолетних бобовых трав в качестве фиторемеди-антов почв, загрязненных углеводородами нефти, ведутся продолжительное время. Установлено, что эффективность фиторемедиации увеличивалась за счет применения микробных препаратов на основе клубеньковых бактерий [8, 9].
Одной из перспективных сельскохозяйственных культур, используемых с целью решения данной проблемы, является малозатратная бобовая культура - галега восточная в симбиозе с клубеньковыми бактериями, растущая до 15 лет на одном месте, не требующая внесения минерального азота и дополнительных затрат на ее возделывание, повышающая плодородие бросовых земель за счет азотфиксирующей способности клубеньковых бактерий. Галега восточная на 2-ой год вегетации -это мощное растение с хорошо развитой корневой системой и обильной фитомассой (способна давать до 3 укосов за сезон с урожайностью зеленой массы до 1000 ц/га). Ее можно рассматривать не только как ценное кормовое растение (сено, витаминный высокобелковый зеленый корм с ранней весны) и культуру, повышающую плодородие почвы (за счет обогащения ее биологическим азотом), но и как фи-торемедиант, обеспечивающий очищение почвы от загрязняющих веществ. Высокая продуктивность Galega orientalis Lam. - эндемика Северного Кавказа обусловлена симбиотическими отношениями
со специфичными клубеньковыми бактериями R. galegae, которые в почвах Беларуси отсутствуют. В результате проведенной селекционной работы были выделены и отобраны эффективные штаммы клубеньковых бактерий R. galegae 1, 5, 8, депонированные в Белорусской Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под номерами: БИМ В-436Д (R. galegae 1), БИМ В-437Д (R. galegae 5), БИМ В-438Д R. galegae 8 (Картыжова Л.Е.). Выделение изолятов R. galegae осуществляли из клубеньков, сформировавшихся на корнях старовозрастных растений га-леги восточной (селекционный питомник БГСХА). Отбор наиболее перспективных штаммов проводили по максимальной функциональной активности (симбиотическая, конкурентная способность) и с учетом их агрономически-ценных физиолого-биохимических свойств. На основе отобранных штаммов R. galegae были разработаны микробные препараты Ризофос марки «Галега» (R.galegae 1) и Вогал (R.galegae 8) [10, 11, 12]. Изучение физио-лого-биохимических свойств штаммов R. galegae 1, 5, 8 позволило отметить их толерантность в отношении ингредиентов химической природы (13, 14, 15).
По литературным данным известно, что некоторые штаммы клубеньковых бактерий используют загрязняющие вещества в качестве единственного источника углерода и энергии, что позволяет с высокой эффективностью нейтрализовать угнетающее действие загрязнителей на естественные процессы самоочищения почвы и воды, восстановить метаболизм, активизировать аборигенную микрофлору и процессы почвообразования, аэрацию [16, 17]. Установлено ранее, что использование азот-фиксирующего комплекса R. galegae - G. orientalis Lam. на обедненных, затопленных и кислых почвах оказало положительный восстановительный эффект [18]. Отмечается, что одной из причин устойчивости клубеньковых бактерий в условиях загрязнения является их способность к синтезу полисахаридов (ЭПС) [19]. Микробные полисахариды являются биосорбентами тяжелых металлов. В связи с этим актуально использование клубеньковых бактерий в условиях фиторемедиации загрязненной почвы. К преимуществам этого способа относят его недеструктивный характер в отношении окружающей среды, возможность целенаправленного точечного и дозированного применения [20].
Некоторые авторы полагают, что микроорганизмы, выделяемые из загрязненной химическими веществами почвы, способны активно размножаться в экстремальных условиях [21]. Однако выживаемость выделенных, из загрязненных объектов
микроорганизмов не является неоспоримым доказательством их функциональной активности в экстремальных условиях. Применение таких микроорганизмов обогащает почву устойчивой к химическим ингредиентам микрофлорой, но не всегда приносит существенный положительный эффект в экстремальных условиях, так как они способны к выживанию, но не проявляют своей активности в направлении биоремедиации. Анализ научной литературы позволил сделать вывод, что определяющим фактором при отборе перспективных функционально активных штаммов - биодестукторов являются их физиолого-биохимические свойства (синтез полисахаридов, гнтероауксинов, термоустойчивость, высокая степень эмульгирования углеводородов нефти, активный рост в условиях засоленности), обеспечивающие деструктивную способность бактериальных культур в условиях нефтяного загрязнения [22-24].
Таким образом, можно, теоретически, предположить, что успешное использование микробо-рас-тительной ассоциации Galega orientalis Lam. - Rhi-zobium galegae в экстремальных условиях с целью восстановления загрязненных химическими ингредиентами почв - возможно при наличии у микросимбионтов (R. galegae) способности к синтезу данных веществ.
