CC BY
11
https://doi.org/l0.17816/ecogen17805
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЭНДЕМИЧНЫХ ДЛЯ ЮЖНОГО УРАЛА ВИДОВ РОДА OXYTROPIS (FABACEAE)
© Ан.Х. Баймиев, А.А. Владимирова, Е.С. Акимова, Р.С. Гуменко, А.А. Мулдашев, А.В. Чемерис, Ал.Х. Баймиев
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Уфимский федеральный исследовательский центр Российской академии наук, Уфа
Для цитирования: Баймиев Ан.Х., Владимирова А.А., Акимова Е.С., и др. Филогенетическая характеристика клубеньковых бактерий эндемичных для Южного Урала видов рода Oxytropis (Fabaceae) // Экологическая генетика. - 2020. - Т. 18. - № 2. - С. 157-167. https://doi.org/l0.17816/ ecogen17805.
Поступила: 18.11.2019 Одобрена: 06.04.2020 Принята: 23.06.2020
& Проведен анализ полиморфизма и филогении клубеньковых бактерий эндемичных для Южного Урала четырех видов бобовых растений рода Oxytropis секции Orobia: O. kungurensis, O. baschkiriensis, O. approximata, O. gmelinii, характеризующихся пространственной разобщенностью мест произрастания, также называемой сегрегацией растений. Показано, что несмотря на определенные филогенетические различия бактерий, все они относятся к роду Mesorhizobium. Анализ симбиотических генов исследуемых штаммов на основании сравнительного анализа последовательностей генов nifH и nodC выявил определенные различия их филогении с коровой частью генома. Обнаружено, что микросимбионты растений O. baschkiriensis по филогении гена nodC отличаются от ризобий, полученных из клубеньков других изученных видов рода Oxytropis и близки к микросимбионтам растений рода Lupinaster, произрастающих на Южном Урале. Приобретение свойства вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями, характерными для растений рода Lupinaster, могло быть следствием сегрегации O. baschkiriensis от других родственных видов рода Oxytropis.
& Ключевые слова: ризобия; симбиоз; Oxytropis; филогения; симбиотические гены.
PHYLOGENETIC CHARACTERISTIC OF NODUL BACTERIA ENDEMIC FOR SOUTHERN URAL
SPECIES OF THE GENUS OXYTROPIS (FABACEAE)
© An.Kh. Baymiev, A.A. Vladimirova, E.S. Akimova, R.S. Gumenko, A.A. Muldashev,
A.V. Chemeris, Al.Kh. Baymiev
Institute of Biochemistry and Genetics — Subdivision of the Ufa Federal Research Centre
of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia
Cite this article as: Baymiev AnKh, Vladimirova AA, Akimova ES, et al. Phylogenetic characteristic of nodul bacteria endemic for Southern Ural species of the genus Oxytropis (Fabaceae). Ecological genetics. 2020;18(2):157-167. https://doi.org/l0.17816/ecogen17805.
Received: 18.11.2019 Revised: 06.04.2020 Accepted: 23.06.2020
& Background. An analysis of the spatial distribution of some taxonomically and ecologically related legumes in the Ural showed a nontrivial spatial distribution of related species of the genus Oxytropis DC of the Orobia Bunge section within the Uchalinsky uplands. Despite the similarities in ecology, these species practically do not grow together. Explicit spatial segregation of closely related plants over a relatively small area allows this phenomenon to be used as a convenient model for studying the effect of segregation of closely related legume species on the genetic composition of their nodule bacteria. Materials and methods. The genetic diversity of nodule bacteria entering into symbiosis with O. kungurensis, O. baschkiriensis, O. approximata and O. gmelinii plants was studied. In addition, the polymorphism of their symbiotic genes has also been analyzed. Results. Phylogenetic characteristics of nodule bacteria endemic for the Southern Ural belonging to 4 species of leguminous plants of the genus Oxytropis of the section Orobia: O. kungurensis, O. baschkiriensis, O. approximata, O. gmelinii which are characterized by spatial separation of the growth sites, also called plant segregation, are given. It was shown that all of them belong to the genus Mesorhizobium despite certain phylogenetic differences of bacteria. Analysis of the symbiotic genes of the analyzed strains revealed a lack of congruence of their phylogeny with the core part of the genome. It was found that the microsymbionts of O. baschkiriensis plants differ in the phylogeny of nod-genes from nodule bacteria of other plants of the Oxytropis genus and are close to microsymbionts of plants of the Lupinaster genus growing in the Southern Urals. Conclusion. Acquisition of the property to enter into symbiosis with nodule bacteria of plants of the genus Lupinaster may turn out to be an adaptive mechanism that arose as a result of segregation of O. baschkiriensis from other species of Oxytropis.
& Keywords: rhizobia; symbiosis; Oxytropis; phylogeny; symbiotic genes.
ВВЕДЕНИЕ
Клубеньковые бактерии (ризобии) — обширная, генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и обеспечивать фиксацию атмосферного азота.
В ходе продолжительной совместной эволюции бобовых растений и ризобий возникла сигнальная система взаимодействия между симбионтами, обеспечивающая специфическое узнавание партнеров и ведущая к их генетической интеграции [1]. Для бобовых умеренных широт, где обитают наиболее специализированные и эволюционно молодые представители подсемейства мотыльковых, характерно высокоспецифичное взаимодействие по типу «групп перекрестной инокуляции», при котором ризобии определенного вида или даже биотипа вступают в эффективный симбиоз с представителями лишь определенного рода или нескольких близких родов растений [2]. Такое повышение специфичности взаимодействия партнеров эволюционно сопровождалось с одной стороны увеличением азотфиксирующей активности [3], с другой — увеличением зависимости бобовых растений от своих микросимбионтов. Поэтому на ареал распространения дикорастущих бобовых умеренной зоны в связи с их тесной взаимосвязью с клубеньковыми бактериями и относительно высокой специфичностью их взаимодействия наряду с эдафическими и климатическими факторами не исключено и влияние микробиома почвы [4, 5].
