CC BY
21
^'Сентябрь
-декабрь 2009 г.
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ С ПОЛИОКСИДОНИЕМ ПРОТИВ ГЕПАТИТОВ А ИВ- «ГЕПОЛ А+В»
'Карпович Л.Г.,1Карпова Е.В.,1Шалунова Н.В., 2КуслийА.Г.,1Ермолаева Т.Н.,1Бочарова Н.В., 1Мусина Е.Е., гЕльшина Г.А., 2Мунтянова М.А.,1Игнатьев Г.М., Торбунов М.А.
Институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва
2ЗА0 «Вектор-БиАльгам», Новосибирск
Целью работы являлось создание комбинированной вакцины против гепатитов А и В с введением в ее состав иммуномодулятора полиоксидония. В процессе работы были использованы более 20 комбинаций различных доз антигенов В ГА и ВГВ и полиоксидония. По компоненту ВГА усиление иммунного ответа отмечалось при использовании различных концентраций полиоксидония: 500, 200 и 100 мкг/мл, при этом было показано, что антигенная нагрузка компонента гепатита А 25-40 ИФА ед. с 200 мкг/мл полиоксидония обеспечивает адекватный иммунный ответ равный полной дозе антигена ГА (50-80 ИФА ед.) в препарате без полиоксидония. При содержании в вакцине половинной дозы НВэ Ад, равной 10 мкг/мл и полиоксидония в концентрации 200 мкг/мл, наблюдалась наиболее выраженная иммунная реакция у животных.
Кроме того было показано, что иммуногенность дивакцины по компоненту гепатита В не зависела от происхождения НВэ Ад и от субстрата его производства (дрожжи ЗассЬагатусеэ сегеуеБ/зе - вакцина «Комбиотех» и Р^сИ/а раэ^пБ - «Шанвак В»). Таким образом, на основании результатов экспериментальных исследований оптимальной по показателям иммуногенности, наиболее перспективной для проведения клинических испытаний является композиция вакцины «ГЕПОЛ А+В», содержащая половинную дозу НВв Ад (10 мкг/мл) с 200 мкг/мл полиоксидония.
Проведенные доклинические испытания позволили разработать и изготовить экспериментально-производственные серии вакцины «ГЕПОЛ А+В» и приступить к проведению клинических испытаний указанных серий препарата.
Вирусные гепатиты (ВГ) человека представляют сложную для здравоохранения проблему, все еще далекую от своего решения. Согласно данным ВОЗ, в разных странах мира вирусными гепатитами инфицировано более одного миллиарда человек (1,2, 6).
В настоящее время, как и ранее, сохраняется высокий эпидемический потенциал всех известных ВГ, это относится не только к развивающимся странам Азии и Африки, но и к высокоразвитым странам Европы и Северной Америки.
Вакцинопрофилактика на сегодняшний день является основным средством борьбы с гепатитом А (ГА) и гепатитом В (ГВ). Вакцинация против ГВ насчитывает уже более, чем двадцатилетний опыт. Девяностые годы ознаменовались созданием первых лицензированных вакцин против ГА. Таким образом, ГА станет вторым ВГ, против которого стала возможной активная иммунизация населения. Стойкий профилактический эффект длительностью более 15 лет обеспечивается при 2-3-х кратном введении вакцин. Раздельное введение нес-
Э
кольких вакцин вряд ли можно считать оптимальным для массового применения, поскольку увеличение количества инъекций может привести к повышению числа поствакцинальных осложнений.
В настоящее время разрабатываются и внедряются в практику здравоохранения, так называемые, ассоциированные вакцины, содержащие от 2 до 5-6 различных антигенов. Так, в частности, в нашей стране предприятием ЗАО «Вектор-БиАльгам» (г. Новосибирск) была разработана комбинированная вакцина против гепатитов А и В - «Геп-А+В-ин-ВАК». Вакцина прошла доклинические и клинические испытания, при этом была показана ее безопасность, слабая реактогенность и высокая иммуногенность при вакцинации по схеме 0-1 -6 мес. Вакцина содержит 20 мкг HBs Ад, 50-80 ИФА ед. антигена гепатита А, т.е. антигенная нагрузка ее аналогична таковой в монопрепаратах (5).
С целью снижения антигенной нагрузки в дивакцине, что является достаточно актуальной проблемой, связанной как с влиянием вакцинации на организм приви-
ПРЕПАРАТЫ
ваемых, особенно детских контингентов, так и со снижением стоимости препарата, были запланированы исследования, направленные на уменьшение в препарате количества антигенов за счет введения в ее состав им-муномодуляторов (3, 4, 6).
