CC BY
190
19. Demple B. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 1999. - Vol. 26. - P. 64-68.
20. Di Cagno R., Buchin S., de Candia S. et al. // J. Dairy Sci. - 2006. -Vol. 90. - P. 2689-2704.
21. Gusarov I., Nudler E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102, N 39. - P. 13855-13860.
22. Ilinskaya O. N., Zelenikhin P. V., Petrushanko I. Y. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 361, N 4. - P. 1000-1005.
23. Leschinskaya I. B., Kupriyanova F. G., Yakovlev G. I. et al. // Karadeniz J. Med. Sci. - 1995. - Vol. 8, N 4. - P. 218-219.
24. Makarov A. A., Kolchinsky A., Ilinskaya O. N. // BioEssays. - 2008. - Vol. 30. - P. 781-790.
25. MalyshevI. Yu, Malugin A. V, GolubevaL. Yu. et al. // FEBS Lett. -1996. - Vol. 391. - P. 21-23.
26. MayerM. P., BukauB. // Cell Mol. Life Sci. - 2005. - Vol. 62. - P. 670-684.
27. Shatalin K., Gusarov I., Avetissova E. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 105. - P. 1009-1013.
28. SikoraA., GrzesiukE. // J. Physiol. Pharmacol. - 2007. - Vol. 58. - P. 43-62.
Поступила 09.06.11
INDUCTION OF THE NO SYNTHESIS IN LACTOBACILLI UNDER STRESS CONDITIONS
O. A. Smolentseva, D. R. Yarullina, O. N. Ilinskaya Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
An increase in the nitric oxide (NO) biosynthesis in Lactobacillus plantarum 8P-A3 cells takes place under strong stress influence, which leads to a considerable decrease in the microbial cell viability: heating at 70oC and 80oC, prolonged cultivation, toxic effect of hexylresorcinol. The factors, which do not lead to cell death, such as heating at 60oC, 50 ^g/ml homoserine lactone, Bacillus intermedius 7P ribonuclease (binase) in concentrations up to 300 ^g/ml, do not induce NO synthesis. The activation of the NO biosynthesis in response to stress treatment evidences to universality of key-mechanisms of stress response in cells differing in the level of their organization as well as to important role of nitric oxide in them.
Key words: nitric oxide (NO), Lactobacillus plantarum, high-temperature stress, homoserine lactone, hexylresorcinol, ribonuclease Bacillus intermedius 7P (binase).
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.841.31:579.25].083.1
Ан. Х. Баймиев1, Е. С. Иванова1, К. Г. Птицын1, А. А. Белимов2, В. И. Сафронова2,
Ал. Х. Баймиев1
генетическая характеристика клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых южного урала
1Лаборатория молекулярной биологии и нанобиотехнологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН; Лаборатория ризосферных микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Российской академии
сельскохозяйственных наук, ГНУ, г Пушкин
Исследованы генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с 18 видами дикорастущих бобовых растений Южного Урала из 8 родов, принадлежащих 4 трибам: Loteae, Genisteae, Galegeae, Hedysareae. Показано, что для дикорастущих видов триб Galegeae и Hedysareae характерно симбиотическое взаимодействие с различными штаммами клубеньковых бактерий, филогенетически близких бактериям рода Mesorhizobium, для видов трибы Genisteae - бактериям рода Bradyrhizobium. Из трибы Loteae у Lotus ucrainicus в клубеньках обнаружены ризобии, филогенетически близкие бактериям рода Mesorhizobium, а у Coronilla varia полученные нами штаммы были близки по последовательности гена 165 рРНК к Rhizobium sp. В клубеньках некоторых видов исследованных растений обнаружены также минорные виды ризобий, на состав которых большое влияние имеет условие произрастания хозяйского растения.
Ключевые слова: ризобии, клубеньковые бактерии, бобовые растения, симбиоз, филогения, генетическое разнообразие
Бобовые растения в природных экосистемах играют огромную роль. За счет своей уникальной способности вступать в симбиоз с азотфиксирующими клубеньковыми бактериями они имеют возможность обеспечивать азотом не только себя, но и обогащать им почву, на которой они произрастают, и тем самым влиять на ее плодородие. Продуктивность бобовых культур, их урожай, накопление ими биологического азота в значительной степени зависят от характера взаимоотношений макро- и микросимбионтов. Зависимость бобовых растений, особенно дикорастущих, от клубеньковых бактерий велика, поскольку мутуалистический симбиоз с микроорганизмами предоставляет им дополнительные возможности для выживания в условиях дефицита азота. В то же время симбиотрофные бактерии также получают преимущество над свободно-живущими бактериями, так как в обмен на доступный
азот растение предоставляет им продукты фотосинтеза и экологическую нишу. Образование взаимовыгодного симбиоза приводит к приобретению симбиотической системой новых адаптивных свойств, которыми не обладают симбионты по отдельности [6].