В связи с этим целью данных исследований было изучение физиолого-биохимических свойств штаммов R. galegae 1, 5, 8.
Синтез экзополисахаридов.
В экстремальных условиях и при дефиците питательных веществ (неплодородные, почвы, бросовые земли) cпособность микроорганизмов синтезировать экзополисахариды, которые являются энергетическим резервом клеток, способствует повышению адгезии на поверхности семян, корней и обеспечивают конкурентоспособность и выживаемость клубеньковых бактерий при интродукции в почву.
Изучение способности штаммов клубеньковых бактерий R. galegae синтезировать ЭПС (полимер октасахаридного звена) и выделять их в среду показало, что штаммы R. galegae 1, 5, 8 различаются как по количеству синтезируемых экзополисахаридов, так и качественным составом углеводов, входящим в их состав (рисунок 1). Так, установлено, что максимальное количество ЭПС синтезирует штамм R. galegae 5 (1,02 г/л). Необходимо отметить, что в составе полисахаридов, синтезируемых штаммами клубеньковых бактерий R. galegae, максимальное количество составляет глюкоза (от 76,9 до 78,44%) и галактоза (от 16,18 до 19,58%) (рисунок 2).
га
I-
Э а
R. galegae ^ ^^ 0,34
R. galegae 5 »+++++++++++++++++++++Д 1,02
х R. galegae 1
0,7
0,5
Количество экзополисахаридов,г/л
1,5
Арабиноза ксилоза
□ фруктоза манноза
« галактоза
□ глюкоза
4,07 2,85
16,18
□ фруктоза
□ манноза
s галактоза
□ глюкоза
0
1
Рисунок 1 - Количество экзополисахаридов (ЭПС), синтезируемых штаммами клубеньковых
бактерий R. galegae
R. galegae 1
R. galegae S
Я. galegae 8
Рисунок 2 - Состав ЭПС, синтезируемых штаммами Я. galegae
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что штаммы Я. galegae обладая способностью к синтезу ЭПС с максимальным количеством глюкозы в их составе обеспечивают высокую прикрепляемость и, тем самым, выживаемость бактерий на поверхности семян и при интродукции в почву.
Синтез гетероауксинов.
Установлено, что ростостимулирующая активность штаммов обусловлена способностью клу-
беньковых бактерий Я. galegae к синтезу гетероауксинов [25]. Максимальное количество Р-ИУК синтезируют штаммы Я. galegae 1 и 8: 31,5 и 65,7 мкг/г, соответственно, которое превышает контроль (эталон) на 15 и 141%. Синтез гетероауксинов исследуемыми штаммами клубеньковых бактерий способствует активации процессов фотосинтеза, что обеспечивает ростстимулирующий эффект растения-хозяина и, как следствие, будет способствовать повышению устойчивости растительного компонента в условиях загрязнения (таблица 1).
Таблица 1
Концентрация Р-ИУК, синтезируемой штаммами клубеньковых бактерий Я. galegae
Варианты опыта Количество Р-ИУК, синтезируемой штаммами клубеньковых бактерий % к эталону
Я. galegae 0704 (эталон) 27,3
Я. galegae 1 27,5 100
Я. galegae 5 31,5 101
Я. galegae 8 65,7 115
Термочувствительность.
Изучение температурных пределов выживаемости штаммов клубеньковых бактерий Я. galegae проводили в диапазоне температур от +4 до +50оС. В таблице 2 представлены данные об устойчивости штаммов Я. galegae и степени их выживаемости при разных температурных режимах.
Проведенные исследования показали, что наиболее чувствительными к пониженной и повышенной температуре были штаммы Я. galegae 1 и Я. galegae 8. Их численность в условиях пониженной температуры +4оС (холодильник): у штамма: Я. galegae 1 снизилась на 2 порядка по сравнению с исходным титром и составила 2,10х107КОЕ/мл, Я.
galegae 8 - на порядок и составила 5,66х107КОЕ/мл., тогда как количество жизнеспособных клеток Я. galegae 5 увеличилось на порядок (1,82х1010КОЕ/мл) в сравнении с исходным (8,73х109КОЕ/мл). Высокая температура (прогревание бактериальной суспензии на водяной бане при +500С) оказала ингибирующее действие на штаммы Я. galegae 1 и 8, их численность снизились на 2 и 1 порядка, соответственно, относительно исходных показателей, у штамма Я. galegae 5 численность клеток увеличилась на 108 %, что свидетельствует о его термоустойчивости, как в отношении низких, так и высоких температур.
Таблица 2
Термочувствительность штаммов клубеньковых бактерий R.galegae
Варианты опыта Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл при
+270С +40С +500С
Я. galegae 1 4,90±0,01х109 2,10±0,01х 107 1,8±0,08х107
Я. galegae 5 8,73±0,08х109 1,82±0,12• 1010 6,9± 0,32х1010
Я. galegae 8 2,95±0,21х108 5,66± 0,42 107 1,2 ±0,02х108
Данные, полученные при глубинном культиви- среде в течение 3-х суток при разных температур-ровании штаммов Я. galegae в жидкой бобовой ных режимах (+40С, +120С, +200С, +280С, +360С,
+500С) подтверждает ранее полученные данные.
