CC BY
65
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 6, 2014
УДК 612.398:577.121.3
________ «_* ______ _
філогенетичний аналіз
ШТАМІВ-ПРОДУЦЕНТІВ ЛІЗИНУ ПОРІВНЯННЯМ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ГЕНА 16S рРНК
Г. С. Андріяш1 Г. М. Заболотна1
B. С. Бондаренко2
C. М. Шульга1
1ДУ «Інститут харчової біотехнології і геноміки НАН України», Київ
2ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Україна
E-mail: [email protected]
Отримано 30.07.2014
Досліджено філогенетичні зв’язки штамів-продуцентів незамінних амінокислот аспартатної родини Brevibacterium sp. УКМ Ас-674 (Brevibacterium sp. 90), Brevibacterium sp. ІМВ Ас-5004 (Brevibacterium sp. 90Н), Brevibacterium sp. УКМ Ас-675 (Brevibacterium sp. Е531) та мутантного штаму ІМВ В-7447 із «Колекції штамів мікроорганізмів і ліній рослин для харчової та сільськогосподарської біотехнології» ДУ «Інститут харчової біотехнології і геноміки НАН України». За секвенованою послідовністю гена 16S рРНК підтверджено належність дослідженого мутантного штаму ІМВ В-7447 до роду Brevibacterium.
Побудовано дендрограму філогенетичних зв’язків досліджених штамів і споріднених з ними штамів бревібактерій. Показано, що за рівнем гомології послідовностей гена 16S рРНК ці штами-продуценти належать до трьох філогенетичних груп.
Встановлено, що послідовність гена 16S рРНК мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 не має аналогів у базі даних GenBank.
Ключові слова: Brevibacterium, ген 16S рРНК.
Потреби різних галузей промисловості зумовлюють інтенсифікацію виробництва амінокислот, що супроводжується впровадженням нових та вдосконаленням існуючих технологій, пошуком дешевих субстратів і більш продуктивних штамів [1].
Особлива увага до бактерій Brevibac-terium пояснюється тим, що серед промислових штамів-продуцентів незамінних амінокислот понад 90% належить саме до цього роду [1, 2]. Видова ідентифікація цих бактерій тривалий час базувалася на морфологічних відмінностях, використанні діагностики та біохімічного аналізу. Такі дослідження давали неоднозначні результати, особливо у випадках споріднених родів і видів мікроорганізмів [3]. З огляду на неприпустимість подібних відхилень правильне визначення систематичного положення мікроорганізмів є важливим і невід’ємним етапом у їх практичному застосуванні.
Серед наявних методів сучасної систематики прокаріотів молекулярно-філогенетич-
на класифікація, що ґрунтується на порівнянні нуклеотидних послідовностей генів та побудові філогенетичних дендрограм, адекватно відображає філогенетичні зв’язки досліджуваних мікроорганізмів.
Деякі гени «домашнього господарства» (housekeeping genes) можуть бути використані для філогенетичного аналізу, однак більшість із них або недостатньо поширені, або занадто швидко змінюються під впливом зовнішнього середовища чи паралельно переносяться.
У філогенетичних дослідженнях бактерій використання гена 16S рРНК є досить ефективним, оскільки його функції практично не змінились у процесі еволюції.
Метою роботи було визначення та підтвердження таксономічного положення дослідженого мутантного штаму-продуцента лізину Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 [4], який продукує амінокислоту в концентрації в 5 разів більшій, ніж вихідний (батьківський) штам-продуцент Brevibacterium
40
Experimental articles
sp. 90 із «Колекції штамів мікроорганізмів і ліній рослин для харчової та сільськогосподарської біотехнології» (далі Колекція) ДУ «Інститут харчової біотехнології і гено-міки НАН України», визначення послідовностей гена 16S рРНК штамів-продуцентів лізину з Колекції та встановлення їх філогенетичного положення в межах найбільш споріднених штамів роду Brevibacterium із бази даних GenBank [5].
Матеріали і методи
Об’єктами досліджень були ауксотрофні (лейцинозалежні) штами-продуценти лізину Brevibacterium sp. 90 Н, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. E 531 та мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 із Колекції.
Умови культивування та середовища. Для вирощування штамів-продуцентів лізину використовували повноцінні живильні середовища (ППС) такого складу: м’ясо-пеп-тонний агар (МПА) (г/дм3): поживний бульйон — 23,0, агар — 30,0, вода дистильована, pH 7,0 ± 0,1, та м’ясо-пептонний агар збагачений (МПАзб.) (г/дм3): поживний бульйон — 23,0, глюкоза — 1,0, дріжджовий екстракт -5,0, агар — 30,0, вода дистильована, pH 7,0 ± 0,1 [1].
Реактиви. Приготування реагентів для біохімічних та електрофоретичних досліджень здійснювали на основі очищеної деіонізованої води (система DIRECT Q3, Millipore, Франція).
ДНК виділяли за допомогою відповідного набору реагентів (Fermentas, Литва). Для електрофорезу використовували агарозу (Sigma, США), бромід етидію (базовий розчин концентрацією 10 г/дм3) та бромфеноло-вий синій (Sigma, США).
Для виділення ДНК клітини бактерій брали з однодобової культури на МПБзб. за температури 30 ± 1 °С в умовах аерації за 220 хв1 (шейкер BIOSAN ES-20, Латвія).
Виділяли ДНК за стандартною процедурою для грампозитивних бактерій згідно з [6]. Для більш ефективного лізису клітин додавали 1% лізоциму (10 мг/мл). Виділену ДНК досліджували горизонтальним електрофорезом та ПЛР [7-10]. Електрофоретичне розділення ДНК проводили в 1%-му агарозному гелі в трис-ацетатній буферній системі. Молекулярну масу фрагментів ДНК визначали за їхньою електрофоретичною рухливістю, використовуючи маркер 1kb — ДНК (1kb Fermentas SM1163) [7].