Учитывая иммуностимулирующие свойства полиок-сидония (ПОЛ) и установленную его способность повышать иммуногенную активность моновакцин против ГА и гриппа, было начато изучение влияния его на иммуногенную активность комбинированной вакцины против ГА и ГВ «Геп-А+В-ин-ВАК» (3,4). При этом основной задачей являлось экспериментальное изучение иммуно-генной активности нескольких вариантов вакцины с различным содержанием антигенов вирусов ГА, ГВ и ПОЛ с целью выбора наиболее оптимальной композиции препарата.
Материалы и методы Вакцинные препараты
1. Вакцина против гепатитов А+В очищенная концентрированная адсорбированная инактивированная жидкая, производства ЗАО «Вектор-БиАльгам» ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск). Изначальное содержание антигена вируса гепатита А (АГ ВГА) в указанном препарате соответствовало требованиям, изложенным в НД на вакцину «Геп-А-ин-ВАК», и составляло не менее 50 ИФА ед/дозу (1 ИФА ед. соответствует 0,5 нг вирусного белка) и 20 мкг НЬб Ад вируса ГВ.
2. Экспериментальные серии вакцины с ПОЛ - «Геп-А+В-ин-ВАК-ПОЛ» с регламентированным НД и со сниженным в 2 раза содержанием антигена вирусов ГА и ГВ в дозе препарата и ПОЛ в концентрации 200 мкг/мл. С целью оценки универсальности действия ПОЛ на компоненты вакцин против ГВ, изготовленных по различным технологиям, вакцина «Геп-А+В-ин-ВАК-ПОЛ» была произведена в 2-х вариантах: компонент «В» НПК «Комбиотех» и вакцина «Шанвак В» в количестве по 10 мкг/мл НЬб Ад + 200 мкг ПОЛ, компонент «А» в количестве 25 - 40 ИФА ед.
3. В экспериментальных исследованиях был использован коммерческий препарат ПОЛ, который применялся в лекарственной форме в концентрации 100, 200, 500 мкг/мл.
Лабораторные животные
Эксперименты проводились на белых аутбредных мышах, самцах (массой 18-20 г) и мышах Ва1Ь/с (массой 12-14 г). При иммунизации мышей были сформированы опытные и контрольные группы по 10 особей в каждой. Препараты с различным содержанием АГ ВГА, АГ ВГВ и ПОЛ вводили однократно в объеме 1,0 мл подкожно в две точки или внутрибрюшинно (компонент ГВ).
Через 28-30 дней от мышей получали кровь, готовили сыворотку и определяли в ней специфические антитела к ВГА и ВГВ с помощью ИФА. С этой целью были использованы лицензионные ИФА тест-системы. Для выявления суммарных антител к вирусу ГА использовали тест-системы «Вектогеп-А-антитела» производ-
ства ЗАО «Вектор-БиАльгам» (Новосибирск). Изучение антител к НЬб Ад производили с помощью ИФА в тест-системах производства ЗАО «Вектор-Бест» и НПО «Диагностические препараты» с чувствительностью 5-10 мМЕ/мл. Чувствительность тест-систем, а также уровень антител в сыворотках животных определяли в сравнении с ОСО иммунногенной активности ГВ (ОСО 42-28-302-00).
Иммуногенный эффект компонента А оценивали по показателям 50 % иммунизирующей дозы (ИД50), которую рассчитывали по методу Кербера, а также по уровню специфических антител к ВГА, которые оценивали по показателям их титров при иммунизации мышей двукратными разведениями вакцины от 1:2 до 1:32.
Определение иммуногенности компонента В (НЬв Ад) проводили в опытах на мышах
В тесте ин виво дивакцина должна стимулировать выработку антител к гомологичному подтипу НЬэ Ад (анти-НЬб) у однократно иммунизированных трехкратными от 1:24 до 1:648 разведениями вакцины мышей линии Ва1Ь/с (массой 12-14 г, самки 5-недельного возраста). Отношение дозы ОСО иммуногенной активности ГВ, вызывающей выработку анти-НЬв у 50 % мышей (ИД50), к ИД50 испытуемой дивакцины, должно быть не менее 0,5. Рассчитывается методом пробит анализа или методом скользящих средних.
Доклинические испытания экспериментально-производственных серий вакцины «Геп-А+В-ин-Вак» и «Геп-А+В-ин-Вак-ПОЛ» осуществляли с учетом требований и методов контроля (стерильность, токсичность, апирогенность, биохимические исследования и т.п.) в соответствии с НД на указанные вакцины.
