CC BY
15
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВАКЦИНЫ «ГЕП-А-ИН-ВАК» ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ
Андреев Ю.Л., Маева Т.Е., Кедич Л.А., Золина Е.Д., Куслий А.Г.
ЗАО «Вектор-БиАльгам», Кольцове, НСО
г В статье обобщены материалы экспериментальных исследований по сохранности свойств ^ отечественной вакцины гепатита А «ГЕП-А-ин-ВАК», производства ЗАО «Вектор-БиАльгам» при различных экстремальных температурных режимах хранения.
На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что вакцина «ГЕП-А-ин-ВАК» при хранении в течение месяца при температуре +20... +37 °С не отличается по всем показателям от контрольных проб и полностью соответствуют требованиям НТД. В то же время вакцина, хранящаяся при температуре -20 °С (заморозка) при сохранении физико-химических свойств резко отличается по иммуногенной активности и титру АГ В ГА от контрольных показателей.
Ключевые слова: вакцина гепатита А — «ГЕП-А-ин-ВАК», температурный режим, физико-химические свойства, иммуногенная активность, титр антигена вируса гепатита А (АГ В ГА)
ч У
Проблема сохранности медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) в виду их термолабильности остается актуальной. Стабильность, активность и эффективность вакцин, в особенности предназначенных для детей, существенно зависит от условий хранения и транспортировки [1-3]. Общие требования по условиям хранения и транспортировки готовых форм вакцин в соответствии с требованиями СМР приведены в отечественных и международных стандартах [3-7].
Система «холодовой цепи» состоит из четырех уровней от изготовления до потребления. Готовые формы вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» хранятся в картонной гофрированной таре на складе готовой продукции в индивидуальных холодильных камерах при температуре 6 ± 2 °С. Температурный режим поддерживается автоматически, регистрируется при помощи электрических датчиков и визуально сотрудниками, ответственными за обеспечение холодовой цепи на складе готовой продукции. Следует отметить, что отработанная на предприятии система хранения и транспортировки готовой продукции обеспечивает высокое качество вакцины, полностью соответствующее требованиям НД.
Однако несмотря на полное соблюдение температурного режима хранения готового препарата, не исключены возникновения «форс-мажорных» ситуаций, которые приводят к нарушению необходимых условий хранения (сбои в центральной электросети, нарушение работы холодильной камеры и электронных температурных датчиков). Вакцина «ГЕП-А-ин-ВАК» относится к классу сорбированных вакцин, в состав которых входит гидроксид алюминия, поэтому соблюдение «холодовой цепи» имеет очень важное значение.
Целью настоящей работы является характеристика физико-химических и иммунологических свойств готовой вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» при различных температурных режимах хранения.
Материалы и методы_
Исследовали четыре серии вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» (культуральная очищенная концентрированная адсорбированная инактивированная жидкая). Из каждой серии методом случайной выборки отбирали по 20 ампул вакцины для определенного температурного режима. Каждую партию исследуемой вакцины хранили в течение месяца при различных температурах -20 °С.; +20 °С.; +37 °С (табл. 1). В качестве контроля использовали соответствующие серии вакцины, которые хранились в течение месяца в полном соответствии с регламентом при температуре 6 ± 2 °С. После в течение одного месяца в каждой группе исследуемой вакцины проводили визуальный контроль, определяли содержание алюминия, наличие механических включений, иммуногенную активность ВГА и содержание АГ ВГА. Полученные результаты сравнивали с результатами в контрольных группах.
Определение содержания ионов алюминия в вакцине. Контроль осуществляли в соответствии с методикой по МУК 4.1 -4.2588-096. Метод основан на реакции комплексообразования ионов алюминия с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б) и последующим обратном титровании избытка трилона Б. В качестве эталона использовали ОСО 42-28-333-200417 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, с
Э
ПРЕПАРАТЫ
изначальной концентрацией ионов алюминия от 0,75 до 1,11 мг/мл. Содержание алюминия в миллиграммах на 1 мл (X) вычисляли по формуле:
X=KznS04*(V- V0) х 0,2698/Vn,
где KZnS04 — поправочный коэффициент к титру раствора сульфата цинка (0,01 моль/л);
V — количество раствора сульфата цинка (0,01 моль/л);
Vq — количество раствора сульфата цинка (0,01 моль/л), необходимое для титрования контрольной пробы (мл);
Vn — количество препарата, взятого для анализа (мл);
0,2698 — содержание алюминия (мг) соответствует 1 мл раствора трилона Б с концетрацией 0,01 моль/л.
Визуальный контроль вакцины. Все опытные партии вакцины исследовали визуально. В качестве контроля сравнения использовали серии вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК», которые хранили при температуре 6 ± 2 °С, согласно требованиям ФСП и Регламента производства.