Анализируя особенности пространственного распределения некоторых таксономически и экологически близких видов бобовых растений на Урале, М.С. Князевым [5] был отмечен ряд нетривиальных случаев, объяснение которых может пролить свет на пространственное распределение этих растений. Наиболее четко своеобразие отмечаемого феномена проявляется на примере пространственного распределения близких видов рода Oxytropis DC секции Orobia Bunge в пределах Учалинского мелкосопочника, который представляет серию невысоких предгорных пологих хребтов, подножье которых покрыто редколесья -ми, а вершины заняты участками горных степей. Таким образом, произрастающие здесь степные виды, приуроченные большей частью к вершинам
холмов, представлены серией обособленных популяций. Учалинский мелкосопочник — флористически оригинальная территория; ряд видов уральской флоры произрастает только или преимущественно в пределах этого района, в том числе есть узкие эндемики Учалинского мелкосопочника. Только здесь отмечается перекрывание ареалов сразу пяти видов (в том числе одного гибридогенного) рода Oxytropis секции Orobia: O. kungurensis Knjasev subsp. demidovii (Knjasev) Knjasev (далее O. kungurensis), O. baschkiriensis Knjasev subsp. skvortsovii Knjasev (далее O. baschkiriensis), O. approximata Less., O. gmelinii Fisch. ex Boriss., O. spictata (Pall.) O. et B. Fedtach., O. x lessingiana Knjasev. Данные таксоны являются экологическими двойниками, растут в сходных сообществах. Несмотря на сходство экологии, эти виды практически не произрастают совместно. Данное явление было обозначено под термином сегрегации растений. В качестве весьма характерного примера сегрегации следует привести распределение местонахождений двух видов O. baschkiriensis и O. gmelinii на участке мелкосопочника, обрамляющем правобережье р. Урал на протяжении 20 км долины севернее устья р. Миндяк. Непосредственно близ устья р. Миндяк на небольших холмах отмечается произрастание только O. Gmelinii; 2 км севернее, на сопке Туйтюбе (575 м), в тех же условиях — только O. baschkiriensis, на соседней сопке с Туйтюбе — только O. approximata; еще 2—4 км севернее на ряде вершин хр. Улутау произрастает O. gmelinii [5].
Явная пространственная сегрегация близкородственных растений на относительно небольшой территории делает возможным использовать это явление в качестве удобной модели для исследования влияния пространственной разобщенности близкородственных видов бобовых на генетический состав их клубеньковых бактерий.
Цель работы — проверка генетических различий ризобий, полученных из клубеньков близкородственных видов остролодочников, подверженных сегрегации.
В связи с этим нами было исследовано генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с растениями O. kungurensis, O. baschkiriensis, O. approximata, O. gmelinii и проведен анализ филогении их сим-
биотических генов nifH (кодирует структуру белков нитрогеназы) и nodC (кодирует структуру коровой части молекулы Nod-фактора, участвующего в сигналинге при образовании клубеньков).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы и условия культивирования
В работе были использованы изоляты клубеньковых бактерий, выделенные из клубеньков растений O. kungurensis, O. baschkiriensis s. l., O. approximata, O. gmelinii, произрастающих на Южном Урале в районе Учалинского мелкосопоч-ника.
Бактерии из клубеньков изолировали методом получения пункций из зоны размножения бактерий и рассевом ее на питательной агаризованной среде YM (0,1 % дрожжевой экстракт, 1 % маннит, 0,05 % К2НРО4, 0,05 % MgSO4, 0,01 % NaCl, 1,5 % агар) до отдельных колоний [6]. Из каждого клубенька получали по одной чистой культуре бактерий. Предварительную проверку изолятов на принадлежность их к группе клубеньковых бактерий проверяли методом ПЦР-анализа наличия гена nifH, характерного для всех видов ризобий.
Выделение тотальной ДНК
ДНК из бактерий выделяли методом термокоагуляции. Для этого в пробирки объемом 1,5 мл со 100 мкл 1 % Triton X100 и 1 % суспензии смолы Chelex100 (Bio-Rad, США) помещали небольшое количество бактериальной массы и после суспен-зирования инкубировали при температуре 95 °C 10 мин. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 12 000 g в течение 3 мин. Надосадочную жидкость брали в качестве матрицы для ПЦР.
Генетический анализ штаммов
Генетическое разнообразие собранных штаммов исследовали с помощью RAPD-анализа (Random Amplified Polymorphic DNA) [7] с использованием следующих «случайных» праймеров: 1) 5'-gggcgctg-3'; 2) 5'-caggcccatc-3'; 3) 5'-gcgtccattc-3'. Данный анализ также позволил сократить количество образцов, за счет объединения микроорганизмов с идентичными RAPD-профилями в гомогенные группы, из которых в последующем в работу брали только по одному образцу.
ПЦР-ПДРФ-анализ (полиморфизм длин ре-стрикционных фрагментов) [8] гена 16S рРНК проводили с использованием мелкощепящих эн-донуклеаз рестрикции Kzo91 и HaeIII. Для амплификации гена 16S рРНК были использованы универсальные праймеры fD1 5'-cccgggatccaagct taaggaggtgatccagcc-3', rD1 5'-ccgaattcgtcgacaaca gagtttgatcctggctcag-3', фланкирующие фрагмент гена размером около 1500 п. н. [9], для амплификации генов recA были использованы праймеры RecAF 5'-ggcagttcggcaagggctcgat-3' и RecAR5'-atctggttgatgaagatcaccat-3', для амплификации генов nifH — NifHF 5'-ttctatggaaagggcggcattggcaa gct-3' и NifHR5'-atctcgccggacatgacgatataaatttc-3', для амплификации генов nodC — NodCF 5'-cgttt cgtcttatgcggtgctc-3' и NodCR5'-cagctgcgtctcgtatt gat-3' [10].
