CC BY
58
ISSN 2412-608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 4 (172), 2017
Защита растений и иммунология
УДК 633.854.78:632.444.2:632.953.1
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА МИКРОБИОПРЕПАРАТА SGRC-1 PSEUDOMONAS FLUORESCENS -АНТАГОНИСТА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛОЖНОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПОДСОЛНЕЧНИКА
Л.В. Маслиенко,
доктор биологических наук
А.Х. Воронкова,
младший научный сотрудник Е.Ю. Шипиевская,
кандидат биологических наук
ФГБНУ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 Тел.: (861) 275-85-19 E-mail: [email protected]
Для цитирования: Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х., Шипиевская Е.Ю. Биологические особенности штамма-продуцента микробиопрепарата SGRC-1 Pseudomonas fluorescens - антагониста возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. - 2017. - Вып. 4 (172). - С. 119-124.
Ключевые слова: подсолнечник, ложная мучнистая роса, Plasmopara halstedii, микробиопрепарат, штамм-продуцент Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens.
Для разработки технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме порошок при поверхностном культивировании на жидких питательных средах изучены биологические особенности штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens - антагониста ложной мучнистой росы подсолнечника. Изучены морфолого-культуральные свойства штамма-продуцента на двух агаризированных средах. Установлены оптимальные условия культивирования штамма: температура - 25-30 оС, рН среды 8. В качестве источников углеродного питания можно использовать глицерин, глюкозу и
сахарозу. Оптимальными источниками азотного питания установлены азотнокислый натрий и пептон. Оптимальной сложной питательной средой для культивирования перспективного бактериального штамма Sgrc-1 P. fluorescens установлена среда Кинга В.
UDC 633.854.78:632.444.2:632.953.1
The biological features of a strain-producer in mi-crobiopreparation SGRC-1 Pseudomonas fluorescens - an antagonist of Downy Mildew pathogen on sunflower. Maslienko L.V., doctor of biology Voronkova A.Kh., junior researcher Shipievskaya E.Yu., PhD in biology
All-Russia Research Institute of Oil Crops by
Pustovoit V.S. (VNIIMK)
17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia
Те1: (861) 254-29-29
E-mail: [email protected]
Key words: sunflower downy mildew, Plasmopara halstedii, microbiopreparation, strain-producer Sgrc-1
Pseudomonas fluorescens.
To develop a technological regimen for production of microbiopreparation in a form 'powder' at surface cultivation on liquid nutrient mediums, there were studied biological features of a strain-producer Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens - antagonist of downy mildew pathogen on sunflower. The morphological and cultural qualities of the strain-producer were studied on two agar mediums. The optimal conditions for the strain cultivation were determined: temperature - 25-30 C, Ph of medium 8. Glycerin, glucose and sucrose can be used as a source of carbon nutrition. The optimal sources of nitrogen nutrition are determined sodium nitrate and peptone. The optimal complex nutrient medium for cultivation of the perspective strain Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens is King's B medium.
Введение. Ложная мучнистая роса (ЛМР), вызываемая облигатным паразитом оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni, относится к числу наиболее вредоносных болезней подсолнечника. Основным способом борьбы с этим заболеванием является селекционный. Но в связи с появлением новых агрессивных рас возбудителя, ранее устойчивые сорта и гибриды поражаются болезнью в сильной степени. Химический
фунгицид Апрон (металаксил) также снизил эффективность в связи с возникающей резистентностью возбудителя болезни [1]. Решение проблемы защиты от болезней связано с разработкой комплекса мероприятий, включающих и микробиологический метод.
В России и за рубежом проводятся исследования по разработке микробиологических средств защиты растений от возбудителей ложной мучнистой росы, но зарегистрированных микробиопрепаратов нет [2-7].
В лаборатории биометода Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур имени В.С. Пус-товойта (ФГБНУ ВНИИМК) в течение многих лет ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных культур от болезней [8]. В последние годы проводится работа по поиску перспективных штаммов-продуцентов для создания микробиопрепаратов против возбудителя ложной мучнистой росы на подсолнечнике [9]. В результате скрининга грибов и бактерий из коллекции лаборатории выделено 14 перспективных штаммов-антагонистов возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника. Одним из перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепарата против ЛМР является штамм Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens. Наряду с фунги-цидной активностью против ЛМР и других опасных патогенов установлено отсутствие угнетающего влияния штамма на культуру подсолнечника и выявлено его ростостимулирующее действие [10].
