Физиологические признаки перспективных штаммов бактерий родов Bacillus и Pseudomonas - продуцентов микробиопрепаратов Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009

А.М. Асатурова,

кандидат биологических наук

ГНУ ВНИИ масличных культур Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17 тел. (861) 275-85-19, [email protected]

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДОВ BACILLUS И PSEUDOMONAS - ПРОДУЦЕНТОВ МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ

Ключевые слова: бактерии-антагонисты, микробиопрепарат, периодическое культивирование, физиологические признаки, температура культивирования, кислотность среды (рН), источники углерода и азота.

УДК 632.937

Введение. Известно, что основной стадией любого микробиологического производства является производственное культивирование соответствующего микроорганизма, проводимое либо с целью увеличения микробной массы - биомассы, либо для получения продуктов метаболизма растущей популяции микроорганизмов [1]. Для разработки производства биофунгицидов комплексного действия необходимо получение жидкой культуры (ЖК) с оптимальной плотностью микробных клеток и концентрации антифунгальных веществ. Для этого были изучены физиологические признаки перспективных штаммов бактерий родов Bacillus и Pseudomonas: условия культивирования и кислотность среды, а также источники углеродного и азотного питания.

Материалы и методы. Объектом исследований служили штаммы бактерий-антагонистов Fa 4-1 Bacillus subtilis, D 7-1 B. subtilis, Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp.

Для определения оптимальной температуры культивирования штаммы выращивали на жидких питательных средах Кинга В [2] (для штаммов Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp.) и Тайлона 3 [3] (для штаммов Fa 4-1 B. subtilis и D 7-1 B. subtilis) при температурах 20, 25, 30 и 35 °С.

Оптимальную кислотность среды определяли, выращивая штаммы на вышеуказанных жидких питательных средах при оптимальных температурах. Добавлением лимонной кислоты или щелочи (NaOH) pH среды устанавливали в пределах 3, 6, 8, и 10.

Для определения оптимальных источников углеродного и азотного питания штаммы Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. выращивали на жидкой питательной среде Кинга В, а штаммы Fa 4-1 B. subtilis и D 7-1 B. subtilis - Чапека для бактерий [4]. Источниками углерода служили глюкоза, сахароза, меласса и глицерин. При изучении углеродных источников неизменными компонентами азотного питания для бацилл был азотнокислый натрий, а для псевдомонад -пептон. Азотсодержащие вещества (азотнокислый натрий, пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) добавляли в среды в качестве единственного источника азота с неизменными источниками углеродного питания: глюкоза (для бактерий рода Bacillus) и глицерин (для бактерий рода Pseudomonas).

Бактерии культивировали в течение двух суток на термостатированных качалках (195 об/мин) в колбах Эрленмейера (750 мл) с объемом питательной среды 150 мл и предварительным внесением посевной (маточной) культуры (2 % от объема питательной среды).

По окончании культивирования определяли численность бактериальных клеток. Для определения численности бактериальных клеток в ЖК использовали метод Коха [5]. Определение числа клеток этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на питательную среду в чашку Петри (ЧП) и подсчет выросших колоний.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливали по 9 мл в пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии пипеткой переносили в колбу с 99 мл стерильной воды. Затем отбирали 1 мл суспензии и переносили в пробирку с 9 мл воды. Полученное разведение тща-

тельно перемешивали, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию. Таким же образом готовили все последующие разведения. Высев исследуемой ЖК осуществляли глубинным способом. Для этого по 1 мл из соответствующего разведения переносили в стерильные ЧП. Затем заливали в чашки по 15-20 мл среды, расплавленной и остуженной до 45-50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями, после чего чашки оставляли на горизонтальной поверхности до застывания среды. Колонии бактерий подсчитывали через пять-семь суток инкубации. Количество клеток в 1 мл исследуемой ЖК вычисляли по формуле:

Т = а х 10" , V

где Т - количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл;

а - среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V - объем суспензии, взятый для посева; 10" - коэффициент разведения.