Определение нуклеотидных последовательно-стей проводили на автоматическом секвенато-ре Applied Biosystems 3500 фирмы Applied Biosystems, Inc. (США) с использованием наборов Big Dye Terminator v.3.1.
Филогенетический анализ
Филогенетический анализ исследуемых штаммов осуществляли на основании множественного выравнивания (ClustalW) секвенированных фрагментов генов 16S рРНК, recA, nodC и nifH. Построение филогенетических деревьев производили с помощью программы Megalign из пакета программ Lasergene c использованием метода «neighbor-joining» (NEIGHBOR). Нуклеотидные последовательности для сравнительного анализа были взяты из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm. nih.gov). Статистическую достоверность ветвления («bootstrap-анализ») оценивали с использованием соответствующей функции программы Megalign на основе 1000 альтернативных деревьев.
Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК, recA, nodC и nifH исследованных штаммов депонированы в базе GenBank под следующими номерами: MK402237-MK402258, MK511967-MK511971, MK511979, MK511980.
Опыты по перекрестной инокуляции
Анализ клубенекобразующей способности штаммов на корнях исследуемых видов растений проводили методом предпосевной инокуляции семян.
Обработанные суспензией бактерий (3—7 х х 106 КОЕ/мл) семена высаживали в отдельные горшочки со стерильным песком. Через 30—40 дней корни растений анализировали визуально на наличие образовавшихся клубеньков. Опыты проводили в 5-кратной повторности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования генетического разнообразия микросимбионтов с корней исследуемых растений, произрастающих на территории Южного Урала, были собраны клубеньки, из которых были изолированы чистые культуры ризобий. Так, из клубеньков 19 растений O. approximata были получены 32 чистые культуры бактерий, из клубеньков 28 растений O. baschkiriensis 56 культур, из клубеньков 8 растений O. Kungurensis — 16, и из клубеньков 4 растений O. gmelinii — 6. Такое соотношение количества чистых культур и растений вызвано тем, что на корнях каждого растения обнаруживалось не более 2—3 клубеньков. В дальнейшем с каждого клубенька получали по одной чистой культуре бактерий. Исследование генетического разнообразия полученных изолятов методом RAPD- анализа выявил определенный полиморфизм ДНК исследуемых образцов, которые формировали 27 генетически однородных групп. Так, изоляты, полученные из клубеньков O. Approximata, относились к 7 генетически однородным группам, изоляты, полученные из клубеньков O. baschkiriensis s. l., — к 13, O. kungurensis s. l. — к 6, O. Gmelinii — к одной группе (рис. 1).
Предварительный филогенетический анализ, проведенный посредством 16S-ПДРФ, выявил, что штаммы образуют, в свою очередь, 8 монофилети-ческих групп. Соответственно, штаммы ризобий из клубеньков O. kungurensis образовали 2 группы,
кнш КяваМияв - — - — —
— Г—! — ы
ни ■ГВПН' £ ; ; Li ^ Ш'
Ми ёвмвм |и|И|н IM iE Stiff • !
"ФтФШ В m »-■S ■ PI w 1 • • m
1 1 2 2 1 1 1 1 3 3 4 5 5 6 6 6 M
Рис. 1. Фореграмма RAPD-анализа ДНК ризобий, изолированных из клубеньков O. kungurensis. Цифрами обозначены номера генетически однородных групп. М — маркер 100 п. н.
O. baschkiriensis s. l. — 3, O. approximata — 2, и O. gmelinii — 1 монофилетическую группу.
С целью определения филогенетической принадлежности представителей выявленных групп микроорганизмов было проведено секвенирование консервативных генов (16S рРНК и recA) и их сравнительный анализ с другими аналогичными генами, депонированными в GenBank. Результаты показали, что исследуемые штаммы ризобий хотя и имеют некоторые филогенетические отличия, но тем не менее все относятся к роду Mesorhizobium. По гену 16S рРНК сходство штаммов составило от 98,4 до 99,8 %, а по гену recA — от 89,7 до 96,7 %. Степень филогенетического родства штаммов не зависела от того, являются ли они симбионтами одного вида растения или разных, поскольку у растений одного вида в клубеньках обнаруживались бактерии, имеющие большие филогенетические различия, чем у бактерий, выделенных из клубеньков разных видов Oxytropis (рис. 2, 3). Таким образом, пространственное разделение и отсутствие совместного произрастания исследуемых растений нельзя объяснить влиянием видового состава и филогенетических различий их ризобий.
За взаимодействие с макросимбионтом у клубеньковых бактерий отвечают продукты специализированных sym-генов. Они включают в себя ответственные за фиксацию азота nif-гены, кодирующие синтез и регуляцию фермента нитрогеназы; nod-гены, кодирующие синтез Nod-факторов (НФ), отвечающих за инициацию и специфичность образуемого симбиоза; а также fix-гены, которые также необходимы для азотфиксации, часто сцепленные с nf-генами, но не гомологичные с ними [11, 12].