Для разработки технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок изучали морфолого-культураль-ные и физиологические признаки штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens, осуществляли подбор оптимальных сложных жидких питательных сред при поверхностном культивировании.
Материалы и методы. Морфолого-культуральные признаки перспективного
штамма-антагониста Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens изучали по общепринятым методикам на агаризированных питательных средах - мясопептонном агаре (МПА) и Кинга В [11].
Морфологические признаки активного штамма определяли с помощью микроскопа «Motic BA 300». Определяли форму и размер клеток, способность к движению, окраску по Грамму. Изучали особенности роста, форму, размер, поверхность, профиль, цвет, блеск и прозрачность колоний, а также их край, структуру и консистенцию на десятые сутки инкубации [12; 13; 14].
Физиологические признаки активного штамма изучали на жидкой питательной среде Кинга В. Поверхностное культивирование осуществляли в колбах Эрлен-мейера (250,0 мл) с объемом питательной среды 100,0 мл и предварительным внесением посевной (маточной) культуры (2,0 % от объема питательной среды), заменяя источники углеродного и азотного питания. Источниками углеродного питания служили глюкоза, сахароза, глицерин и меласса, азотного питания - азотнокислый натрий, пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты.
Для определения оптимальной температуры культивирования штамм выращивали на жидкой питательной среде Кинга В при температурах 20,0, 25,0, 30,0 и 35,0 °С.
Для определения оптимальной кислотности среды штамм выращивали на жидкой питательной среде Кинга В при оптимальной температуре. Добавлением лимонной кислоты или щелочи (4 н. раствор NaOH) pH среды устанавливали 3,0; 6,0; 8,0 и 10,0.
Подбор оптимальных жидких питательных сред для выращивания перспективного штамма проводили на жидких средах в условиях поверхностного культивирования. Испытывали ряд питательных сред: мясопептонный бульон (МПБ), Кинга В, Чапека для бактерий, пептон-дрожжевую [11; 15; 16].
Рост бактерии на жидкой среде оценивали по шкале:
- слабый - рост отдельными поверхностными колониями;
- средний - бактериальная плёнка поверхностная, прерывистая, тонкая;
- сильный - бактериальная плёнка поверхностная сплошная, с частичным глубинным ростом;
- обильный - бактериальная плёнка поверхностная сплошная, с массовым глубинным ростом.
По окончании культивирования определяли сухой остаток бактериальной массы после высушивания при температуре 105,0 оС до постоянного веса. Повтор-ность в каждом опыте трехкратная.
Результаты и обсуждение. Морфоло-го-культуральные признаки штамма Sgrc-1 Pseudomonas _ fluorescens.
Морфологические признаки клеток. Клетки палочковидные, одиночные или соединены попарно, подвижные (движение поступательное), размеры 0,4-0,7 х 1,4-3,1 мкм. Споры отсутствуют. Окраска по Грамму отрицательная.
Культуральные признаки колоний. Культуральные признаки штамма Sgrc-1 P. fluorescens изучали на агаризирован-ных средах - мясопептонном агаре (МПА) и Кинга В (табл. 1, рис. 1). На этих средах форма колоний круглая, поверхность гладкая. Профиль колоний выпуклый, край на обеих средах гладкий, реже волнистый. Колонии блестящие, на Кинга В просвечивающиеся, пигментированные (желто-зеленый флюоресцирующий пигмент, диффундирующий в среду), на МПА непигментированные, непросве-чивающиеся. Структура колоний однородная, консистенция слизистая. Диаметр колоний на десятые сутки инкубации на МПА 30,1-30,7 мм, на среде Кинга В -20,1-20,8 мм.
Таблица 1
Культурально-морфологические признаки колоний штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens при температуре 25 оС
среда Кинга В
МПБ
Рисунок 1 - Рост штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на агаризированных средах при температуре 25 оС
г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.