В ходе длительной совместной эволюции бобовых растений и клубеньковых бактерий возникла система сигнального взаимодействия между симбионтами, обеспечивающая специфическое узнавание партнеров и ведущая к их генетической интеграции [8]. Уровень специфичности взаимодействия бобовых с ризобиями у разных видов различается. Для примитивных тропических бобовых характерна низкая специфичность, тогда как эволюционно молодые бобовые умеренного климата проявляют высокую избирательность при выборе сим-биотических партнеров, вплоть до абсолютно строгой специфичности для некоторых из них, проявляющейся в способности вступать в симбиоз только с определенными видами клубеньковых бактерий. Классическим примером такого взаимодействия является симбиоз козлятника восточного Galega orientalis с Rhizobium galegae.
Ареал распространения дикорастущих бобовых умеренной зоны в связи с их тесной взаимосвязью с клубеньковыми бактериями и относительно высокой специфичностью их взаимодействия определяется не только подходящими условиями существования для растений, но и наличием в данной почве "подходящих" ризобий.
Мы исследовали генетическое разнообразие и филогению клубеньковых бактерий 18 видов дикорастущих бобовых Южного Урала, относящихся к 4 трибам (8 родам), собранных с клубеньков растений, которые произрастают в своих естественных ареалах.
Материалы и методы
В анализ были взяты штаммы клубеньковых бактерий из клубеньков l8 видов дикорастущих бобовых растений Южного Урала: лядвенеца украинского (Lotus ucrainicus Klokov), вязеля разноцветного (Coronilla varia L.), дрока красильного (Genista tinctoria L.), ракитника русского (Chamaecytisus ruthenicus (Fisch. ex Vorosch.) Klask.), караганы кустарниковой (Caragana frutex (L.) C.Koch), астрагала датского (Astragalus danicus Retz.), астрагала длинноножкового (Astragalus macropus Bunge), астрагала рогоплодного (Astragalus cornutus Pall.), астрагала волжского (Astragalus wolgensis Bunge), астрагала Гельма (Astragalus helmii Fisch.), астрагала нутового (Astragalus cicer L.), остролодочника грязноватого (Oxytropis sordida (Willd.) Pers.), остролодочника Ипполита (Oxytropis hippolyti Boriss.), остролодочника волосистого (Oxytropis pilosa (L.) DC), остролодочника яркоцветного (Oxytropis floribunda (Pall.) DC), остролодочника колосистого (Oxytropis spicata (Pall.) O. Fedtsch. & B. Fedtsch.), копеечника крупноцветкового (Hedysarum grandiflorum Pall.), копеечника Разумовского (Hedysarum razoumowianum Fisch. & Helm ex DC.) (табл. l). Клубеньки собирали с корней растений, произрастающих в разных районах Республики Башкортостан, до начала и во время цветения. Бактерии из клубеньков выделяли следующим образом. Поверхность клубеньков последовательно стерилизовали 2 мин в 70% растворе этилового спирта и 2 мин в растворе 10% гипохлорита натрия. Затем клубеньки многократно отмывали стерильной водопроводной водой. Стерильными иглами от одноразовых шприцев на 5 мл снимали кожицу с дистальной части клубенька. Затем другой стерильной иглой делали соскоб содержимого клубенька и высевали на твердую питательную среду JM (0,1% дрожжевой экстракт, 1% маннит, 0,05% К2НРО4, 0,05% MgSO4, 0,01 NaCl, 1,5% агар).
ДНК из бактерий выделяли лизированием клеток в l% Triton Х100 и 1% суспензии Chelexl00. Для этого в 1,5 мл пробирки со 100 мкл 1% Triton Х100 и 1% суспензии Chelexl00 помещали небольшое количество бактериальной массы и после суспензи-рования инкубировали при температуре 95°C в течение 10 мин. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 12 000 g в течение 3 мин. Надосадочную жидкость брали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПЦР проводили на амплификаторах МС2 "Терцик" компании "ДНК-технология" (Россия) и "T1 Thermocycler" фирмы "Biometra" (Германия) с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК.
Генетическое разнообразие собранных штаммов исследовали с помощью RAPD-анализа (Random Amplified Polymorphic DNA) [23] с использованием следующих "случайных" праймеров: 1,5'-GGGCGCTG-3'; 2,5'-CAGGCCCATC-3'; 3,5'-GCGTCCATTC-3'; 4,5'-ACGGTGGACG-3'.