Определение содержания антигена вирусного гепатита А (АГ В ГА) в вакцине после десорбции. Определение антигена проводили в два этапа.
1) Определение антигена в надосадочной жидкости.
2) Определение антигена ВГА после десорбции.
Раствор для десорбции АГ ВГА с алюминием гидроокиси содержит: 0,1% раствор желатина; 0,4 М раствор Na2HP04 х 12 Н20 с 0,11% ЭДТА и 0,1% раствор Твин 20. В 30 мл дистиллированной воды растворяли 50 мг желатина — 0,1%. В раствор добавляли 7,16 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водно-го — 0,4 М; 55 мг ЭДТА — 0,11 %; 50 мл раствора Твин 20. Конечный объем раствора доводили до 50 мл, pH = 8,5 (раствор А).
1 мл исследуемой вакцины центрифугировали в одноразовых пробирках (Eppendorf) при 6000 оборотах в
минуту — 5 мин при комнатной температуре. Надоса-дочную жидкость аккуратно переносили в чистую пробирку и анализировали в ИФА на полноту сорбции антигена. К осадку добавляли ранее приготовленный раствор А, до конечного общего объема 1 мл. Полученный раствор тщательно перемешивали и оставляли на ночь при температуре 4 °С.
Утром осадок центрифугировали 5 мин при комнатной температуре при 6000 оборотах в минуту. Надоса-дочную жидкость исследовали в ИФА для определения антигена вирусного гепатита А (АГ ВГА) в полном соответствии с инструкцией по применению ИФА тест-системы.
Для определения титра использовали тест-системы для выявления АГ ВГА «Вектогеп А антиген» производства ЗАО «Вектор-БиАльгам». Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Для оценки результатов анализа исследуемого образца вычисляли контрольный уровень оптической плотности: ОПкрит. = ОПк — среднее 2,1, где ОПк — средняя величина ОП в лунках с отрицательным контролем. Исследуемые пробы, оптическая плотность которых в 2,1 раза больше среднего значения ОПк, считали положительными.
Определение иммуногенной активности ВГА в вакцине. Вакцина должна индуцировать образование антител к вирусу гепатита А у однократно иммунизированных мышей. Метод контроля основан на определении дозы вакцины, способной вызвать образование антител к ВГА у 50% мышей (ИД50). Величина ИД50 не должна превышать 20 ед. ИФА. Контроль иммуноген-ности вакцины проводили на здоровых белых нелинейных мышах массой 15-20 г. Методом случайной выборки формировали опытные (по 6 мышей в каждой) и одну контрольную группы из трех мышей. Количество опытных групп соответствовало количеству использованных разведений. Мышам опытных групп вводили разведение вакцины (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) в объеме 1 мл подкожно, что соответствовало 40, 20, 10, 5 ИФА ед. Мышам контрольной группы по той же схеме и тем же способом
Таблица
Результаты испытания вакцин «ГЕП-А-ин-ВАК» при разных температурных режимах хранения
Серия препарата, дата изготовления
Содержание ионов алюминия в вакцине, мг/мл (норма: 0,35-0,65 мг/мл) Иммуногенная активность ВГА в вакцине, ИФА ед. (норма: менее 20 ИФА ед.) Титр АГ ВГА в вакцине после десорбции
^ Опыт Контроль (хранение { мес.) Контроль Хранен™1! мес.) .г Опыт Контроль (хранение ! мес )
Температура, °С
+4 -20 +20 +37 +4 -20 +20 +37 +4 -20 +20 +37
№ 68, 10.03.06. 0,49+0,04 0,48**± 0,04 0,49**± 0,50**± 0,0 0,09 4,49+0,24 31,7*± 5,01**+ 8,35*± 2.8 0,54 1,15 1:64 0 1:64 1:64
№ 70, 07.04.06. 0,43±0,06 0,45**+ 0,42**± 0,44**± 0,04 0,07 0,06 5,64+0,32 26,0*± 4,46**± 6,38**± 2,2 0,73 2,33 1:32 0 1:32 1:32
№ 66, 18.01.06 г 0,49±0,03 0,49**+ 0.04 0,49**+ 0,49**+ 0,09 0,07 5,62±0,15 30,0*± 5,08**± 6,33**± 3,3 0,67 1,33 1:64 0 1:64 1:64
№ 90,15.11.07. 0,49+0,07 0,45**± 0,04 0,46**± 0,49**+ 0,03 0,04 5,68+0,66 28,6*± 4,48**± 6,81* ± 3,4 0,80 1,67 1:32 1:4 1:32 1:32
Примечание: * — показатель достоверно отличается от показателя в контроле (р >0,1); ** — показатель достоверно не отличается от показателя в контроле (р < 0,05).