Характеристика признака Питательная среда
МПА среда Кинга В
1. Форма колоний Круглая Круглая
2. Диаметр колоний, мм 30,1-30,7 20,1-20,8
3. Край колоний Гладкий, реже волнистый Гладкий, реже волнистый
4. Поверхность колоний Гладкая Гладкая
5. Профиль колоний Выпуклый Выпуклый
6. Оптические свойства поверхности колоний Блестящие, не просвечивающиеся, не пигментированные Блестящие, просвечивающиеся, пигментированные (желто-зеленый флюоресцирующий пигмент, диффундирующий в среду)
7. Структура колонии Однородная Однородная
8. Консистенция Слизистая Слизистая
Физиологические признаки штамма Sgrc-1 Pseudomonas _ fluorescens
Оптимальные температуры и реакцию среды для культивирования штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens определяли выращивая штамм на жидкой питательной среде Кинга В при 20, 25, 30 и 35 °С (табл. 2).
Таблица 2
Влияние температуры на рост штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Кинга В
г. Краснодар, ВН ИИМК, 2016 г.
Температура, оС Рост бактерии Вес сухой бактериальной массы, г*
20 Средний 0,32 ± 0,03
25 Обильный 0,86 ± 0,07
30 Сильный 0,69 ± 0,05
35 Слабый 0,12 ± 0
* - вес бактериальной массы в расчете
на 100 мл питательной среды
Обильный рост колоний штамма Sgrc-1 P. fluorescens и максимальный вес сухой бактериальной массы отмечен в диапазоне температур 25-30 °С.
Оптимальную кислотность среды определяли, выращивая штамм Sgrc-1 P. fluo-rescens на жидкой питательной среде Кинга В с разными значениями рН среды при оптимальной температуре 25 о С (табл. 3).
Таблица 3
Влияние рН среды на рост штамма Sgrc-1 P. fluorescens в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Кинга В при температуре 25 оС
г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.
Установлен активный рост бактерии в диапазоне рН среды от 6 до 10, при этом
максимальный вес сухой бактериальной массы отмечен при значении рН 8 (0,99 г/100 мл питательной среды). Определение оптимальных источников питания для культивирования штамма Sgrc-1 Pseudomonas _ fluorescens.
Оптимальные источники питания определяли, выращивая штамм Sgrc-1 P. fluo-rescens на жидкой питательной среде Кинга В при температуре 25 оС. Источниками углеродного питания служили глюкоза, сахароза, меласса и глицерин. При изучении углеродных источников неизменными компонентами азотного питания служил пептон (табл. 4).
Таблица 4
Влияние источников углерода на рост штамма Sgrc-1 P. fluorescens в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Кинга В при температуре 25 оС
г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.
Источник углерода Рост бактерии Вес сухой бактериальной массы, г*
Меласса Средний 0,36 ± 0,03
Глюкоза Средний 0,45 ± 0,08
Глицерин Обильный 0,71 ± 0,02
Сахароза Средний 0,58 ± 0,06
* - вес бактериальной массы в расчете
на 100 мл питательной среды
Максимальный рост и вес сухого остатка бактериальной массы отмечены при использовании в качестве единственного источника углерода глицерина (0,71 г на 100 мл питательной среды).
Источниками азота служили азотнокислый натрий, пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты, при этом неизменным источником углеродного питания был глицерин. Максимальный рост и вес сухой бактериальной массы отмечены при использовании в качестве единственного источника азота пептона и азотнокислого натрия (0,71-0,73 г на 100 мл питательной среды) (табл. 5).
Таким образом, для штамма Sgrc-1 P. fluorescens установлены оптимальные условия культивирования: температура 25-30 оС, рН среды 8. В качестве источ-
рН среды Рост бактерии Вес сухой бактериальной массы, г*
3 Слабый 0,12 ± 0,03
6 сильный 0,76 ± 0,07
8 обильный 0,99 ± 0,05
10 сильный 0,77 ± 0,00
* - вес бактериальной массы в расчете
на 100 мл питательной среды
ников углеродного питания можно использовать глицерин, глюкозу и сахарозу. Оптимальными источниками азотного питания установлены азотнокислый натрий и пептон.
Таблица 5
Влияние источников азота на рост штамма Sgrc-1 P. fluorescens в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Кинга В при температуре 25 оС
г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.
Определение оптимальных жидких питательных сред для штамма Sgrc-1 P. fluorescens.
Подбор оптимальных питательных сред для штамма Sgrc-1 P. fluorescens проводили при стационарном культивировании на жидких питательных средах сложного состава - Кинга В, Чапека для бактерий, МПБ и пептоне (дрожжевой среде), содержащих углеводы и, в разном соотношении, соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы (табл. 6).
Таблица 6
Влияние жидких питательных сред и срока стационарного культивирования на рост штамма Sgrc-1 P. fluorescens при температуре 25 оС
г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.