ПЦР-ПДРФ-анализ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) [15] гена 16S рРНК проводили с использованием мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции Kzo9l и HaeIII. Для амплификации гена 16S рРНК использовали праймеры Y1 (5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3') [25] и Y3 (5'-TACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC-3') [11], фланкирующие фрагмент гена размером около 1400 п. н.
Таблица 1
Последовательности праймеров для определения симбиотических генов
Филогенетический анализ исследуемых штаммов проводили на основании данных множественного выравнивания секвениро-ванных фрагментов генов 16S рРНК, также амплифицированных с использованием праймеров Y1 и Y3. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы "Applied Biosystems, Inc." (США) с помощью наборов "Big Dye Terminator v.3.1".
Амплификацию симбиотических генов проводили с использованием праймеров, указанных в табл. 1 [9].
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью пакета компьютерных программ "Lasergene" фирмы "DNASTAR, Inc." (США).
Поиск сходных последовательностей в базе данных генов GenBank проводили с помощью программы "Megablast", доступной на веб-сайте NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и с использованием базы данных RDP (http://rdp.cme.msu.edu).
Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК исследованных штаммов депонированы в Международном банке данных нуклеотидных последовательностей под следующими номерами: JM80100- JM80123, #0441184- #ß441189, HQ540580-HQ540583.
№ Наименование Последовательность Размер ожидаемого ПЦР-продукта
1 nifH f2 TAYGGNAARGGGGGGATYGGYAAGTC 430
nifH r3 TCGCCGGACATGACGATGTAGAT
2 nifD fl TCGGACTTCCAGGAAAAGGACAT 520
nifD r2 CCGWACTTYTCTTCCATGTGGC
3 lut5af AGAAAATAGCAAGAAAGAGG 619
lUTarl AAHATGGATKRGGACCGTCGTG
Результаты и обсуждение
C целью исследования генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых Южного Урала были выделены чистые культуры ризобий из клубеньков растений, относящихся к 4 трибам: Loteae, Genisteae, Galegeae, Hedysareae (см. табл. 1), собранных с корней растений, которые произрастали в их естественных ареалах. Исключение составил A.wolgensis, клубеньковые бактерии которого были получены из клубеньков растений, выращенных на светоплощадке. От каждого вида растения получено от 3 до 10 штаммов. Генетическое разнообразие штаммов определяли методом RAPD-анализа, который выявил разную степень гетерогенности штаммов внутри симбионтов отдельных видов растений. Среди симбионтов таких видов бобовых, как Lotus ucrainicus, Astragalus danicus, A. cicer, A. macropus, A. cornutus, A. helmii, Oxytropis sordida, O. hippolyti, O. pilosa, O. floribunda, Hedysarum grandiflorum, внутривидового полиморфизма RAPD-профилей не обнаружили. В связи с этим у данных видов растений для дальнейшего исследования были оставлены по 1 штамму клубеньковых бактерий, поскольку полное совпадение RAPD-профилей по нескольким произвольным праймерам предполагает их идентичность (рис. 1).
В то же время у видов бобовых, микросимбионты которых отличались полиморфностью ДНК, выделили дополнительное количество штаммов клубеньковых бактерий для более полного исследования. Так, у Coronilla varia количество штаммов было доведено до 24, у Genista tinctoria - до 18, у Caragana frutex - до 54.
Для того чтобы определить филогенетические отношения штаммов ризобий, провели 165" ПДРФ-анализ с использованием мелкощепящих рестриктаз Kzo91 и НаеШ. Для этого симбионты каждого вида растения также анализировали отдельно. Выявили, что в состав симбионтов некоторых исследуемых растений входят филогенетически разнородные бактерии. Так, например, в составе симбионтов Caragana frutex и Genista tinctoria обнаружили по 5 монофилетических групп, а в составе выделенных микросимбионтов Coronilla varia,
= sPS =
Рис. 1. Электрофореграмма RAPD-анализа ДНК штаммов микроорганизмов из клубеньков Astragalus helmii (а) и Coronilla varia (б)
с использованием праймера последовательностью 5'-GGGCGCTG-3'.