G
вводили сорбент — гидроксид алюминия на фосфатно-солевом буфере в таком же объеме наружно. Исходная концентрация антигена ВГА составляла 80 ИФА единиц. Через 28-30 дн. от животных опытной и контрольной групп получали сыворотку в объеме не менее 0,1 мл. Каждый полученный образец сыворотки тестировали на наличие антител к вирусу гепатита А, используя для этого коммерческие ИФА тест-системы «Вектогеп А антитела», производства ЗАО «Вектор-БиАпьгам», для выявления антител к вирусу гепатита А с чувствительностью не менее 20 мМЕ/мл. Постановку и учет результатов осуществляли в соответствии с Инструкцией по применению тест-системы при длине волны 450 нм.
Результаты контроля учитывали, если все образцы сывороток мышей контрольной группы идентифицированы как отрицательные. В этом случае расчет ИД50 осуществляли по результатам, полученным в опытных группах, по методу Кербера в соответствии с формулой:
1д ИД50 = 1д ОЛ/ - 5х(Х /_, - 0,5),
где 014 — максимальная величина вводимой дозы;
1д йЫ — логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей, т.е. логарифм кратности испытанных разведений;
Ц — отношение числа иммунных животных к числу всех животных в конкретной опытной группе;
ХЦ — сумма всех значений 1_1 ;
ИД50 = ап\\ 1д (1д ИД50).
Результаты и обсуждения_
Визуальный контроль исследуемых серий вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» в сравнении с контрольными образцами показал полное их соответствие с требованиями НД и регламента. Вакцина при всех температурных режимах хранения представляла слегка опалесцирующу-юся жидкость, которая при отстаивании разделялась на два слоя: верхний — прозрачная, бесцветная жидкость, нижний — осадок белого цвета, легко разбивающийся при встряхивании, без хлопьев и механических включений.
Результаты контроля содержания ионов алюминия в четырех сериях вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» при температуре хранения -20 °С; +20 °С; +37 °С в течение 1 мес., показали, что в сравнении с контролем (хранение согласно ФСП при 6 ± 2 °С) показатели содержания ионов алюминия (0,45-0,49 мг/мл), практически не отличались от аналогичных в контрольных пробах (0,43-0,49). Данные представлены в таблице.
Определение титра АГ ВГА показало: в испытуемых образцах с температурным режимом хранения -20 °С, титр АГ ВГА или не определялся, или не превышал зна-
чений 1:4-1:8; при температуре хранения +20 °С и +37 °С находился в пределах 1:32-1:64, что полностью соответствует данным определенных в контрольных пробах (таблица). В надосадочной жидкости АГ ВГА не обнаруживался.
Контроль определения иммуногенной активности ВГА в вакцине «ГЕП-А-ин-ВАК» показал, что по сравнению с контролем, в пробах вакцины с температурой хранения -20 °С (замораживание), иммуногенная активность ВГА в ИФА единицах резко отличалась от нормируемых показателей (таблица).
Пробы вакцины с температурным режимом хранения +20 °С и +37 °С по показателю «иммуногенная активность» соответствуют требованиям ФСП — «менее 20 ИФА ед.». Данные проверки варьируют в пределах от 4,46 до 14,3 ед. ИФА (таблица).
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что вакцина «ГЕП-А-ин-ВАК» при хранении в течение месяца при температуре +20 °С, +37 °С достоверно не отличается по всем показателям от контрольных проб и полностью соответствуют требованиям НТД. В то же время вакцина при хранении при температуре -20 °С (заморозка) при сохранении физико-химических свойств резко отличается по иммуногенной активности и титру АГ ВГА от контрольных показателей.
Литература
1. Безопасное обращение с вакцинами, «холодо-вая цепь» и иммунизация. Пособие для стран СНГ ВОЗ, ЮНИСЕФ, Бэйсикс/Юсаид, WHO/EPI/LHIS 98/02 Original: English Distr.: General.
2. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03.
3. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтации. Санитарные правила СП 1.2.731-99.
4. Медуницин Н.В./Вакцинология. — М.: Триада. — X. - 2004. - С. 446.
5. Мешковский А.П.//Фарматека. — 2000. — № 3. — С. 27-30.
6. Об организации на территории страны системы «холодовой цепи» при транспортировке и хранении медицинских иммунобиологических препаратов. Приказ МЗ СССР и Минмедбиопрома СССР № 827/672 от 18.11.1988г.
7. Условия транспортирования и хранения медицинских иммунобиологических препаратов. Санитарно-эпидемиологических правила СП 3.3.2.1248-03 МЗ РФ. М., 2003. — 19 с.
8. Ясинский А.А.//Вакцинация. — 2000. — № 3. — С. 9.