При температуре культивирования +500С среди исследуемых штаммов клубеньковых бактерий наибольшая выживаемость клеток отмечалась у R. galegae 5, его численность была такой же, как и при +280С культивирования и составила 2,4±0,04х1010КОЕ/мл. Колонии, сформировавшиеся при ^С - (+50)0С морфологически не отличались от выросших при ^С - (+28) 0С.
Микроскопирование биообъектов ^. galegae 1,5,8) не выявило автолиза клеток. Необходимо отметить, что среди исследуемых штаммов клубеньковых бактерий наиболее термоустойчивым в ин-
тервале температур от +40С до +500С при кратковременных: экспозиции в холодильнике, прогревании при +500С, а также глубинном культивировании при разных температурных режимах является штамм R. galegae 5. Максимальный титр клеток (3,6х1011 КОЕ/мл) штамма установлен при 360С (температурный оптимум) (рисунок 3).
Таким образом, установлен температурный оптимум для активного размножения клубеньковых бактерий R. galegae и диапазон температур при котором культуры не теряют свою жизнеспособность.
и о
(О
а
50 36 28
р^ 20 (О
& 12
ш
(исходный титр)
ш
ш
0 5 10
Lg числа клеток
15
Rhizobium galegae 1
и
о
(О
а £
а а е
е
50 36 28 20 12 4
(исходный титр)
10,40
'i'i'i'i'i'i'i'i'i'i'i'i'i'i'i'i'm 928
Ü 9,34 9,41
3 8,73
5 10
Lg числа клеток
15
4
0
Rhizobium galegae 5
Lg числа клеток
Rhizobium galegae 8
Рисунок 3- Влияние температуры на выживаемость клубеньковых бактерий Rhizobium galegae при глубинном культивировании в жидкой бобовой среде
Углеводороды нефти.
В лабораторных условиях изучена устойчивость штаммов клубеньковых бактерий R. galegae 1, 5, 8 к углеводородам нефти: при непосредственном с ними контакте (агаризованная питательная среда, метод лунок) и глубинном культивировании в жидкой бобовой среде с использованием химических ингредиентов в качестве единственного источника углерода. В первом случае (при непосредственной близости с загрязняющими веществами) отмечался хороший рост у штамма R. galegae 1, обильный - у R. galegae 5 и 8 (таблица 3).
Для дальнейших исследований с целью определения способности клубеньковых бактерий га-леги использовать в качестве единственного источ-
ника нефть и продуктов ее переработки был отобран наиболее устойчивый к экстремальным условиям штамм Rhizobium galegae 5. В результате проведенных исследований была изучена динамики роста штамма клубеньковых бактерий Rhizobium galegae 5 при глубинном культивировании на среде Е-8 с единственным источником углерода (дизельное топливо, нефть) (таблица 4, рисунок 4, 5). Установлено, что штамм R. galegae 5 не подвержен негативному действию нефти, так как способен использовать ее и дизельное топливо в качестве единственного источника углерода и энергии. Деструктивная активность штамма в жидкой среде в течение 3-х месяцев составила 94,7 и 97,7% при концентрации нефти в 0,5 и 1,0% соответственно [26].
Таблица 3
Интенсивность роста штаммов R. galegae на агаризованной среде
Углеводороды Штаммы R. galegae
1 5 8
Нефть ++ +++ ++
бензол + ++++ +++
толуол ++ ++ ++
ксилол нефтяной - ++ ++
гексан ++ +++ ++
гексадекан ++ +++ +++
бензойная кислота - + -
дизельное топливо ++ +++ ++
фталевая кислота - - -
терефталевая кислота - - -
Примечание - Интенсивность роста: + + + +- обильный, + ++- хороший, ++- средний рост, + - слабый рост, - - отсутствие роста
Таблица 4
Динамика роста штамма клубеньковых бактерий R. galegae 5 на среде Е-8 с углеводородами нефти
Вариант опыта Период культивирования, час
0 24 48 72
0,5% сахарозы (контроль) 3,5 ± 0,56108 5,2±0,64108 1,09± 0,05-109 3,9±0,12108
0,5% дизельного топлива 6,97±1,16108 2,5±0,08108 1,20±0,06109 1,3±0,03 109
1,0% дизельного топлива 2,90±0,05 108 4,8±0,32108 1,03±0,08109 3,3±0,05 108
0,5% нефти 7,90±0,24 108 6,6±0,08 108 1,10±1,00109 1,4±0,08109
1,0% нефти 6,00±1,08108 7,7±1,20-108 1,70±0,02-109 1,5±0,96108
Рисунок 4 Выживаемость КЫюЫит ^а!е^ае 5 при культивировании в жидкой среде Е-8 с нефтью
I t
V
ЕнтГ^^1-1'11-'- JJ-ii'iiTn
Рисунок 5 - Выживаемость Rhizobium galegae
дизельным Выживаемость в условиях засоления. Изучена выживаемость штаммов R. galegae в условиях засоления. На основании полученных данных и имеющихся в научной литературе, свидетельствующих о способности бактериальных культур оптимально развиваться при 20 % концентрация №С1 в среде. Тестирование штаммов клубеньковых бактерий R. galegae на наличие и интенсивность роста при данной концентрации соли в среде показало положительный результат и
5 при культивировании в жидкой среде Е-8 с топливом
20% концентрация соли в питательной среде была использована в качестве контрольного варианта (таблица 5).