L.......с
-с
tí
d
BKBAH5 (Astragalus helmii) (JN180111)
Mesorhizobium plurifarium (DQ100068) BKBAMa (Astragalus macropus) (JN180113) BKBACo3 (Astragalus cornutus) (JN180112) BKBOSo2 (Oxytropis sórdida) (JN180122) Mesorhizobium huakuii (D13431) BKBCF3g (Caragana frutex) (HQ540582) Mesorhizobium mediterraneum (AY 195 843) BKBOSpl3 (Oxytropis spicata) (JN180123) BKBACÍ8 (Astragalus cicer) (JN180114) Mesorhizobium tianshanense (AF041447) BKBOHil (Oxytropis hippolyti) (JN180121) BKBLUk2 (Lotus ucrainicus) (JN180119) Mesorhizobium ciceri (AY904731) 2-2 (Astragalus danicus) (JN180101) BKBOPÍ7 (Oxytropis pilosa) (JN180120) Mesorhizobium loti (D14514) 2-1 (Astragalus danicus) (JN180100) 12-1 (Hedysarum razoumovianum) (JN180109)
12-2 (Hedysarum razoumovianum) (JN180110) Mesorhizobium alhagi (EU169578)
13-1 (Hedysarum grandiflorum) (JN180108) 13-2 (Hedysarum grandiflorum) (JN180102) D1 (Oxytropis floribunda) (JN180106)
C2A (Chamaecytisus ruthenicus) (JN180104) C2B (Chamaecytisus ruthenicus) (JN180103) Phyllobacterium ifriqiyense (AY785325) BKBCF5 (Caragana frutex) (HQ540583) Phyllobacterium bourgognense (AY785320) Phyllobacterium brassicacearum (AY785319) BKBGT13 (Genista tinctoria) (HQ441186) BKBGT4 (Genista tinctoria) (HQ441185) Phyllobacterium myrsinacearum (D12789) Phyllobacterium leguminum (AY785322) BKBCV9 (Coronilla varia) (JN180117) BKBGT18 (Genista tinctoria) (HQ441188) BKBGT16 (Genista tinctoria) (HQ441189) BKBGT15 (Genista tinctoria) (HQ441187) BKBCF51 (Caragana frutex) (HQ540584) BKBCV6.1 (Coronilla varia) (JN180118) BKBCF31 (Caragana frutex) (HQ540581) Rhizobium etli (AY 117630) Rhizobium leguminosarum (D14513) Agrobacterium rhizogenes (X67232) Rhizobium tropici (D11344) Rhizobium gallicum (AY509211) Rhizobium mongolense (U89817) Agrobacterium vitis (D12795) Rhizobium galegae (D11343) Agrobacterium tumefaciens (D12784) Sinorhizobium fredii (D14516) Sinorhizobium meliloti (D14509) BKBAW6 (Astragalus wolgensis) (JN180115) Sinorhizobium terangae (X68388) 11B (Hedysarum razoumovianum) (JN180107) CI (Chamaecytisus ruthenicus) (JN180105) BKBGT6 (Genista tinctoria) (JN180116) Bradyrhizobium elkanii (AF237422) Bradyrhizobium japonicum (AY904732) BKBCF21 (Caragana frutex) (HQ540580)
Рис. 2. Дендрограмма нуклеотндных последовательностей генов 16S рРНК бактерий семейства Rhizobiaceae, построенная с помощью программы MegAlign пакета Lasergene ("DNASTAR Inc.", США).
На горизонтальной оси приведено количество замен нуклеотидов на 100 оснований. а - штаммы, филогенетически близкие к роду Mesorhizobium, б -Phyllobacterium, в - Rhizobium, г - Bradyrhizobium (пояснения в тексте).
Chamaecytisus ruthenicus и Hedysarum razoumowianum - по 2. С целью сокращения количества исследуемых образцов для дальнейшего филогенетического исследования из каждой монофилетической группы также оставили по 1 штамму.
Для определения филогенетического положения исследуемых штаммов клубеньковых бактерий секвенирова-ли нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК бактерий размером примерно по 1400 п.н. и провели их сравнительный анализ с уже известными аналогичными последовательностями из базы данных GenBank и RDP (http://rdp.cme.msu.edu/). На филогенетическом древе, построенном на основании сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК (рис. 2), взятые в анализ штаммы образуют 4 отдельных кластера. Штаммы, входящие в группу А, филогенетически оказались близки к роду Mesorhizobium, в группу Б - к Phyllobacterium, в группу В - к Rhizobium, в группу Г - к Bradyrhizobium. Наиболее представленной является группа А, в которую вошли симбионты всех исследованных бобовых трибы Galegeae и Hedysareae, а также ри-зобии Lotus ucrainicus. Группу Б составили симбионты Chamaecytisus ruthenicus, Caragana frutex и Genista tinctoria, группу В - симбионты Coronilla varia, Caragana frutex, Genista tinctoria, группу Г - симбионты Chamaecytisus ruthenicus, Caragana frutex, Genista tinctoria, Hedysarum razoumowianum (табл. 2).