На сегодняшний день проведено большое количество исследований, свидетельствующих о высокой мобильности sym-генов и подверженности их горизонтальному переносу (ГПГ) [13—18]. Доказано, что данный процесс является неотъемлемой частью эволюции бобово-ризобиальных взаимоотношений [19—22] и зачастую приводит к появлению штаммов с измененной хозяйской специфичностью или к приобщению новых видов микроорганизмов к группе клубеньковых бактерий [23]. Участие ГПГ в эволюции ризобий подтверждается локализацией sym-генов на мобильных генетических элементах (плазмиды или хромосомные островки,
63 51,8
31,3
55,0 95,9 72,6 70,1
59,4
97,7
59,3
55,3
100,0
9,3
I- I
NAr
45,5
21,1
{
35,0
C;
92,6 99,0 61,6. 71,3
100,0
99,0
98ri9J'- Oku 3.2 (O. kungurensis) 47,4
Oba 3.4 (O. baschkiriensis)
Mesorhizobium sp. Lai 1 (L. albus) Mesorhizobium sp. Lpe 15 (L. pentaphvllus) Ogm 1 (O. gmelinii) Mesorhizobium sp. Lai 2 (L albus) Mesorhizobium sp. Lpe 11 (L. pentaphvllus) Oap 4.2 (O. approximate) Oap 3.4 (O. approximate) Oku 2.1 (O. kungurensis) 63,4
'— Mesorhizobium loti (X67229)
Mesorhizobium mediterraneum (L38825) Oba 1.6 (O. baschkiriensis)
Mesorhizobium amorphae (AF041442) Mesorhizobium huakuii (D13431 ) Mesorhizobium plurifarium (Y14158) Mesorhizobium septentrionale (AF508207) Sinorhizobium fredii (AY260149) Sinorhizobium saheli ( X68390) Sinorhizobium meliloti (X67222) Rhizobium leguminosarum 3841 (NC_008380) Rhizobium phaseoli (NR_044112) Rhizobium tropici (U89832) Rhizobium leguminosarum (U2938) Rhizobium sp. Lpe5 (L. pentaphvllus) Rhizobium galegae (D11343) j Bradyrhizobium japonicum (X66024)
Bradyrhizobium yuanmingense (AF193818)
- Bradyrhizobium elkanii (U35000)
..... Methylobacterium nodulans (AF220763)
95,7r 99,0 67,6
78,3 100,0
E:
99,0
8
0
6 4 2
Nucleotide Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
Рис. 2. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена 16S рРНК. Жирным шрифтом отмечены штаммы микроорганизмов, исследованных в данной работе, подчеркиванием обозначены штаммы, выделенные из клубеньков L. pentaphyllus и L. albus
18,4
28,3
36,3
32,3
26,1
58,7
94,1
61,0
39,5
82,3
78,8 25,7
62,i
78,2 84 "
8,2
Л£=
100,0
99,8
84,0 1_
72 8 8
98,4 p
78,2 100,0
16,4 -
Mesorhizobium sp. Lall (L albus)
Mesorhizobium sp. Lal2 (L. albus)
Oku 2.1 (O. kungurensis)
Mesorhizobium sp. Lpe 15 (L. pentaphvllus)
Oap 3.4 (O. approximata)
Oap 4.2 (O. approximata)
Mesorhizobium loti (AM182156)
Mesorhizobium ciœri (AJ294367)
Mesorhizobium mediterraneum (AJ294369)
Oba 3.4 (O. kungurensis)
Mesorhizobium sp. Lpe 11 iL. pentaphvllus)
Mesorhizobium sp. Lpe 12 IL. pentaphvllus)
Mesorhizobium huakuii (AJ294370)
Oba 1.6 (O. kungurensis)
Mesorhizobium amorphae (AY688612)
Mesorhizobium septentrionale (EF639843)
Oku 3.2 (O. kungurensis)
Mesorhizobium plurifarium (AY907364)
Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 (AM236080)
Mesorhizobium sp. Lpe 5 (L. pentaphvllus)
Rhizobium phaseoli (EF113136)
Rhizobium galegae (AJ294378).
Sinorhizobium fredii (AJ294379)
Sinorhizobium meliloti (AM 182133)
Sinorhizobium saheli (AM182138)
Bradyrhizobium japonicum (AM 182158)
Bradyrhizobium yuanmingense (AM 168343)
Bradyrhizobium elkanii (AY591568)
Methylobacterium nodulans (NC_011894)
16 14 12 10 8 6 4 2 0 Nucleotide Substitutions (хЮО) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
Рис. 3. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена recA. Жирным шрифтом отмечены штаммы микроорганизмов, исследованных в данной работе, подчеркиванием обозначены штаммы, выделенные из клубеньков L. pentaphyllus и L. albus
ограниченные IS-подобными элементами), а также характерной для них панмиктической структурой популяций [24]. Широкая экспансия sym-генов в ассоциированных с растениями бактериальных сообществах посредством ГПГ, как считается, является наиболее вероятным способом формирования современного разнообразия ризобий и проявляется в различиях филогении симбиотических генов и генов «домашнего хозяйства» [14, 25]. Поэтому анализ симбиотических генов является неотъемлемой частью работы по исследованию разнообразия клубеньковых бактерий.
В данной работе исследование филогении сим-биотических генов штаммов проводили на основании сравнительного анализа последовательностей генов nodC и nifH с аналогичными последовательностями других клубеньковых бактерий, взятых из базы данных GenBank (рис. 4, 5).
Исследование филогении гена nifH всех анализируемых бактерий показало их близость с аналогичными генами, преимущественно обнаруживаемыми у бактерий рода Mesorhizobium. При этом различия в нуклеотидных последовательностях nifH всех анализируемых бактерий были весьма незначительные. Наибольшая разница обнаружена между последовательностями гена nifH двух штаммов Oku 3.2 и Oku 2.1, вступающих в симбиоз с растениями O. kungurensis. Тем не менее схожесть между ними составила 92 %, что говорит о консервативности генов нитрогеназы данных бактерий.