Математическую обработку опытных данных проводили с использованием стандартных компьютерных программ.

Определение оптимальной температуры и реакции среды для культивирования

штаммов бактерий-антагонистов

Существенное значение для роста микроорганизмов имеет такой фактор внешней среды как температура. Результаты проведенных опытов показали, что отношение к температуре у изучаемых штаммов неодинаково.

Высокая плотность клеток штаммов бацилл-антагонистов обнаруживалась только при температурном режиме 30-35 °С. При этом анализ опытных образцов показал, что оптимальной температурой, при которой происходит максимальное накопление микробной массы и практически полная утилизация питательной среды, для штамма Б 7-1 В. является 30 °С, а для штамма

Ба 4-1 В. тЫШз - диапазон 30-35 °С (рис. 1).

ш

О

«

щ

10000 8000 6000 4000 2000 0

20 25 30 35 20

Температура, °С

| |Fa 4-1 B. subtilis

25 30

35

| D 7-1 B. subtilis

Рисунок 1 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Bacillus при различных температурах в процессе периодического культивирования

Существенным достоинством штаммов псевдомонад по сравнению с бациллярными бактериями была способность к активному росту при более низких температурах: 20-25 °С (рис. 2).

12000

л Я 10000

W

О 8000

.д дрл 6000

м

4000

рти 2000

Т

0

20 25 30 35 20

Температура, °С

25

30

35

| | Sgrc-1 P. fluorescens JJ Oif 2-1 Pseudomonas sp.

Рисунок 2 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Pseudomonas при различных температурах в процессе периодического культивирования

Несмотря на то, что титр клеток оставался высоким вне зависимости от температурного режима и составлял 2,8-9,5 х 1012 КОЕ/мл при 20-25 °С и от 6,0 х 1010 до 8,5 х 1012 КОЕ/мл при 3035 °С, повышение температуры культивирования до 30-35 °С приводило к появлению клеток с отсутствием желто-зеленого внеклеточного пигмента, что связано с потерей клетками антифунгаль-ной активности (рис. 3) [6].

1 2

Рисунок 3 - Влияние температуры на пигментообразующую способность штаммов бактерий-антагонистов рода Pseudomonas (ориг.)

1 - типичные клетки с желто-зеленым внеклеточным пигментом (культивирование

при температуре 20-25 °С);

2 - типичные (а) и нетипичные (b) клетки с отсутствием желто-зеленого внеклеточного

пигмента (культивирование при температуре 35 °С).

Следовательно, оптимальной для роста штаммов флюоресцирующих бактерий Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. является температурный диапазон 20-25 °С.

Одним из важных факторов, определяющих нормальный рост бактерий, является реакция среды. При изменении ее в неблагоприятную сторону микроорганизм перестает расти даже в тех случаях, если все остальные условия окружающей среды будут оптимальными [7].

При определении оптимальной кислотности среды у всех исследованных штаммов отмечался достаточно высокий титр ЖК при рН среды 6 и 8. Лимитирующими рост бактерий-антагонистов оказались значения реакции среды 3 и 10 (рис. 4, 5).

У штаммов Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. при указанных уровнях рН практически не обнаруживалось роста клеток, а в случае с бациллярными штаммами были получены ЖК с низкой плотностью бактериальных клеток: 1,4-4,0 х 106 КОЕ/мл при рН 3 и 4,75,6 х106 КОЕ/мл при рН 10. Однако, принимая во внимание полученный титр (для штаммов Fa 4-1 B. subtilis, D 7-1 B. subtilis 8,5*108 и 2,3*109 КОЕ/мл соответственно) и объем посевной культуры (3 мл на 150 мл питательной среды), можно сделать вывод о том, что при рН среды 3 и 10 бактерии рода Bacillus не размножались, а находились в состоянии покоя, сохраняя жизнеспособность благодаря наличию споровой стадии (рис. 4).