Наличие симбиотических генов у штаммов определяли методом ПЦР. В качестве кандидатов для анализа выбрали активно участвующие в образовании азотфиксирующего симбиоза гены: NifD - ген а-белка динитрогеназы, NifH - ген у-белка редуктазы динитрогеназы, NodA - ген ацилпереносящего белка, присоединяющего жирную кислоту к нередуцирующему гликозамину при синтезе Afoi-фактора. Данный анализ провели, поскольку некоторые авторы показали, что в клубеньках бобовых могут
Таблица 2
Состав и генетическая характеристика клубеньковых бактерий из клубеньков дикорастущих видов бобовых растений
Растение-хозяин Количество выде- Количество групп штаммов, Предполагаемый вид бактерий и их Наличие
ленных штаммов гомогенных по 168-ПДРФ процентное соотношение симбиотических генов
Триба Loteae:
Lotus ucrainicus 5 1 Mesorhizobium loti +
Coronilla varia 24 2 Rhizobium leguminosarum +
Триба Genisteae:
Genista tinctoria 18 5 Bradyrhizobium sp. 61%% Rhizobium sp. 22,3%% Phyllobacterium sp. 1ö,70% + +
Chamaecytisus 5 2 Bradyrhizobium sp. 60% +
ruthenicus Phyllobacterium sp. 40%% +
Триба Galegeae:
Caragana frutex 54 5 Mesorhizobium sp. 58% Rhizobium sp. 18% Phyllobacterium sp. 18% Bradyrhizobium sp. ö0% + + +
Astragalus danicus 10 1 Mesorhizobium sp. +
A. macropus 10 1 То же +
A. cornutus 3 1 " " +
A. wolgensis 10 1 Ensifer sp. +
A. helmii 10 1 Mesorhizobium sp. +
A. cicer 10 1 То же +
Oxytropis sordida 5 1 tt tt +
O. hippolyti 5 1 tt tt +
O. pilosa 5 1 tt rt +
O. floribunda 5 1 rt tt +
O. spicata 4 1 tt tt +
Триба Hedysareae:
Hedysarum grandiflorum 5 1 Mesorhizobium sp. +
4 2 Mesorhizobium sp. 75% Bradyrhizobium sp. 25% +
H. razoumowianum +
обнаруживаться бактерии, не имеющие симбиотиче-ские гены и являющиеся по сути оппортунистическими бактериями, которые заражают растение совместно с другими штаммами бактерий [10]. В нашем случае почти у всех анализируемых штаммов были обнаружены симбиотические гены. Исключение составили некоторые штаммы Phyllobacterium, у которых стандартными праймерами не удалось амплифицировать искомые гены.
В последнее время появляется большое количество работ, посвященных исследованию горизонтального переноса симбиотических генов и его влияния на специфичность и азотфиксирующую активность клубеньковых бактерий. В связи с этим мы секвенировали нуклеотидные последовательности фрагментов генов М/И и провели их сравнительный анализ с уже известными аналогичными последовательностями, депонированными в GenBank. Выявили, что в основном филогенетическое положение исследуемых образцов по последовательностям генов т/И и 16Б рРНК совпадают, кроме 1 штамма. Так, у штамма 11В, полученного из клубенька И. razoumowianum, отметили несоответствие по филогении данных генов. По последовательности рибосомального гена данный штамм близок к Bradyrhizobium, а последовательность гена т/И имеет выраженную гомологию с аналогичными генами Mesorhizobium. Также интересными в этом плане явля-
ются штаммы из группы Б, по последовательности гена 16S близкие к роду Phyllobacterium. Данные штаммы обнаружены нами в клубеньках кустарниковых видов бобовых: Chamaecytisus ruthenicus, Caragana frutex и Genista tinctoria. Примечательно то, что симбиотические гены мы выявили только у штамма С2А, у которого ген nifH имеет высокую гомологию с аналогичными генами, ранее описанными у Bradyrhizobium. У других представителей данной группы, как уже упоминалось, амплифицировать симбиотические гены стандартными праймерами не удалось.