Степень устойчивости штаммов клубеньковых бактерий изучалась в непосредственном контакте с нерастворенной ее частью в жидкой бобовой среде в течение 20-ти суточного глубинного культивирования. Установлено, что после внесения клубеньковых бактерий в среду с солью исходный титр штам-
мов Я. galegae уменьшался на 2-3 порядка во всех вариантах опыта. В процессе дальнейшего культивирования реакция на повышенное содержание соли в жидкой бобовой среде у штаммов клубеньковых бактерий Я. galegae была разной. Установлено, что все
исследуемые концентрации №01 оказывали значимое влияние на активность функционирования клубеньковых бактерий
Таблица 5
Интенсивность роста штаммов клубеньковых бактерий Я. galegae на агаризованной питательной среде с
№0!
Концентрация №01 в питательной среде, % / содержание №01, г/л Штаммы R.galeg ae
1 5 8
20%раствор соли (25,1г/л) + + + + + + + + -
20,8% / 26,4г/л + + - + + + - + -
30,6% /44,1г/л + + - + + + - + -
46,8% /87,8г/л + + - + + + - + -
Примечание - Интенсивность роста: + + + - обильный рост, ++ - средний рост, + - слабый рост.
Я. galegae в среде с солью. На 3 сутки культивирования бактериальных культур в жидкой питательной среде с №01 отмечалась разная реакция исследуемых культур на присутствие соли в среде. На рисунке 6 представлено фото, на котором визуально отмечаются различия по интенсивности роста и обилию биомассы штаммов Я. galegae при
глубинном культивирование в жидкой бобовой среде и разных концентрациях №С1 (> 20%).У штамма Я. galegae 5 отмечается сплошной обильный рост, тогда как у штаммов Я. galegae 1 и 8 формируются отдельные колонии.
15 8
Штаммы Я. galegae
Рисунок 6 - Интенсивность роста штаммов Я. galegae при глубинном культивировании в жидкой
бобовой среде с NaCl (3-и сутки)
Необходимо отметить, что штаммы клубеньковых бактерий Я. galegae жизнеспособны в течение 20-ти суточного нахождения в непосредственной близости с нерастворенной частью соли, максимальная численность жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий отмечается у штамма Я. galegae 5 в варианте с применением №01 (46,8%) (таблица 6). Таким образом, следует отметить, что устойчивость штамма к высоким концентрациям соли и активное его функционирование в экстремальной среде может быть обусловлено наличием,
указанных выше, физиолого-биохимических свойств Я. galegae 5, что ускоряет его адаптационную способность в результате которой происходит восстановление осморегуляции в клетках штамма, что приводит в итоге к их активному росту и размножению [21]. Численность клеток штаммов Я. galegae 1 и 8 при данной концентрации соли соответствуют контрольному варианту (20% концентрация), что свидетельствует о выживаемости, но не об активности культур в условиях повышенной засоленности.
Таблица 6
Выживаемость штаммов Rhizobium galegae в условиях засоления_
Факторы влияния Титр клеток штаммов Rhizobium galegae, Lg числа клеток
1 5 8
Исходный (бактериальной суспензии) 9,69 9,94 8,47
После длительного хранения 6,0 7,2 5,9
Период культивирования, сутки
Концентрация соли в растворе при внесении 20 при внесении 20 при внесении 20
20 5,54 5,5 6,45 5,78 5,91 5,78
20,8 5,51 5,34 6,3 5,67 5,86 5,36
30,6 5,48 5,45 6,2 5,68 5,74 5,34
46,8 5,45 5,65 6,15 6,36 5,6 5,2
На рисунке 7 представлена графическая интерпретация устойчивости штаммов R. galegae к засолению. Культивирование клубеньковых бактерий в жидкой питательной среде в течение 20-ти суток в непосредственной близости с нерастворенной частью солью наглядно демонстрирует реакцию штаммов R. galegae на интродукцию в среду с разным содержанием соли в ней. Штамм R. galegae 1 после внесения в среду с солью (46,8% №С1) к 20-
ым суткам культивирования практически восстанавливает свою численность, незначительно превышая контрольные показатели (20% №С1), однако численность клеток штамма R. galegae 1 ниже, чем у R. galegae 5.