1600

л м 1400

/Е 1200

О

К 1000

.н

800

600

рт 400

ртиТ 200

0

6 8 10 3 6

Уровень рН

| | Fa 4-1 B. subtilis Q D 7-1 B. subtilis

10

Рисунок 4 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Bacillus при различных уровнях рН в процессе периодического культивирования

В отличие от бацилл штаммы бактерий рода Pseudomonas не формируют спор и других форм покоя, поэтому при рН среды 3 полностью погибали, а при рН 10 выживали лишь единичные клетки (рис. 5).

12000

л

м/ 10000 ЕО

^ 8000 .д

рл 6000

,К 4000

рти 2000 Т

0

3 6

10

8 10 3 6 8

Уровень рН

| | Sgrc-1 P. fluorescens Ii Oif 2-1 Pseudomonas sp.

3

8

Рисунок 5 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Pseudomonas при различных уровнях рН в процессе периодического культивирования

Следовательно, для перспективных биоагентов Fa 4-1 B. subtilis, Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. оптимальным диапазоном реакции среды является 6-8, а для штамма D 7-1 B. subtilis - рН 6. Именно при данных значениях реакции среды отмечена высокая плотность популяций бактерий и максимальная утилизация питательной среды.

Определение оптимальных источников углеродного и азотного питания для культивирования штаммов бактерий-антагонистов

Эффективность использования штаммами-антагонистами источников углерода и азота определялась также по количеству колониеобразующих единиц.

Максимальная плотность клеток штамма Fa 4-1 B. subtilis отмечалась на среде, где в качестве источников углерода были меласса и глюкоза (1,3-1,6 х 109 КОЕ/мл), а для штамма D 7-1 B. subtilis - меласса и сахароза (1,9-2,8 х 109 КОЕ/мл) (рис. 6).

а

д

о р

рел лгу

ч чотсИ

сахароза

глицерин

глюкоза

глицерин

еласса

глю

коза

|--1 меласса

500 1000 1500 2000 2500 Титр, млн. КОЕ/мл

сахароза

3000

3500

| | Fa 4-1 B. subtilis ЦЦ D 7-1 B. subtilis

Рисунок 6 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Bacillus в зависимости от источников углерода в процессе периодического культивирования

м

0

Минимальный титр штаммов Fa 4-1 B. subtilis и D 7-1 B. subtilis отмечен на питательной среде с добавлением в качестве источника углеродного питания глицерина (1,1 х 107 и 8,7 х 106 КОЕ/мл соответственно). Это указывает на неспособность бациллярных бактерий использовать данное соединение. Несмотря на присутствие всех остальных компонентов среды, а также оптимальные температуру и реакцию среды, данные количественного учета свидетельствуют о том, что размножения бактерий с данным источником углерода не происходило.

Штаммы пигментирующих бактерий оказались более пластичными и активно использовали весь спектр испытываемых источников углерода, что наглядно показал анализ образцов ЖК штаммов. Максимальный титр для штамма Sgrc-1 P. fluorescens отмечен в вариантах с добавлением сахарозы, глюкозы и глицерина (2,9 -4,8 х 1012 КОЕ/мл), а для штамма Oif 2-1 Pseudomonas sp. - глицерина и глюкозы (2,6-4,9 х 1012 КОЕ/мл) (рис. 7).

а

адо р

е

елг

у

н

i

меласса

—i глюко: сахароза

глицерин

глицерин

глюкоза

1000

5000

6000

2000 3000 4000

Титр, млрд. КОЕ/мл

| | Sgrc-1 P. fluorescens Oif 2-1 Pseudomonas sp.

Рисунок 7 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Pseudomonas в зависимости от источников углерода в процессе периодического культивирования

Высокий титр штамма Fa 4-1 B. subtilis наблюдался на питательных средах, где в качестве источников азота использовались кукурузный экстракт, азотнокислый натрий и пептон (2,3-5,4х108 КОЕ/мл). Тогда как штамм D 7-1 B. subtilis оказался более требовательным к источникам азота, хорошая плотность популяции данной бактерии отмечалась только с добавлением в качестве источника азота кукурузного экстракта (1,5х108 КОЕ/мл) (рис. 8).