Таким образом, состав исследованных микросимбионтов, взятых в анализ дикорастущих видов бобовых Южного Урала, оказался довольно разнообразным. Тем не менее каждый вид растения, как было обнаружено, характеризуется наличием доминирующего вида клубеньковых бактерий. У исследуемых видов бобовых, относящихся к трибам Galegeae и Hedysareae, микросимбионты оказались филогенетически близки к роду Mesorhizobium (группа А), которые на филогенетическом древе внутри своей группы образуют отдельные подгруппы. Так, отдельную подгруппу образуют симбионты A. helmii и A. macropus, которые по последовательности 16S рРНК оказались более близки к виду Mesorhizobium plurifarium. Вторая подгруппа, образованная A. cornutus и Oxytropis sordida, оказалась более близка к Mesorhizobium
huakuii, симбионты Caragana frutex и Oxytropis spicata - к Mesorhizobium mediterraneum, симбионты A. cicer и O. hippolyti - к Mesorhizobium tianshanense, симбионты Lotus ucrainicus, Astragalus danicus и O. pilosa - к Mesorhizobium loti. Клубеньковые бактерии растений рода Hedysarum (Hedysarum grandiflorum и H. razoumowianum) и Oxytropis floribunda внутри группы А образуют отдельную ветвь. По последовательности 165 данные бактерии похожи на недавно описанный вид Mesorhizobium alhagi, штаммы которого первоначально выявлены в клубеньках Alhagi sparsifolia [23]. Кишиневски (Kishinevsky) и соавт. подобные бактерии также обнаружили у H. coronarium и H. spinosissimum (AF279889).
А вот основными симбионтами растений трибы Genisteae - Chamaecytisus ruthenicus и Genista tinctoria оказались бактерии, филогенетически близкие к Bradyrhizobium elkanii (см. рис. 2).
Между симбионтами растений Lotus ucrainicus и Coronilla varia, относящихся к одной трибе Loteae, имелись заметные (11,6-11,9% дивергенции) филогенетические отличия. Обнаружено, что микросимбионты Lotus ucrainicus по последовательности 165 рибосомального гена близки к Mesorhizobium cicer, а микросимбионты Coronilla varia - к Rhizobium sp., что кстати объясняет высокую гетерогенность полученных у данных растений штаммов при их филогенетической однородности. Дело в том, что, как было обнаружено нами, например у симбионтов чины весенней [3], клубеньковые бактерии рода Rhizobium часто характеризуются разным плазмидным составом.
Кроме доминирующих видов микросимбионтов, у некоторых бобовых также были найдены и минорные виды, составляющее меньше одной трети штаммов, полученных из клубеньков данного растения. Например, у Caragana frutex были также обнаружены клубеньковые бактерии, филогенетически близкие к Rhizobium sp., Phyllobacterium sp. и Bradyrhizobium sp., у Genista tinctoria - к Rhizobium sp. и Phyllobacterium sp., у H. razoumowianum - к Bradyrhizobium sp.
В распределении минорных видов ризобий у Caragana frutex и Genista tinctoria четко прослеживается зависимость от условий произрастания хозяйского растения. Так, например, в степной зоне и на южных склонах Caragana frutex предпочитает вступать в симбиоз с Mesorhizobium sp. и Bradyrhizobium sp., а растения, произрастающие в лесных и парковых зонах, где почва менее прогревается и более увлажнена, - с Mesorhizobium sp. и Rhizobium sp. Подобная картина наблюдается и у Genista tinctoria, у которой в прогреваемых почвах в клубеньках обнаруживаются только Bradyrhizobium sp., а в лесных зонах - еще и Rhizobium sp. Данное явление, как мы предполагаем, связано с различной приспособленностью видов бактерий к некоторым почвенным условиям. Так, известно, что для большинства штаммов Rhizobium оптимальная температура наибольшей азотфиксирующей продуктивности в симбиозе с бобовыми растениями находится в пределах 24-26 C, а при повышении температуры выше 30C резко снижается [7], что и является, скорее всего, причиной их отсутствия в клубеньках растений, произрастающих в прогреваемых сухих почвах. Phyllobacterium sp. в клубеньках данных растений обнаруживался во всех случаях.
Весьма примечательным оказался выделенный из клубенька копеечника Разумовского минорный штамм 11В. Дело в том, что данный штамм по последовательности гена 16S рРНК близок к Bradyrhizobium, но содержит ген nifH, имеющий большую гомологию с аналогичными генами, которые описаны у Mesorhizobium. Если учесть тот факт, что основными симбионтами у H. razoumowianum, по нашим данным, являются бактерии рода Mesorhizobium, то можно предположить, что штамм 11В приобрел симбиотические гены данных бактерий посредством горизонтального переноса генов, это придало ему способность вступать в симбиоз с этим растением. Но тот факт, что данный штамм является минорным, позволяет говорить о том, что подобная генетическая комбинация менее конкурентоспособна или сформировалась совсем недавно. Физиолого-биохимические свойства данного штамма еще предстоит исследовать.