Оптимальной сложной питательной средой для культивирования перспектив-
ного бактериального штамма Sgrc-1 P. fluorescens установлена среда Кинга В, на которой вес сухой бактериальной массы составил 0,74 г против 0,07-0,24 г на других средах.
Выводы. 1. Обильный рост колоний штамма Sgrc-1 P. fluorescens и максимальный вес сухой бактериальной массы отмечены в диапазоне температур 2025 °С.
2. Активный рост бактерии установлен в диапазоне рH среды от 6 до 10, при этом максимальный вес сухой бактериальной массы отмечен при значении рH В.
3. Из источников углерода максимальный рост и выход сухого остатка бактериальной массы обеспечило введение в питательную среду глицерина.
4. Максимальный рост и вес сухой бактериальной массы отмечены при использовании в качестве единственных источников азота пептона и азотнокислого натрия.
5. Оптимальной сложной питательной средой для культивирования перспективного бактериального штамма Sgrc-1 P. fluorescens установлена среда Кинга В.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 16-48-230293.
Список литературы
1. Gulya T.J., Draper J., Harbour J., Holen C., Knodel J., Lamey A. Metalaxsyl resistance in sunflower downy mildew in Nord America II Proc. of the 21th Sunfl. Research Workshop, January 14-15. -1999. - P. 118-123.
2. Терёшина М.В. Биологическое обоснование методов ранней диагностики и приёмов снижения вредоносности ложной мучнистой росы подсолнечника: автореф. дис. ... канд. биол. наук. -Краснодар, 1996. - 15 с.
3. Патент 2182767 РФ, МКИ F C А0Ш63|00, A01N63|04 Способ защиты огурца от пероноспороза I Иващенко И.И., Чебыкин М.Ю. - N 99115630|13; Заяв. 19.07.1999; Опубл. 27.05. 2002; ЖИ.
4. Tosi L., Giovannetti M., Zazzerini A., Sbrana C. Interactions between Plasmopara helianthi and arbuscular mycorrhizal fungi in sunflower seedings susceptible and resistant to downy mildew II Phyto-pathol. Mediterranea. - 1993. - Vol. 32. - № 2. - P. 106-114.
5. Tosi L., Zazzerini A. Interactions between Plasmopara helianthi, Glomus mossea and two plant
Источник азота Рост бактерии Вес сухой бактериальной массы, г*
Пептон Обильный 0,71 ± 0,02
Азотнокислый натрий Обильный 0,73 ± 0,05
Дрожжевой экстракт Средний 0,56 ± 0,05
Кукурузный экстракт Средний 0,60 ± 0,08
* - вес бактериальной массы в расчете на 100 мл питательной среды
Питательная среда Вес сухой бактериальной массы, г* через 10 суток
Чапека для бактерий 0,07 ± 0
Пептон - дрожжевая среда 0,24 ± 0,06
МПБ 0,08 ± 0
Кинга В 0,74 ± 0,08
* - вес бактериальной массы в расчете на 100 мл питательной среды
activators in sunflower plants // Europ. J. Plant Pathol. - 2000. - Vol. 106. - No 8. - P. 735-744.
6. Yonsel Y.S., Sevim M. Microbial dressing of sunflower seeds with Trichoderma harzianum Kuen 1585 // Proc. of 19th Intern. Sunfl. Conf., Edirne, Turkey. 29 May-3 June 2016. - P. 993.
7. Ciftcigil T.H., Ozer N., Sabudak T. A preliminary study on control of sunflower downy mildew (Plasmopara halstedii) with culture filtrates of antagonistic fungi // Proc. of 19th International Sunflower Conference, Edirne, Turkey. 29 May-3 June 2016. -P. 1106.
8. Маслиенко Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника: автореф. дис. ... докт. биол. наук. - Краснодар, 2005. - 48 с.
9. Маслиенко Л.В., Арасланова Н.М., Ковчигина М.А. Поиск оптимального метода искусственного заражения подсолнечника возбудителем ложной мучнистой росы для определения эффективности опытных образцов микробиопрепаратов // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2014. -Вып. 2 (159-160) . - С. 156-162.
10. Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х., Арасланова Н.М., Ковчигина М.А., Шипиевская Е.Ю., Наумов Г.Н. Скрининг штаммов-антагонистов к возбудителю ложной мучнистой росы подсолнечника // Наука Кубани. - 2016. - № 3. - С. 48-55.