ч £

дрожжевой экстракт

пептон аз

отнокнслый натрий

н

дрожжево экстракт

й

кук

н кукур

узный

экстракт

урузный кстракт

\ азотн на

пептон

100

500

600

200 300 400

Титр, млн. КОЕ/мл | | Fa 4-1 B. subtilis Q D 7-1 B. subtilis

Рисунок 8 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Bacillus в зависимости от источников азота в процессе периодического культивирования

Практически непригодными для утилизации в качестве источников азотного питания для штамма Fa 4-1 B. subtilis оказался дрожжевой экстракт (4,3 х 106 КОЕ/мл), а для штамма D 7-1 B. subtilis - пептон (2,0 х 106 КОЕ/мл).

Для обоих штаммов флюоресцирующих бактерий был отмечен хороший рост при добавлении следующих азотсодержащих веществ: азотнокислый натрий, дрожжевой экстракт и пептон. Титр ЖК с указанными азотсодержащими веществами составлял от 7,7 х 1011 до 8,6 х 1012 КОЕ/мл (рис. 9). Минимальный титр штаммов Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. отмечен на питательной среде с добавлением кукурузного экстракта (4,4-6,1 х 105 КОЕ/мл). Указанные биоагенты оказались неспособными использовать данный источник азота.

а

пептон

азотнокислым

кукурузный экстракт

натрии

дрожжевой экстракт

кт

I пептон

азотнокислым кукурузный натрий

экстракт дрожжевой экстракт

0

2000

4000

6000

8000

10000

Титр, млрд. КОЕ/мл I I Sgrc-1 P. fluorescens Oif 2-1 Pseudomonas sp.

Рисунок 9 - Рост штаммов бактерий-антагонистов рода Pseudomonas в зависимости от источников азота в процессе периодического культивирования

Выводы. 1. Выявлен температурный оптимум для культивирования перспективных штаммов бактерий: Fa 4-1 B. subtilis - 30-35 °С, D 7-1 B. subtilis - 30 °С, Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - 20-25 °С.

2. Определен оптимум рН для культивирования перспективных штаммов бактерий: D 7-1 B. subtilis - 6, Fa 4-1 B. subtilis, Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - 6-8.

3. Установлены оптимальные источники углерода: для штамма Fa 4-1 B. subtilis меласса и глюкоза, для штамма D 7-1 B. subtilis - меласса и сахароза, для штаммов Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - глюкоза, сахароза, меласса и глицерин.

4. Оптимальным источником азота для всех биоагентов был азотнокислый натрий, для штамма Fa 4-1 B. subtilis также пептон и кукурузный экстракт, для D 7-1 B. subtilis - дрожжевой и кукурузный экстракты, а для штаммов Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - пептон и дрожжевой экстракт.

5. Полученные экспериментальные данные впоследствии могут быть использованы для разработки элементов технологии производства микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий родов Bacillus и Pseudomonas.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-04-99010-р_офи.

1. Мосичев, М.С. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В.Б. Котов. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. - 264 с.

2. King, E.O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin / E.O. King, M.K. Ward, D.E. Raney // J. Lab. Clin. Med. - 1954. - Vol. 44. - P. 301-307.

3. Егоров, Н.С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности / Н.С. Егоров. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1957. - 78 с.

4. Скворцова, И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus / И.Н. Скворцова. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1984. - 26 с.

5. Нетрусов, Ф.И. Практикум по микробиологии / Ф.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. За-харчук [и др.]. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.

6. Свешникова, Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas - антагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике: автореф. дис. канд. биол. Наук / Елена Витальевна Свешникова. - Уфа, 2003. - 22 с.

7. Ваксман, З.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества / З.А. Ваксман. - М.: Гос. изд-во иностр. лит., 1947. - 391 с.

Список литературы