Результаты и обсуждение
Экспериментальные исследования по изучению влияния иммуномодулятора ПОЛ на иммуногенную активность ассоциированной дивакцины против гепатитов А и В «Геп-А+В-ин-Вак», производства ЗАО «Вектор-БиАльгам» с сочетанным способом соединения вакцин и ПОЛ были проведены при использовании более 20 комбинаций различных доз антигенов ВГА и ВГВ и полиокси-дония (табл.1).
Было показано, что наиболее выраженное иммуностимулирующее действие ПОЛ у животных наблюдается при сочетанном введении его с вакцинами. Исследование иммуногенной активности на мышах 20 вариантов сочетанных форм вакцины, содержащей антигены ВГА и НЬэ в дозах, регламентированных в нормативных документах (НД) на монопрепараты, а также уменьшенные в 2 и 4 раза при концентрациях в них ПОЛ 100, 200 и 500 мкг на дозу и без него показали, что по компоненту ВГА наиболее эффективными оказались композиции, содержащие цельную или сниженную в 2 раза дозу антигена ВГА и половинную дозу НЬэ Ад (10 мкг/мл) и концентрации ПОЛ в обоих случаях 200 и 500 мкг/мл.
Содержание ПОЛ, равное 500 мкг/мл в указанном варианте вакцины существенно не влияло на иммунный ответу
С
-декабрь 2009 г.
Таблица 1
Исследованные варианты композиций вакцины «Геп-А+В-ин-Вак» с полиоксидонием
Содержание в препарате
N группы П/п АГ ВГА НВвАГ ПОЛ
в ИФА ед. в мкг/мл мкг/мл
Цельная вакцина
1. 80 20 0
2. 80 20 100
3. 80 20 200
4. 80 20 500 Разведение вакцины 1:2
5. 40 10 0
6. 40 10 100
7. 40 10 200
8. 40 10 500 Разведение вакцины 1:4
9. 20 5 0
10. 20 5 100
11. 20 5 200
12. 20 5 500
13. Контрольные животные
Цельная вакцина Разведение вакцины 1:2
14. 50 10 0
15. 50 10 200-250
16. 50 10 500 Разведение вакцины 1:2
17. 25 10 0
18. 25 10 200-250
19. 25 10 500
20. Контрольные животные
животных по сравнению с концентрацией 200 мкг/мл. Поэтому наиболее оптимальной по дозе антигенов ВГА и ВГВ и содержанию ПОЛ является композиция вакцины, содержащая половинные дозы указанных антигенов и ПОЛ в концентрации 200 мкг/мл. Изучение иммуно-генности компонента ГА в дозе 25-40 ИФА ед. в дивак-
цине с 200 мкг ПОЛ показало, что показатели иммунного ответа совпадали с результатами, полученными при введении животным препарата без ПОЛ, содержащего 50-80 ИФА ед. антигена ГА (табл. 2).
Эта композиция была предложена для приготовления экспериментально-производственных серий вак-
Таблица 2
Иммуногенная активность экспериментальных серий вакцины «Геп-А-В-ин-Вак- ПОЛ» по компоненту ВГА
Вакцина серия
Содержание в дозе препарата
АГ ВГА (в ИФА Ед)
НВвАГ В мкг/мл
Полиоксидоний в мкг
Показатель
ИД50 (в ИФА Ед)
«Геп-А+В-ин-Вак» сер. 08 50
«Геп-А+В-ин-Вак-ПОЛ» сер. 11 25
«Геп-А+В-ин-Вак-ПОЛ» сер. 12 25
Э
*) Требования НД - ИД50 не более 20 ИФА Ед.
10 10 10
о 200 200
*)
15,2 8,13
4,07
РЕПАРАТЫ
цины «Геп-А+В-ин-Вак-ПОЛ» с содержанием в ее составе 25 - 40 ИФА ед. антигена гепатита А, 10 мкг НЬв Ад и 200 мкг/мл ПОЛ. На указанную вакцину составлена соответствующая нормативная документация: ФСП, ЭПР, инструкция по применению. В ГИСК им. Л.А. Тара-севича были исследованы две экспериментально-производственные серии указанной композиции дивакцины для их аттестации контроля качества, а также пакет НД для экспертизы.
Контроль двух серий инактивированной сорбированной на алюминия гидроксиде ассоциированной вакцины против гепатитов А и В с иммуномодулятором ПОЛ -«Геп-А+В-ин-Вак-ПОЛ» показал, что по всем параметрам вакцина соответствовала требованиям НД, предъявляемым к аналогичным препаратам. Приготовленные серии были стерильны, нетоксичны и апи-рогенны, иммуногенность препарата по отношению к ООО составляла от 1,0 до 1,5. Содержание белка, мертиолята и алюминия во всех сериях соответствовало требованиям НД.