Штамм R. galegae 8 чувствителен ко всем исследуемым концентрациям №С1 в среде, как при внесении, так и через 20 суток культивирования. Установлено снижение численности штамма с увеличением концентрации соли.
Rhizobium galegae 1
6,4 6,2 Ü 6 И 5,8
5 5,6 ? 5,4 ы
-1 5,2 5 4,8
5,54 5,51
5,5
5,34
5,48
5,45
5,65
5,45
20 20,8 30,6 46,8
Концентрация раствора соли (NaCl)
|.| при внесении —♦—через 20 дней
6,4 6,2 6 5,8 5,6 5,4 5,2 5 4,8
Rhizobium galegae 5
20 20,8 30,6 46,8
Концентрация раствора соли (NaCl)
1 три внесении ♦ через 20 суток
Rhizobium galegae 8
6,4
6,2
as 6 о
§ 5,8 ae
to 5,6
5
5,4 5,2 5 4,8
7
Ш
5,91
5,86
5,74
5,34
5,6
rt
5,2
20 20,8 30,6 46,8
Концентрация раствора соли (NaCl)
при внесении через 20 суток
Рисунок 7 - Влияние концентрации ^С1 на численность клеток штаммов Я. galegae
Таким образом, изучение способности штаммов к выживанию в экстремальных условиях, позволяет рекомендовать наиболее устойчивые из них в качестве перспективных. Однако, важно понимать, что в ассоциации с растением, в экстремальных условиях данные штаммы должны будут играть не только деструктивную роль в отношении загрязнителей химической природы, но и посредством обменных процессов обеспечивать растению-хозяину устойчивость в экстремальных условиях.
Растительные белки.
Известно, что у сельскохозяйственных растений увеличивается устойчивость к стрессу за счет усиления накопления белка [27-38]. В связи с этим был изучен состав растительных белков при инокуляции семян клубеньковыми бактериями до образования клубеньков и на стадии нодуляции. Проведенные исследования показали, что в начале формирования клубеньков в листьях растений галеги в вариантах опыта с применением клубеньковых бактерий Я. galegae 1, 5, 8 установлены значительные изменения в количественном содержании пептидов по всему спектру в сравнении с контролем и вариантами с инокуляцией до образования клубеньков.
Рисунок 8 - Электрофореграмма легкорастворимых белков листьев галеги восточной Примечание: 1 - ЯИгюЬшт galegae 1 (с клубеньками); 6 - ЯИгюЬтт galegae 1 (до образования клубеньков); 2-ЯИ11вЬшт galegae 8 (с клубеньками); 3 - ЯИгюЬтт galegae 8 (до образования клубеньков); 4 - ЯИгюЬтт galegae 5 (до образования клубеньков); 5 - ЯИгюЬшт galegae 5 ( с клубеньками); 7 - Контроль (без инокуляции).
Анализ биохимических показателей по элек-трофоретическим спектрам легкорастворимых белков зеленой массы галеги восточной, показал, что инокуляция семян галеги восточной клубеньковыми бактериями штамма R. galegae 1 способствует усилению экспрессии белка в полипептиде с молекулярной массой 56,0 кД по сравнению контрольными образцами (без инокуляции), а также с отобранными - до образования клубеньков.
При сравнении денситограммы варианта опыта со штаммом Rhizobium galegae 5 и контроля (без инокуляции) экспрессия белка РБФКО увели-
чилась в 1,51 раза по сравнению с вариантом до образования клубеньков и 3,03 раза по сравнению с контролем. В варианте с инокуляцией установлено увеличение уровня белковых компонентов, особенно в полипептидах с молекулярной массой около 12 кД, которая соответствует малой субъединице. Инокуляция с применением штамма клубеньковых бактерий R. galegae 5 способствует экспрессии белков не только малой, но и большой субъединиц РБФКО, превышая синтез большой субъединицы РБФКО в 3,7 раз по сравнению с контролем и 1,4 раза по сравнению с вариантом до образования клубеньков (рисунок 9).
до нодуляции
R.galegae
в начале нодуляции
R.galegae 5 R.galegae 8
Рисунок 9 - Денситограммы легкорастворимых белков листьев галеги восточной Примечание: 1- до нодуляции, 2 - в начале нодуляции
Таким образом, инокуляция семян галеги восточной и особенно стадия формирования симбиоза «нодуляция», способствуют ускорению синтеза полипептидов с молекулярной массой 56,0кД и 12,0кДРБФК0.