Исследование же последовательностей nod-ге-нов выявило некоторые интересные закономерности. ПЦР-ПДРФ-анализ гена nodC представителей всех гомогенных групп исследуемых микроорганизмов показал разделение бактерий на две группы по схожести полос на фореграмме. Первую группу составляли микроорганизмы, выделенные из клубеньков O. baschkiriensis, вторую — микроорганизмы, выделенные из клубеньков других исследованных растений (данные не представлены). При анализе филогении гена nodC на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей было обнаружено, что клубеньковые бактерии растений O. baschkiriensis по гену nodC значительно отличаются от ризобий других представителей рода Oxytropis, произрастающих на Южном Урале (74,5—78 % схожести). Одновременно с этим они имеют 99 % и более схожести
с микросимбионтами растений рода Lupinaster Fabr. (L. pentaphyllus и L. albus), исследованных нами ранее [26], которые произрастают совместно с видами Oxytropis (см. рис. 4). Надо отметить, что в настоящее время систематическое положение растений рода Lupinaster спорно и общая точка зрения в этом вопросе пока не сформирована. Ранее нами было обнаружено, что данные растения вступают в симбиоз с бактериями рода Mesorhizobium, что не характерно для растений трибы Trifolieae, к которым их причисляют [26]. Но, несмотря на спорную ситуацию с систематическим положением рода Lupinaster, очевидно, что данные растения не родственны с растениями рода Oxytropis. Наличие в составе генома клубеньковых бактерий O. baschkiriensis гена nodC, почти идентичного аналогичным генам ризобий растений Lupinaster, свидетельствует о неких приспособительных эволюционных процессах. Остается пока неясным, явилось ли предпочтение O. baschkiriensis вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями с генами nodC, не характер -ными для других видов остролодочников, произрастающих на Южном Урале, причиной сегрегации или же следствием пространственного разделения данного вида от других видов остролодочника. По крайней мере выявлена определенная закономерность различия в составе клубеньковых бактерий сегрегирующих видов растений, что может послужить ключом к разгадке эндемичности некоторых видов бобовых растений. Следует также подчеркнуть, что для O. baschkiriensis на Учалинском мелкосопочнике не выявлено ни одного случая отступления от правила сегрегации, в то время как для некоторых других остролодочников единичные случаи встречаются (например, совместное произрастание O. kungurensis s. l. и O. approximata). O. baschkiriensis был выделен относительно недавно [27] из широко распространенного вида O. ambigua (Pall.) DC. s. l. (Восточная Европа — до Вологодской обл. на западе, Западная и Восточная Сибирь, Монголия) [28] и отличается от него непринципиальными признаками. Возможно, столь обширный ареал O. ambigua s. l. (включая O. baschkiriensis s. str.), нехарактерный для видов секции Orobia, связан с генетической схожестью ризобий Lupinaster pentaphyllus s. l., характеризующийся также широким распространением
49,2
91,7 95,5
58,7 65,6
"74,9
24,1
67,3
61,3
30,9
32,3
47,4
77,7
42,1
67,6
20,2 ,
20 15 10 5
Nucleotide Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
Mesorhizobium sp. Lal2 (L. albus) Mesorhizobium sp. Lall (L. albus) Mesorhizobium sp. Lpe 11 (L. pentaphvllus) Mesorhizobium sp. Lpe 15 (L. pentaphvllus) Mesorhizobium sp. Lpe 12 iL. pentaphvllus) >8.,,4.[ Oba 1.6 (O. baschkiriensis)
Mesorhizobium sp. Lpe 5 (L. pentaphvllus)
46,0
30 1 Oba 3.4 (O. baschkiriensis)
27Srl— M- sePfe"fr'°"ate (EU130411)
W— M.temperatum (EU130410) ~3э"1 M■ tianshanense (DQ450934)
L...f Oap 3.4 (O. approximata) 54,9
-..^G,8^ Oap 4.2 (O. approximata) Ogm 1 (O. gmelinii)
M. ciceri (DQ450928) M. mediterraneum (DQ450930) Oku 3.2 (O. kungurensis)
M. loti (АР012557) Rh. ef//(NC_004041) Rh. gallicum (NZ_KB890240) Rh. phaseoli (HQ670652) Rh. tropici (JX863573) Rh. leguminosarum 3841 (AM236084) S. kummerowiae (KM373707) S. meliloti (KF749211) S. medicae (DQ450936) 410 Methylobacterium nodulans (NC_011894) 100 0° B■ diazoefficiens (NC_004463) , ß. liaoningense (EU818925) B. japonicum (HM047126)
100,0
65,8 100 "
0
100,0,
99,9
Рис. 4. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена nifH. Жирным шрифтом отмечены штаммы микроорганизмов, исследованных в данной работе, подчеркиванием обозначены штаммы, выделенные из клубеньков L. pentaphyllus и L. albus
48,9 83,1
66,2
96,0
99,0
72,6
17,7
9,7
12,3
39,6
52,8
95,5
83,6
100,0 г
6,8
100,0 39,2
57,2
Mesorhizobium sp. Lall (L. albus) Mesorhizobium sp. Lal2 (L. albus) Mesorhizobium sp. Lpe5 IL. pentaphvllus) Mesorhizobium sp. Lpe11 (L pentaphyllus) Mesorhizobium sp. Lpe15 (L. pentaphvllus) Mesorhizobium sp. Lpe12 IL. pentaphvllus) Oba 1.6 (O. baschkiriensis) Oba 3.4 (O. baschkiriensis) Oba 3.2 (O. baschkiriensis) Mesorhizobium ciceri (DQ407292) Mesorhizobium mediterraneum (DQ407293) Rhizobium phaseoli (HM441255) Oap 3.4 (O. approximata) Oap 4.2 (O. approximata) ~ Ogm 1 (O. gmelinii) ~ Oku 2.1 (O. kungurensis) r Mesorhizobium septentrionale (EU 130394)
Oku 3.2 (O. kungurensis) ~ Mesorhizobium plurifarium (JQ889859) ~ Sinorhizobium meliloti (EF209423) " Mesorhizobium loti (AP012557) "" Mesorhizobium amorphae (AF217261) _ Bradyrhizobium japonicum (AP012206) 1 Bradyrhizobium yuanmingense (NZ_FMAE01000014)
- Bradyrhizobium elkanii (KY607997)
- Rhizobium tropici (HQ824719)
............. Sinorhizobium saheli (GU994073)
100,0 Q Rhizobium leguminosarum 3841 (AM236084)
Rhizobium leguminosarum (FJ596038) ............. Neorhizobium galegae (HG938357)
78,9 64,7 46,4 100,0
36,2
100,0
50 40 30 20 10 0 Nucleotide Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
Рис. 5. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена nodC. Жирным шрифтом отмечены штаммы микроорганизмов, исследованных в данной работе, подчеркиванием обозначены штаммы, выделенные из клубеньков L. pentaphyllus и L. albus
(от Восточной Европы до Монголии и Дальнего Востока).