Были проведены также дополнительные экспериментальные исследования, связанные с изучением различных компонентов (НЬэ Ад) гВ в дивакцине против гепатитов А и В с ПОЛ. Основанием для проведения этих исследований послужили результаты клинических испытаний вакцины против ГВ «Шанвак В» (Индия), которые показали высокую иммунологическую активность этой вакцины и экономическую целесообразность ее использования в дивакцине.
Изучение иммуногенности НЬэ Ад показало, что она не зависит от субтипа НЬэ Ад (ау - «Комбиотех» и ас! -«Шинвак В») и от субстрата производства (дрожжи БассИагатусез сегеуес1ае - «Комбиотех» и РюЫа раБ^пэ -«Шинвак В»). Оба варианта препарата соответствовали требованиям НД. При сравнительном изучении иммуногенности комбинированных вакцин с использованием рекомбинантного НЬэ Ад было показано, что ИД50 для мышей после введения дивакцины с НЬэ Ад «Комбиотех» в данном опыте составляла 0,28 мкг (I); «Шинвак В» 0,18 мкг (II); ОСО - 0,27 мкг. Относительная потенция дивакцины составляла - 0,97 (I) и 1,5 (II) при норме>0,5 (в соответствии с НД). Таким образом, сравнительные испытания экспериментально-производственных серий дивакцины с использованием в качестве компонента В вакцины «Комбиотех» и «Шанвак В» показали их высокую иммуногенность.
В настоящее время для проведения клинических испытаний изготовленные 3 экспериментально-производственные серии дивакцины «Геп-А+В-ин-Вак-ПОЛ», получившей наименование «ГЕПОЛ А+В», с компонентами вакцины против ГВ «Комбиотех» и «Шанвак В».
По результатам проведенного контроля в ГИСК им. Л.А. Та-расевича 3-х экспериментально-производственных серий вакцины «ГЕПОЛ А+В» были получены следующие показатели антигенной нагрузки и содержания ПОЛ в одной прививочной дозе ( 1,0 мл):
Серия № 050306 вакцины «ГЕПОЛ А+В» была приготовлена на основе полуфабриката вакцины ГА серии № 74, полученного ЗАО «Вектор-БиАльгам», в составе не менее 40 ИФА ед. антигена ГА и полуфабриката вакцины ГВ (ЗАО НПК «Комбиотех») с содержанием Hbs Ад 10 мкг/мл и 200 мкг ПОЛ. Серия № 060306 вакцины «ГЕПОЛ А+В» была приготовлена на основе полуфабриката вакцины ГА серии № 74, полученного ЗАО «Вектор-БиАльгам», в составе не менее 40 ИФА ед. антигена ГА и полуфабриката вакцины ГВ («Шинвак-В») с содержанием Hbs Ад 10 мкг/мл и 200 мкг ПОЛ. Серия № 110604 вакцины «ГЕПОЛ А+В» была приготовлена на основе полуфабриката вакцины ГА серии № 61, полученного ЗАО «Вектор-БиАльгам», в составе не менее 40 ИФА ед. антигена ГА и полуфабриката вакцины ГВ (ЗАО НПК «Комбиотех») с содержанием Hbs Ад 10 мкг/мл.
Контроль трех экспериментально-производственных серий дивакцины против гепатитов А и В с иммуномодулятором показал, что по всем параметрам вакцина «ГЕПОЛ А+В» соответствует требованиям НД. Приготовленные серии стерильны, не токсичны и апирогенны, иммуногенность препарата по отношению с ОСО Hbs Ад ГИСК составляет от 1,0 до 1,5. Содержание белка, мертиолята и алюминия во всех сериях соответствовало НД. Таким образом, результаты испытаний трех экспериментально-производственных серий вакцины «ГЕПОЛ А+В» свидетельствуют, что они обладают высокой иммуногенностью в отношении обоих компонентов вакцины, апирогенны и нетоксичны. Все три изученные серии препарата стандартны по выпускаемым параметрам.
Литература
1. Соринсон С.Н. «Вирусные гепатиты в клинической практике», 1996 г.
2. Ghendon Y Z. In: Control of virus disease. Ed.E.Kurstak 2d ed. Marcel Dekker Inc., 1993, P.141 - 164.
3. Бектимиров T.A. с соавт., «Аллергия, астма и клиническая иммунология» № 1, М. 2001, стр. 63 - 65.
4. Бектимиров Т.А. с соавт., там же № 1, 2000, стр. 73 - 76.
5. Икоев В.Н. с соавт. «Биопрепараты» - 2004. - №3 (15). -С. 14- 17.
6. Учайкин В.Ф. и др. «Вирусные гепатиты» М.2003 г.
G