В варианте с инокуляцией семян клубеньковыми бактериями на основе штамма Я. galegae 8 установлено максимальное увеличение экспрессии белка. Уровень синтезируемого мультифермента темновой реакции фотосинтеза за счет применения штамма Я. galegae 8 самый максимальный по сравнению со штаммами Я. galegae 1 и Я. galegae 5, что в 7,6 раз выше содержания его в варианте до образования клубеньков. Возможно, что штамм клубеньковых бактерий Я. galegae 8 обладает высокой лабильностью синтезируемых ферментов, что и обеспечивает их высокий уровень и высокую совместимость с растением - хозяином и определяет еще одно агрономически-ценное его свойство- отсутствие сортоспецифичности.
Анализ множественных и генетически полиморфных белков исходного растительного материала с применением предпосевной инокуляции позволил оценить ее влияние на уровень экспрессии белка в полипептиде и осуществить поиск источников новых ценных для растениеводства признаков и регистрации их в виде белковых формул. Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение уровня экспрессии белка, происходит за счет инокуляции семян клубеньковыми бактериями, что доказывает то, что применение инокуляции семян галеги восточной клубеньковыми бактериями Я.galegae 1, 5, 8 будет обеспечивать эффективность функционирования микробо-растительной ассоциации в экстремальных условиях (засуха, засоление, нефтяное загрязнение).
В результате проведенных лабораторных исследований и на основании, полученных и имею-
щихся в научной литературе, данных можно утверждать, что условием эффективного применения микробо-растительной ассоциации Rhizobium galegae: Galega orientalis Lam. в экстремальных условиях является наличии комплекса физиолого-биохимических свойств микросимбионта R. galegae (синтез экзополисахаридов, ß-ИУК; термочувствительность, толерантность к углеводородам нефти и использование их в качестве единственного источника углерода, солеустойчивость), обеспечивающих им активное функционирование в экстремальных условиях, деструкцию загрязняющих веществ и устойчивость растительного компонента
Список литературы
1. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв / Н.Б. Градова [et al.] // Прикл. биох. и микроб. -2003. — Т. 39. - №3. - С. 318-321.
2. Турковская, О.В. Биодеградация органических поллютантов в корневой зоне растений: Молекулярные основы взаимоотношений ассоциированных микроорганизмов с растениями / О.В. Турков-ская, А.Ю. Муратова; под ред. В.В. Игнатова. - М.: Наука, 2005. - С. 180-208.
3. Romantshuk, M. Plant root associated microbes in biomediation / M. Romantshuk // Bioremediation in the mycorrizosphere: Characterization of micorrhizal fungi and their associated biodegradative fluorescent Pseudo-monads: Proceedings of the Second Finnis Conference of Environmental Sciences «Environmental Research in Finland Today»; Helsinki, 1995 / Departament of Applied Chemistry and Microbiology, University of Helsinki; E. Saski, T. Saarinen (Eds.). - Microbiol. Public. - 1995. -№ 43. - P. 57 - 60.
4. Методические рекомендации по получению новых штаммов клубеньковых бактерий и оценке их эффективности / ВНИИСХМ; под ред. М. Доросин-ский. - Л, 1979. - 33 с.
5. Онищук, О.П. Гены, контролирующие ноду-ляционную конкурентоспособность клубеньковых бактерий и ее использование в селекции / О.П. Онищук., Б.В. Симаров // Генетика. - 1995. - Т. 31, № 3. -С. 293-303.
6. Методы общей бактериологии: в 3т. / под ред. Ф. Герхардта [и др.] - М.: Мир, 1983 - Т. 2. -470 с.
7. Петров, Д.Ф. Селекция и генетика микробов: сб. ст. / АН СССР, Сибир. Отд-ние, Биол. ин-т; редкол.: Д.Ф. Петров [и др.]. - Новосибирск: Наука, 1971. - 147 с.
8. Brewin, N. J. Cotribution of the symbiotic plas-mid to the competitiveness of Rhizobium leguminosarrum / N. J. Brewin, E. A. Wood, J. P. Young // J. Gen. Microbiol. - 1963. - Vol. 129, № 1. - P. 2973-2977.
9. Киреева, Н. А. Детоксикация нефтезагряз-ненных почв под посевами люцерны (Medicago sativa L.) / Н. А. Киреева, Е. М. Тарасенко, М. Д. Бакаева // Агрохимия. - 2004. - № 10. - С. 68-72. 3. Сту-пин, Д. Ю. Загрязнение почв и новейшие технологии их восстановления: учебное пособие / Д. Ю. Ступин. - СПб: Изд-во «Лань», 2009. - 432 с.