11. King E.O., WardM.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. - 1954. - Vol. 44. - P. 301-307.
12. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2004. - 144 с.
13. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с.
14. Нетрусов Ф.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.
15. Скворцова И.Н. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий рода Pseudomonas. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1981. - 78 с.
16. Тихонович И.А., Оследкин Ю.С. Каталог культур микроорганизмов. - СПб-Пушкин, 2005. -88 с.
References
1. Gulya T.J., Draper J., Harbour J., Holen C., Knodel J., Lamey A. Metalaxsyl resistance in sunflower downy mildew in Nord America // Proc. of the 21th Sunfl. Research Workshop, January 14-15. -1999. - P. 118-123.
2. Tereshina M.V. Biologicheskoe obosnovanie metodov ranney diagnostiki i priemov snizheniya vredonosnosti lozhnoy muchnistoy rosy podsolnech-nika: avtoref. dis. ... kand. biol. nauk. - Krasnodar, 1996. - 15 s.
3. Patent 2182767 RF, MKI F C A01N63|00, A01N63|04 Sposob zashchity ogurtsa ot perono-sporoza / Ivashchenko I.I., Chebykin M.Yu. - N 99115630| 13; Zayav. 19.07.1999; Opubl. 27.05. 2002; NKI.
4. Tosi L., Giovannetti M., Zazzerini A., Sbrana C. Interactions between Plasmopara helianthi and arbuscular mycorrhizal fungi in sunflower seedings susceptible and resistant to downy mildew // Phyto-pathol. Mediterranea. - 1993. - Vol. 32. - No 2. - P. 106-114.
5. Tosi L., Zazzerini A. Interactions between Plasmopara helianthi, Glomus mossea and two plant activators in sunflower plants // Europ. J. Plant Pathol. - 2000. - Vol. 106. - No 8. - P. 735-744.
6. Yonsel Y.S., Sevim M. Microbial dressing of sunflower seeds with Trichoderma harzianum Kuen 1585 // Proc. of 19th Intern. Sunfl. Conf., Edirne, Turkey. 29 May-3 June 2016. - P. 993.
7. Ciftcigil T.H., Ozer N., Sabudak T. A preliminary study on control of sunflower downy mildew (Plasmo-para halstedii) with culture filtrates of antagonistic fungi // Proc. of 19th International Sunflower Conference, Edirne, Turkey, 29 May-3 June 2016. - P. 1106.
8. Maslienko L.V. Obosnovanie i razrabotka mikrobiologicheskogo metoda bor'by s boleznyami podsolnechnika: avtoref. dis. ... dokt. biol. nauk. -Krasnodar, 2005. - 48 s.
9. Maslienko L.V., Araslanova N.M., Kovchigina M.A. Poisk optimal'nogo metoda iskusstvennogo zarazheniya podsolnechnika vozbuditelem lozhnoy muchnistoy rosy dlya opredeleniya effektivnosti opy-tnykh obraztsov mikrobiopreparatov // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2014. - Vyp. 2 (159-160) . - S. 156-162.
10. Maslienko L.V., Voronkova A.Kh., Araslanova N.M., Kovchigina M.A., Shipievskaya E.Yu., Naumov G.N. Skrining shtammov-antagonistov k vozbuditelyu lozhnoy muchnistoy rosy podsolnechnika // Nauka Ku-bani. - 2016. - № 3. - S. 48-55.
11. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. - 1954. - Vol. 44. - P. 301-307.
12. Gradova N.B., Babusenko E.S., Gornova I.B. Laboratornyy praktikum po obshchey mikrobiologii. -M.: DeLi print, 2004. - 144 s.
13. Tepper E.Z., Shil'nikova V.K., Pereverzeva G.I. Praktikum po mikrobiologii. - M.: Drofa, 2004. -256 s.
14. Netrusov F.I., Egorova M.A., Zakharchuk L.M. Praktikum po mikrobiologii. - M.: Izdatel'skiy tsentr «Akademiya», 2005. - 608 s.
15. Skvortsova I.N. Metody identifikatsii i vydeleniya pochvennykh bakteriy roda Pseudomonas. - M.: Izd-vo Mosk. un-ta, 1981. - 78 s.
16. Tikhonovich I.A., Osledkin Yu.S. Katalog kul'tur mikroorganizmov. - SPb-Pushkin, 2005. -88 s.