Также в этом плане весьма интересны штаммы, относящиеся к Phyllobacterium sp. Данные бактерии, описанные впервые Кнозелем как бактерии, образующие клубенекподобные структуры на листьях некоторых тропических растений [14], в клубеньках дикорастущих бобовых умеренного климата встречаются довольно часто [1, 19, 21]. В данной работе Phyllobacterium найдены в клубеньках кустарниковых видов бобовых: Chamaecytisus ruthenicus, Caragana frutex и Genista tinctoria. Ранее подобные бактерии мы выявили в клубеньках Onobrychis arenaria [1], Caragana arborescens [2], Lathyrus gmelinii [4]. Тем не менее симбиотиче-ские гены обнаружены нами в этой работе только у штамма С2А (Chamaecytisus ruthenicus), ген nifH которого имеет высокую гомологию с аналогичными генами, описанными у штаммов Bradyrhizobium. Ранее симбиотические гены также были выявлены нами у штаммов из клубеньков Lathyrus gmelinii, у которых гены nifH и nodA соответствовали таковым R. leguminosarum bv. viceae [5]. У остальных штаммов амплифицировать фрагменты симбиотических генов стандартными праймерами не удалось. Симбиотиче-ские гены также не были обнаружены у Phyllobacterium и в работах некоторых других авторов [10, 17]. Роль данных бактерий в симбиотических взаимоотношениях ризобий с бобовыми растениями остается неясной и является предметом дальнейших исследований.
Необходимо также отметить, что штаммы, полученные нами из клубеньков растений, которые относятся к трибам Galegeae и Hedysareae, в основном филогенетически близки к различным видам рода Mesorhizobium. Из литературы известно о том, что растения Astragalus, Oxytropis и Hedysarum не являются строгими симбионтами и способны вступать в симбиоз со штаммами, относящимися к Mesorhizobium, Rhizobium, Ensifer (Sinorhizobium) и Bradyrhizobium [12, 13, 16, 18, 20, 22, 26]. Возможно, большую роль в данном случае сыграли условия произрастания растений, при которых были собраны клубеньки, - щебнистые почвы и в основном прогреваемые южные склоны. По-видимому, Mesorhizobium более приспособлен к таким условиям существования. В пользу этого говорит и тот факт, что у A. wolgensis, выращенного из семян, которые собраны с растений, произрастающих в сходных с другими растениями данного рода условиях, на покупном грунте все выделенные штаммы из клубеньков
по последовательности 16S рРНК оказались близкородственны Ensifer (Sinorhizobium) meliloti и к тому же на проверку успешно заражали Medicago sativa. Это говорит о более широком симбиотическом потенциале данных растений и значительном влиянии их условий произрастания и обсемененности почвы различными штаммами на их взаимоотношения с клубеньковыми бактериями.
Таким образом, в условиях Южного Урала ризобии рода Mesorhizobium являются основными симбионтами дикорастущих видов растений трибы Galegeae, Hedysareaeu и вида Lotus ucrainicus, принадлежащего трибе Loteae, а ризобии рода Bradyrhizobium - дикорастущих видов трибы Genisteae. Кроме того, в зависимости от условий произрастания отдельные виды бобовых способны также вступать в симбиоз с некоторыми другими, не свойственными им видами клубеньковых бактерий.
В заключение также нужно отметить, что исследования ризобий дикорастущих бобовых растений - это ключ к пониманию и выявлению устоявшихся в течение тысячелетий в данных почвенно-климатических условиях симбиотических отношений между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями, которые, по сути, являются наиболее приспособленными и конкурентоспособными в данных условиях. К тому же некоторые виды бобовых, взятые в анализ, являются краснокнижными, и знания об их микросимбионтах сделает возможным в дальнейшем применять искусственную инокуляцию для восстановления их популяций.
Авторы выражают глубокую благодарность В. И. Сафроновой за помощь в получении чистых культур ризобий из клубеньков дикорастущих бобовых растений.
Данная работа выполнялась при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 гг.» (госконтракт № 16.518.11.7095).
Сведения об авторах: Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Баймиев Андрей Ханифович - ст. науч. сотр., e-mail: [email protected].
Иванова Е. С. - аспирант. Птицын К. Г. - аспирант. Баймиев Ал. Х. - ведущий науч. сотр. Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, ГНУ, г. пушкин
Белимов А. А. - зав. лабораторией. Сафронова В. И. - зав. отделом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баймиев Ал. Х., Баймиев Ан. Х., Губайдуллин И. И. и др. // Генетика. - 2007. - Т. 43, № 5. - С. 716-719.
2. Баймиев Ан. Х., Птицын К. Г., Баймиев Ал. Х. // Микробиология. - 2010. - Т. 79, № 1. - С. 123-128.
3. Баймиев Ан. Х., Птицын К. Г., Благова Д. К. и др. // Микробиология. - 2011. - T. 80, № 1. - С. 160-168.
4. Баймиев Ан. Х., Птицын К. Г., Мулдашев А. А., Баймиев Ал. Х. // Экол. генетика. - 2011. - № 2. - С. 3-8.