10. Картыжова Л.Е., Алещенкова З.М./ Пути создания и применения энергосберегающей технологии производства микробного удобрения для возделывания галеги восточной // Ресурсо- и энергосберегающие технологии и оборудование, экологически безопасные технологии: материалы междунар. науч.-техн. конф, Минск, 24-26 ноября 2010 г.: сб. докладов в 2 ч. / М-во обр-ния РБ, УО «Белорус. гос. технологичский ун-т»; редкол.: И.М. Жарский (гл. ред.) [и др.] - Минск, 2010. - Ч. 1. - С. 300-303;
11. Картыжова Л.Е., Алещенкова З М., Бу-шуева В.И., Довнар И.А./ Биопрепарат Вогал и эффективность его применения // Сшьськогоспо-дарська мжробюлопя: здобутки та перспективи: зб. наук. праць (до 50^ччя ввд дня заснування 1н-ту с.-г. мжробюлогп НААН) / Нац. акад. аграрних наук Украши, 1н-т с.-г. мжробюлогп; редкол.: В.В. Вол-когон (ввд. ред.). - Чершпв: ЦНП, 27-30 сентября 2011. - С. 305-315.
12. Картыжова Л.Е./ Физиолого-биохимиче-ские свойства Rhizobium galegae, обеспечивающие продуктивность галеги восточной // Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология: материалы междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых, Брянск, 26 апреля - 8 мая 2010г. / ГОУ ВПО Брянский государственный Университет им. акад. И.Г. Петровского, Комитет по науке, Администрации Брянской области, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, «Национальный ботанический сад им. Н.Н. Гришко» НАН Укараины, Факультет сельского хозяйства и пищевых наук Западно-Венгеского университета. -Брянск: ООО "Ладомир", 2010. - С. 61-66.
13. Картыжова Л.Е. /Выживаемость Rhizobium galegae на протравленных семенах галеги восточной сорта "Нестерка»// Защита растений: Стратегия и тактика защиты растений: сб. науч. тр. / РУП «Институт защиты растений» НАН Беларуси; редкол.:
Л.И. Трепашко [и др.]. - Минск: Ин-т защиты растений НАН Беларуси, 2006. - Вып. 30, ч.1. - С. 237239. ред.) [и др.]. - Гродно, 2009. - С. 146-149.
14. Картыжова Л.Е., Алещенкова З.М. / Изучение устойчивости клубеньковых бактерий Rhizobium galegae к углеводородам нефти // Актуальные проблемы экологии - 2009: материалы V Междунар. науч.-практ. конф., Гродно, 21-23 окт. 2009 г. / М-во обр-ния Респ. Беларусь, УО «Гродн. гос. ун-т им. Я. Купалы»; редкол. И.Б. Заводник (отв. ред.) [и др.]. - Гродно, 2009. - С. 146-149.
15. Федоров, С.Н. Получение мутантов с измененными симбиотическими свойствами у Rhizo-bium meliloti под действием УФ-лучей / С.Н. Федоров, Б.В. Симаров // С.-х. биология. - 1987. - №9. -С. 44-49.
16. Картыжова Л.Е., Алещенкова З.М. Перспективы использования R. galegae в технологии фиторемедиации загрязненой почвы / Л.Е. Карты-жова, З.М. Алещенкова / / Сахаровские чтения 2010 года: экологические проблемы XXI века: материалы 10-й Междунар. науч. конф., Респ. Беларусь, Минск, 20-21 мая 2010 г.: в 2 ч. / М-во обр-ния РБ, М-во природных ресурсов и охраны окруж. среды, Департамент по ликвидации последствий катастрофы на Чернобыльской АЭС, М-во по чрезвычайным ситуациям РБ, Постоянная комиссия по радиологическому обр-нию стран СНГ, БРФФИ, Ил-линойский университет (Чикаго, США), УО «МГЭУ» им. А.Д. Сахарова; под. ред. С.П. Кундаса, С.Б. Мельнова, С.С. Позняка. - Минск: МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2010. - Ч. 1. - С.304.
17. Bioremediation in the rhizosphere / T.A. Anderson, [et al.] // Environ. Science and Technology. -1993. - V. 27. - P. 2630-2636
18. Araujo, R.S. A hydrophobic mutant of Rhizobium etli altered in nodulation competitiveness and growth in the rhizhosphere / R.S. Araujo, E.A. Robleto, J.A. Handelsman // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - Vol. 60. - P. 1430-1436
19. Robleto, E.A. Effects of bacterial antibiotic production on rhizosphere microbial communities from a culture-independent perspective/ E.A. Robleto, Borneman, E.W. Triplett // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64. - P. 5020-5022
20. Н. И. Наумович, З. М. Алещенкова, И. Н. Ананьева, Г. В. Сафронова/Выделение и идентификация микроорганизмов, устойчивых к засолению// Весщ Нацыянальнай акадэми навук Беларуа. Се-рыя бiялaгiчных навук, 2022. - Т. 67, No1. - C. 5465
21. Безбородов, А.М. Ферментативные процессы в биотехнологии / А.М. Безбородов, Н.А. За-густина, В.О. Попов. - Москва, 2008 г. - С. 204-205.