Кроме того, сравнительный анализ нуклеотид-ных последовательностей выявил значительные отличия симбиотических nod-генов клубеньковых бактерий растений O. baschkiriensis и растений рода Lupinaster от всех известных nod-генов, описанных ранее у бактерий рода Mesorhizobium, что выводит их в отдельную кладу на филогенетическом древе (рис. 4). При этом, сами симбионты растений O. baschkiriensis, L. pentaphyllus и L. albus имеют между собой 99 % и более сходства по этому гену, независимо от филогении самих бактерий. Это говорит о том, что у данных растений должна быть высокая и уникальная специфичность со своими микросимбионтами, и, скорее всего, данные растения не входят в одну группу перекрестной инокуляции с другими растениями, вступающими в симбиоз с бактериями рода Mesorhizobium.
Наши исследования подтвердили это предположение. Опыты по перекрестной инокуляции O. baschkiriensis и O. approximata клубеньковыми бактериями, выделенными из клубеньков этих растений, показали, что многочисленные розовые (активные) клубеньки формируются только в случае взаимодействия растений со штаммами, выделенными из клубеньков того же вида; при инокуляции же растений ризобиями другого вида в обоих случаях клубеньки не образуются или формируются малочисленные мелкие белого цвета, что говорит о слабой функциональности этих клубеньков. В то же время, перекрестная инокуляция растений O. baschkiriensis, L. pentaphyllus и L. albus их микросимбионтами приводит к образованию активных клубеньков во всех комбинациях, что говорит о принадлежности вышеперечисленных видов к одной группе перекрестной инокуляции.
Различия в филогении nod- и nif--генов анализируемых штаммов, вероятно, объясняются тем, что полиморфизм nod-генов больше коррелирует с таксономией растений-хозяев, нежели с коро-выми элементами своего генома. А гены, ответственные за азотфиксацию, в свою очередь, в связи с консервативностью функции кодируемых ими белков, менее вариабельны, и их полиморфизм часто имеет большую корреляцию с дивергенцией коровой части генома бактерий. В то же время эти две группы генов способны придавать бактериям
свойства симбиотической азотфиксации только совместно, в геноме они формируют у бактерий рода Mesorhizobium островки симбиоза и поэтому при ГПГ передаются тоже вместе. Это, в свою очередь, также сказывается на их эволюции, и приводит к неполному совпадению филогении nif-генов и коровой части генома [30, 31].
Таким образом, нами было обнаружено, что сегрегации близкородственных бобовых растений может приводить в некоторых случаях к изменению генетического состава их клубеньковых бактерий, что приводит к невозможности их перекрестной инокуляции. Для растений O. baschkiriensis приобретение свойства вступать в симбиоз с аборигенными штаммами клубеньковых бактерий Mesorhizobium, содержащих уникальные nod-ге-ны, обнаруживаемые, на сегодняшний день, только у клубеньковых бактерий бобовых Южного Урала, могло стать приспособительным механизмом, который мог поспособствовать к закреплению O. baschkiriensis в новых ареалах.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 17-44-020201.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тихонович И.А., Борисов А.Ю., Цыганов В.Е., и др. Интеграция генетических систем растений и микроорганизмов при симбиозе // Успехи современной биологии. — 2005. — Т. 125. — № 3. — С. 227-238. [Tihonovich IA, Borisov AYu, Cy-ganov VE, et al. Integration of plant and microbial genetic systems in symbiosis. Advances in modern biology. 2005;125(3):227-238. (In Russ.)]
2. Проворов Н.А. Специфичность взаимодействия клубеньковых бактерий с бобовыми растениями и эволюция бобово-ризобиального симбиоза // Сельскохозяйственная биология. — 1985. — Т. 20. — № 3. — С. 34—47. [Provorov NA. Specifichnost' vzaimodejstviya kluben'kovyh bak-terij s bobovymi rasteniyami i evolyuciya bobovo-rizobial'nogo simbioza. Sel'skokhoziaistvennaia biologiia. 1985;20(3):34-47. (In Russ.)]
3. Парийская А.Н., Клевенская И.Л. Распространение в природе и возможные пути эволюции азотфиксирующего симбиоза // Успехи микробиологии. — 1979. — Т. 14. — С. 124—147. [Parijskaya AN, Klevenskaya IL. Rasprostranenie
v prirode i vozmozhnye puti evolyucii azotfik-siruyushchego simbioza. Uspekhi mikrobiologii. 1979;14:124-147. (In Russ.)]
4. La Pierre KJ, Simms EL, Tariq M, et al. Invasive legumes can associate with many mu-tualists of native legumes, but usually do not. Ecol Evol. 2017;7(20):8599-8611. https://doi. org/10.1002/ece3.3310.
5. Simonsen AK, Dinnage R, Barrett LG, et al. Symbiosis limits establishment of legumes outside their native range at a global scale. Nat Commun. 2017;8:14790. https://doi.org/10.1038/ ncomms14790.
6. Князев М.С. Бобовые (Fabaceae LINDL.) Урала: видообразование, географическое распространение, историко-экологические свиты: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. — СПб., 2015. — 40 с. [Knyazev MS. Bobovyye (Fabaceae LINDL.) Urala: vidoobrazovaniye, geografiches-koye rasprostraneniye, istoriko-ekologicheskiye svity. [dissertation abstract] Saint Petersburg; 2015. 40 р. (In Russ.)]. Доступно по: https:// search.rsl.ru/ru/record/01005560640. Ссылка активна на 02.02.2020.
7. Баймиев А.Х., Птицын К.Г., Баймиев А.Х. Влияние интродукции караганы древовидной на состав ее клубеньковых бактерий // Микробиология. - 2010. - Т. 79. - № 1. - С. 123-128. [Baymiev AnK, Ptitsyn KG, Baimiev AlK. Influence of the introduction of Caragana arborescen-son the composition of its root nodule bacteria. Microbiology. 2010;79( 1 ): 123-128. (In Russ.)]. https://doi.org/10.1134/S0026261710010157.
8. Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990;18(22):6531-6535. https://doi.org/10.1093/ nar/18.22.6531.
9. Laguerre G, Mavingui P, Allard MR, et al. Typing of rhizobia by PCR DNA fingerprinting and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of chromosomal and symbiotic gene regions: application to Rhizobium legumino-sarum and its different biovars. Appl Environ Microbiol. 1996;62(6):2029-2036. https://doi. org/10.1128/aem.62.6.2029-2036.1996.
10. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 16S ribosomal DNA amplification for phyloge-
netic study. J Bacteriol. 1991;173(2):697-703. https://doi.Org/l0.1128/jb.173.2.697-703.1991.
11. Баймиев А.Х., Иванова Е.С., Гуменко Р.С., и др. Анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий бобовых растений Южного Урала // Генетика. - 2015. - Т. 51. - № 12. -С. 1359-1367. [Baymiev AK, Ivanova ES, Gumenko RS, et al. Analysis of symbiotic genes of leguminous root nodule bacteria grown in the Southern Urals. Genetika. 2015;51( 12): 1359-1367. (In Russ.)]. https://doi.org/10.7868/ S001667581511003X.
12. Проворов Н.А. Эволюция генетических систем симбиоза у клубеньковых бактерий // Генетика. - 1996. - Т. 32. - № 8. - С. 1029-1040. [Provorov NA. Evolution of symbiotic genetic systems in rhizobia. Genetika. 1996;32(8):1029-1040. (In Russ.)]
13. Franche C, Lindström K, Elmerich C. Nitrogen-fixing bacteria associated with leguminous and non-leguminous plants. Plant and Soil. 2009;321( 1 -2):35-59. https://doi.org/10.1007/ s11104-008-9833-8.
14. Fischer HM. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia. Microbiol Rev. 1994;58(3): 352-386. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3. 352-386.1994.
15. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Эволюционная генетика клубеньковых бактерий: молекулярные и популяционные аспекты // Генетика. — 2000. - Т. 36. - № 12. - С. 1573-1587. [Provorov NA, Vorob'ev NI. Evolutionary genetics of nodule bacteria: Molecular and population aspects. Genetika. 2000;36( 12): 1573-1587. (In Russ.)]
16. Nandasena KG, O'hara GW, Tiwari RP, Howi-eson JG. Rapid in situ evolution of nodulating strains for Biserrula pelecinus L. through lateral transfer of a symbiosis island from the original mesorhizobial inoculant. Appl Environ Microbiol. 2006;72( 11 ):7365-7367. https://doi. org/10.1128/AEM.00889-06.
17. Andam CP, Mondo SJ, Parker MA. Monophyly of nodA and nifH genes across Texan and Costa Rican populations of Cupriavidus nodule sym-bionts. Appl Environ Microbiol. 2007;73(14): 4686-4690. https://doi.org/10.1128/AEM. 00160-07.
18. Barcellos FG, Menna P, da Silva Batista JS, Hungria M. Evidence of horizontal transfer of symbiotic genes from a Bradyrhizobium japoni-cum inoculant strain to indigenous diazotrophs Sinorhizobium (Ensifer) fredii and Bradyrhizobium elkanii in a Brazilian Savannah soil. Appl Environ Microbiol. 2007;73(8):2635-2643. https://doi.org/l0.1128/AEM.01823-06.
19. Zhao CT, Wang ET, Chen WF, Chen WX. Diverse genomic species and evidences of symbiotic gene lateral transfer detected among the rhizobia associated with Astragalus species grown in the temperate regions of China. FEMS Microbiol Lett. 2008;286(2):263-273. https://doi. org/10.1111/j.1574-6968.2008.01282.x.
20. Bailly X, Olivieri I, Brunel B, et al. Horizontal gene transfer and homologous recombination drive the evolution of the nitro -gen-fixing symbionts of Medicago species. J Bacteriol. 2007;189(14):5223-5236. https:// doi.org/10.1128/JB.00105-07.
21. Freiberg C, Fellay R, Bairoch A, et al. Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes. Nature. 1997;387(6631):394-401. https://doi.org/10.1038/387394a0.
22. Estrella MJ, Muñoz S, Soto MJ, et al. Genetic diversity and host range of rhizobia nodulat-ing Lotus tenuis in typical soils of the Salado River Basin (Argentina). Appl Environ Microbiol. 2009;75(4): 1088-1098. https://doi. org/10.1128/AEM.02405-08.
23. Marchetti M, Capela D, Glew M, et al. Experimental evolution of a plant pathogen into a legume symbiont. PLoS Biol. 2010;8( 1): e1000280. https://doi.org/10.1371/journal.pbio. 1000280.
24. Zaneveld JR, Nemergut DR, Knight R. Are all horizontal gene transfers created equal? Prospects for mechanism-based studies of HGT patterns. Microbiology. 2008;154(Pt 1): 1 -15. https://doi.org/10.1099/mic.0.2007/011833-0.
25. Provorov NA, Vorobyov NI. Simulation of legume-rhizobia symbiosis evolution under the multi-strain competition of bacteria for inoculation of symbiotic habitats. Ecol Gen. 2008;6(4):3-11. https://doi.org/10.17816/ecogen643-11.
26. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Роль горизонтального переноса генов в эволюции
клубеньковых бактерий, направляемой растением-хозяином // Успехи современной биологии. - 2010. - Т. 130. - № 4. - С. 336-345. [Provorov NA, Vorob'ev NI. Impact of horizontal gene transfer on evolution of root nodule bacteria directed by host plant. Advances in modern biology. 2010;130(4):336-345. (In Russ.)]