5. Баймиев Ан. Х., Иванова Е. С., Птицын К. Г. и др. // Молекул. генетика. - 2011. - № 4. - C.
6. Жуков В. А., Штарк О. Ю., Борисов А. Ю., Тихонович И. А. // Генетика. - 2009. -Т 45, № 11. - С. 1449-1460.
7. Мишустин Е. Н., Шильникова В. К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. - М., 1973.
8. Тихонович И. А., Борисов А. Ю., Цыганов В. Е. и др. //Успехи соврем. биол. - 2005. - Т. 125, № 3. - С. 227-238.
9. Andam C. P., ParkerM. A. // Appl. Environ. Microbiol. -2007. - Vol. 73, N 17. - P. 5687-5691.
10. BromfieldE. S. P., Tambong J. T., CloutierS. et al. // Microbiology. -2010. - Vol. 156. - P. 505-520.
11. Brosius J., Dull T. J., Sleeter D. D., Noller H. F. // J. Mol. Biol. -1981. - Vol. 148. - P.107-127.
12. Han T. X., WangE. T., WuL. J. et al. // Int. J. Sys. Evol. Microbiol. -
2008. - Vol. 58. - P. 1693-1699.
13. HouB. C., WangE. T., Li Y. et al. // Microb Ecol. -2009. - Vol. 57. -P.69-81.
14. Knosel D. H. // Zbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. -1962. - Bd 116. - P. 79-100.
15. Laguerre G., MavinguiP., AllardM.R. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1996. - Vol. 62, N 6. - P. 2029-2036.
16. Laguerre G., Berkum P. V., AmargerN. L., PrevostD. // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, N 12. - P. 4748-4758.
17. LeiX., WangE. T., Chen W. F. et al. // Arch. Microbiol. - 2008. - Vol. 190. - P.657-671.
18. Liu Y., SuiX. H., Chen W. X. // Acta Ecol. Sinica. -2005. - Vol. 5.
19. Mantelin S., Saux M. F., Zakhia F. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2006. - Vol. 56, N 4. - P. 827-839.
20. SuiX. H., HanL. L., WangE. T. et al. // Sci. China Ser. C-Life Sci. -
2009. - Vol. 52, N 2. - P. 182-192.
21. Valverde A., Velazquez E., Fernandez-Santos F. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2005. - Vol. 55, N 5. - P. 1985-1989.
22. Wei G. H., Zhang Z. X., Chen C. et al. // Microbiol. Res. - 2008. -Vol. 163, N 6. - P. 651-662.
23. Weia G., Chena W., Young P. W., Bontemps C. // Syst. Appl. Microb. - 2009. - Vol. 32. - P. 8-16.
24. Williams J. G., Kubelik A. R., Livak K. J. et al. // Nucl. Acids Res. -1990. - Vol. 18, N 22. -P. 6531-6535.
25. Young J. P. W., DownerH. L., Eardly B. D. // J. Bacteriol. - 1991. -Vol. 173. -P.2271-2277.
26. Zhao C. T., Wang E. T., Chen W. F., Chen W. X. // FEMS Microbiol. Lett. - 2008. - Vol. 286. - P. 263-273.
Поступила 27.07.11
GENETIC CHARACTERIZATION OF WILD LEGUMINOUS NODULAR BACTERIA LIVING IN THE SOUTH URALS
An. K. Baymiev', E. S. Ivanova', K. G. Ptitzyn', A. A. Belimov2, V. I. Safronova2, Al. K. Baymiev'
1 Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center,
Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia
2 All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Russian Academy of Agricultural Sciences, Pushkin, Russia
Genetic diversity and phylogeny of rhizobia that nodulate 18 species of wild-growing bean plants of South Urals from 8 genera belonging to 4 tribes (Loteae, Genisteae, Galegeaev andHedysareae) was studied. It was demonstrated that for the wild-growing plants of Galegeae and Hedysareae tribes symbiotic interaction with various strains of nodule bacteria that closely related to bacteria of Mesorhizobium sp. was typical of the plants of Genisteae tribe - to bacteria of Bradyrhizobium sp. In the nodules of Lotus ucrainicus from Loteae tribe we have found a rhizobium that is closely related to the bacteria of Mesorhizobium sp., and at Coronilla varia rhizobia strains obtained by us were close by sequence of a 16S рК^ gene to Rhizobium sp. In the nodules of some kinds of the investigated plants we found also minor species of a rhizobia, which structure is under the great influence of conditions of the host plant growth. Key words: rhizobia, nodular bacteria, bean plants, symbiosis, phylogeny, genetic diversity.