22. Oren, A. Diversity of halophilic microorganisms: environments, phylogeny, physiology, and applications / A. Oren // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 2002. - Vol. 28. - P. 56-63
23. Бегун, А., Якименко, М.В. Клубеньковые бактерии сои в Приамурье / С.А. Бегун, М.В. Якименко // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - № 2. - С. 25-26.
24. Бойко, Л.Н Урожайность и белковая продуктивность форм сои северного экотипа в зависимости от активности штамма ризобий: автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.01.09 / Л.Н. Бойко; Моск. с.-х. акад. им. К.А.Тимирязева. - М., 1993. - 22 с.].
25. Kartyzhova L.E. Создание высокоэффективной экологически и экономически -ценной мик-робо-растительной системы: Rhizobium galegae:Galega orientalis Lam // Human and nature safety 2010: proceedings of the 16th international scientific conf., Kauno, 12-14 May, 17-19 June 2010: 2 part / Lithuanian University of Agricalture; Editorial board: R. Deltuvas [et. al.]. - Akademija (Kauno r.), 2010. - Part 2. -P. 143-146.
26. Штамм бактерий Rhizobium galegae БИМ В- 437Д для повышения урожайности Galega orientalis. Картыжова Л.Е., Алещенкова З.М. // Патент BY № 13575. - 0публ.03.09.2008г.
27. Andronov, E.E. Effect of host plant on the genetic diversity of a natural population of Sinorhizobium meliloti / E.E. Andronov [et al.] // Russ. J. Genet. -1999. - Vol. 35. - P. 1169-1176.
28. Andronov, E.E. Genetic diversity of a natural population of Sinorhizobium meliloti revealed in analysis of cryptic plasmids and ISRm 2011-2 fingerprints / E.E. Andronov [et al.] // Russ. J. Genet. - 2001. - Vol. 37. -P. 494-499.
29. Bromfield, E.S.P. Relative genetic structure of a population of Rhizobium meliloti isolated directly from nodules of alfalfa (Medicago sativa) and sweet clover (Melilotus alba) / E.S.P Bromfield, L.R. Barran, R. Wheatcroft // Mol. Ecol. - 1995. - Vol. 4. - P. 183-188.
30. Hartman, A. Genotypic diversity of Sinorhizo-bium (formerly Rhizobium) meliloti strains isolated from a soil and nodules of alfalfa (Medicago sativa) grown in the same soil / A. Hartman, J. J. Giraud, G. Catroux // FEMS Microb. Ecol. - 1998 - Vol. 25. - P. 107-116.
31. Wernegreen, J.J. Rhizobium gone native: unexpected plasmid stability of indigenous Rhizobium le-guminosarum / J.J. Wernegreen, E.E. Yarding, M.A. Riley // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1997. - Vol. 94. - P.5483-5488.
32. Young, J.P.W. Rhizobium population genetics: enzyme polymorphism in Rhizobium leguminosarum from plant and soil in a pea crop. // Appl. Environ / J.P.W. Young, L. Demetriou, R.G. Apte // Microbiol. - 1987. -Vol. 53. - P. 397-402.
33. Lindstrom, K. Metabolic properties, maximum growth temperature and phage sensitivity of Rhizobium sp. (Galega) compared with other fast-growing rhizobia / K. Lindstrom, S. Lehtomaki // FEMS Microbiol. - 1988. - Lett. 50. - P. 277-287.
34. Новикова, Н.И. О характере взаимодействия клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium galegae с бобовыми растениями / Н.И. Новикова, В.И. Сафро-нова, Е.А. Павлова // C-х. биология. - 1992. - Т. 5, № 5. - С. 105-109.
35. Selenska-Trajkova, S. Comparison between Rhizobium galegae and R. meliloti plasmid contents / S. Selenska-Trajkova, G. Radeca, K. Markov // Lett. Appl. Microbiol. - 1990. - Vol. 10. - P. 123126.
36. Влияние природных и гибридных лектинов и взаимодействие бобовых растений с ризобиями/ И.И. Губайдуллин [и др.] // Прикл. биох. и микроб.
- 2009. - Т. 45, № 1. - С. 84-91.
37. Углеводсвязывающие пептиды лектинов бобовых растений в связи с их различной хозяйской специфичностью при образовании симбиоза с клубеньковыми бактериями / Ал. Х. Баймиев [и др.] // Генетика. - 2001. - № 37. - Р. 215-222.
38. Kinkle, B.K. Transfer of the Pea Symbiotic Plasmid pJB5JI in Nonsterile Soil / B.K. Kinkle, E.L. Schmidt // Appl. Environ. Microbiol. - 1991. - Vol. 57, № 11.
- P. 3264-3269.