27. Баймиев А.Х., Акимова Е.С., Гуменко Р.С., и др. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, выделенных из клубеньков растений рода Lupinaster, произрастающих на Южном Урале // Генетика. - 2019. - Т. 55. - № 1. - С. 52-59. [Baymiev AK, Akimova ES, Gumenko RS, et al. Genetic diversity and phylogeny of root nodule bacteria isolated from nodules of plants of the Lupinaster genus inhabiting the Southern Urals. Genetika. 2019;55(1): 52-59. (In Russ.)]. https://doi.org/10.1134/S00166 75819010028.
28. Князев М.С. Заметки по систематике и хорологии видов рода Oxytropis (Fabaceae) на Урале. II. Виды родства Oxytropis ambigua // Ботанический журнал. — 2001. - Т. 86. -№ 1. - С. 126-134. [Knyazev MS. Zametki po sistematike i horologii vidov roda Oxytropis (Fabaceae) na Urale. II. Vidy rodstva Oxytropis ambigua. Botanicheskiy zhurnal. 2001 ;86( 1 ): 126-134. (In Russ.)]
29. Акулова З.В., Бобров Е.Г., Васильева Л.И., и др. Флора европейской части СССР. Т. VI / отв. ред. А.А. Федоров. - Л.: Наука, 1987. -254 с. [Akulova ZV, Bobrov EG, Vasil'eva LI, et al. Flora evropeyskoy chasti SSSR. Vol. VI. Ed by A.A. Fedorov. Leningrad: Nauka; 1987. 254 р. (In Russ.)]
30. Карасев Е.С., Чижевская Е.П., Сима-ров Б.В., и др. Сравнительный анализ фило-гений симбиотических генов клубеньковых бактерий с использованием метадеревьев // Сельскохозяйственная биология. — 2017. -Т. 52. - № 5. - С. 995-1003. [Karasev ES, Chizhevskaya EP, Simarov BV, et al. Compara -tive phylogenetic analysis of symbiotic genes of different nodule bacteria groups using the meta-trees method. Sel'skokhoziaistvennaia biolo-giia. 2017;52(5):995-1003. (In Russ.)]. https:// doi.org/10.15389/agrobiology.2017.5.995rus.
31. Карасев Е.С., Андронов Е.Е., Аксенова Т.С., и др. Эволюции ризобий козлятника (ЫвогЫхоЫит galegae): анализ полиморфизма генов фиксации азота и развития клубеньков // Генетика. - 2019. - Т. 55. - № 2. - С. 234-238. [Кагазеу ЕБ, Лпбгопоу ЕЕ, Лкзепоуа ТБ, е! а1.
Evolution of Goat's Rue Rhizobia (Neorhizobi-um galegae): analysis of polymorphism of the nitrogen fixation and nodule formation genes. Genetika. 2019;55(2): 234-238. (In Russ.)]. https://doi.org/l0.1134/S001667581902 0085.
* Информация об авторах
Андрей Ханифович Баймиев — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов, Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение. ФГБНУ УФИЦ РАН, Уфа. SPIN: 1919-5236. E-mail: baymiev@anrb.ru.
Анастасия Андреевна Владимирова — аспирант лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов. Институт биохимии и генетики. ФГБНУ УФИЦ РАН, Уфа. E-mail: vladimirovaw@ bk.ru.
Екатерина Сергеевна Акимова — канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов. Институт биохимии и генетики. ФГБНУ УФИЦ РАН, Уфа. SPIN: 6595-2452. E-mail: iv.katerina-bio@yandex.ru.
Роман Сергеевич Гуменко — младший научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов. Институт биохимии и генетики. ФГБНУ УФИЦ РАН, Уфа. SPIN: 4216-4301. E-mail: r.gumenko@yandex.ru.
Альберт Акрамович Мулдашев — канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории геоботаники и охраны растительности. Уфимский институт биологии. ФГБНУ УФИЦ РАН, Уфа. SPIN: 1362-7915. E-mail: muldashev_ural@mail.ru.
* Authors and affiliations
Andrei Kh. Baymiev — PhD, Leading Researcher, Laboratory of Plant and Microbial Bioengineering. Institute of Biochemistry and Genetics. Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia. SPIN: 1919-5236. E-mail: baymiev@anrb.ru.
Anastasiya A. Vladimirova - Graduate Student, Laboratory of Plant and Microbial Bioengineering. Institute of Biochemistry and Genetics. Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia. E-mail: vladimirovaw@bk.ru.
Ekaterina S. Akimova — PhD, Researcher, Laboratory of Plant and Microbial Bioengineering. Institute of Biochemistry and Genetics. Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia. SPIN: 6595-2452. E-mail: iv.katerina-bio@yandex.ru.
Roman S. Gumenko — Junior Researcher, Laboratory of Plant and Microbial Bioengineering. Institute of Biochemistry and Genetics. Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia. SPIN: 4216-4301. E-mail: r.gumenko@ yandex.ru.
Albert A. Muldashev — PhD, Senior Researcher, Ufa Institute of Biology. Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia. SPIN: 1362-7915. E-mail: muldashev_ ural@mail.ru.
Алексей Викторович Чемерис — д-р биол. наук, главный научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов. Институт биохимии и генетики. ФГБНУ УФИЦ РАН, Уфа. SPIN: 1248-2582. E-mail: chemeris@anrb.ru.
Alexei V. Chemeris — PhD, Laboratory of Plant and Microbial Bioengineering. Institute of Biochemistry and Genetics. Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia. SPIN: 1248-2582. E-mail: chemeris@anrb.ru.
Алексей Ханифович Баймиев — д-р биол. наук, заведующий лабораторией биоинженерии растений и микроорганизмов. Институт биохимии и генетики. ФГБНУ УФИЦ РАН, Уфа. SPIN: 3771-4063. E-mail: baymiev@mail.ru.
Alexei Kh. Baymiev — PhD, Head of Laboratory of Plant and Microbial Bioengineering. Institute of Biochemistry and Genetics. Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia. SPIN: 3771-4063. E-mail: baymiev@mail.ru.