Умови проведення ПЛР. Ампліфікацію гена 16S рРНК здійснювали за допомогою
універсальних бактеріальних праймерів 27f та 907r (27F 5'-AGA GTT TGA TGG CTC AG-3'; 907r 5'-CCG TCA ATT CCA TTT GAG TTT-3'). ПЛР проводили на ампліфікаторі Mastercycler personal 5332 (Eppendorf, США). Реакційна суміш складалася з одноразового ПЛР-буфера із сульфатом амонію, 0,2 мкМ відповідних праймерів, 200 мкМ кожного з дезоксинуклеотидтрифосфатів, 0,5 од. Taq-полімерази (Fermentas, Литва), 2,0 мМ хлориду магнію, 10-50 нг ДНК-проби. Загальний об’єм реакційної суміші дорівнював 20 мкл.
Умови ампліфікації: початкова денатурація за Т = 95 °С — 3 хв; 32 цикли ампліфікації (Т = 94 °С — 30 с, Т = 57 °С — 45 с, Т = 72 °С — 30 с); кінцева елонгація відбувалася за Т = 72 °С протягом 5 хв [11]. Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації проводили в трис-ацетатно-му буфері. Фрагмент виділяли з агарозного гелю за допомогою набору «Macherey-Nagel NucleoSpin Extract» згідно з інструкцією фірми-виробника.
Після ампліфікації генів нуклеотидну послідовність амплікона визначали за допомогою сиквенатора ABI PRISM 310 Genetic Analyser) (Applied Biosystems, США). Результуючий контиг сиквенування одержували, порівнюючи пряму та зворотнокомпле-ментарну послідовності з використанням програми CLC Main Workbench (CLC bio). Гомологічні послідовності відбирали з бази даних GenBank [5].
Порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей. Філогенетичний аналіз. Із бази даних GeneBank було відібрано послідовності гена 16S рРНК різних представників родини бревібактерій, що мають найбільший рівень нуклеотидної подібності до сиквенованих фрагментів гена 16S рРНК досліджуваних штамів-продуцентів лізину. Для з’ясування систематичного положення цих штамів зі спорідненими було проведено вирівнювання відповідних нуклеотидних послідовностей у програмі ClustalW [12] і побудовано дендрограму філогенетичних зв’язків. Філогенетичний аналіз здійснено у програмі MEGA6 [13, 14].
Результати та обговорення
Для порівняння штамів-продуцентів лізину та мутантного штаму з Колекції зі спорідненими штамами було виділено ДНК цих бактерій і визначено нуклеотидну послідовність гена 16S рРНК. Чистоту виділеного фрагмента ДНК перевірили за допомогою електрофорезу (рис. 1).
41
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 6, 2014
Рис. 1. Електрофореграма фрагмента гена 16S рРНК (27f-907r):
1 — Brevibacterium sp. іМв В-7447;
2 — Brevibacterium sp. E531;
3 — Brevibacterium sp. 90;
4 — Brevibacterium sp. H
Ампліфікацію гена 16S рРНК здійснювали з використанням універсальних бактеріальних праймерів 27f та 907г з подальшим сиквенуванням.
Отримані послідовності гена 16S рРНК штамів Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. Е531, Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 було вирівняно одну відносно одної в програмі ClustalW, як наведено нижче:
Brevibacterium sp. 90
GCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTC
GAACGCTGAAGCACTGTGCTTGCACGGTGTG
GATGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTG
AGTAACCTGCCCCTGACTTCGGGATAAGCTT
GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATGTGACTA
CTGGCCGCATGGTCTGGTGGTGGAAAGGGTT
TTACTGGTTGGGGATGGACTCGCGGCCTATC
AGTTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGA
CGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGAC
CGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG
CACAATGGGGGGAACCCTGATGCAGCGACGC
CGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAA
ACCGCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTG
ACGGTACCTGCAGAAGAAGTACCGGCTAAT
ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGT
ACAAGCTTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAA
GAGCTCGTAGGTGGTTGGTCGCGTCTCCTGTG
GAAACGCAACGCTTAACGTTGCGCGTGCAGT
GGGTACGAGCTGACTAGAGTGCAGTAGGGG
AGTCTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAAT
GCGCAGATATAAGGAGGAACACCGGTGGCG
AAGGCGGGACTCTGGGCTGTAACTGACGCT
GAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGG
ATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAAC
GTTGGGAACTAGGTGTGGGGTCCGTTCCACG
GATTCCGTGCCGGAGTAACGCATTAAGTTCC
CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAA
CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC
Brevibacterium sp. 90H
CGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAAC
CTGCCCCTGACTTCGGGATAAGCCCGGGAA
ACTGGGTCTAATACCGGATACGACTGCCGG
ACGCATGTCTGGTGGTGGAAAGTTTTTTCG
GTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGTTT
GTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGACGAC
GACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGG
CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT
CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG
CACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCGAC
GCAGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTG
TAAACCGCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCA
AGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGTACCGG
CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC
GTAGGGTACGAGCGTTGTCCGGAATTATTG
GGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTGGTCAC
GTCTGCTGTGGAAACGCAACGCTTAACGTT
GCGCGTGCAGTGGGTACGGGCTGACTAGAG
TGCAGTAGGGGAGTCTGGAATTCCTGGTGT
AGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGA
ACACCGGTGGCGAAGGCGGGACTCTGGGCT
GTAACTGACACTGAGGAGCGAAAGCATGG
GGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
TCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGT
GGGGGGCATTCCACGTTCTCCGCGCCGTAG
CTGACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGT
ACGGTCGCAAGCCTGGTGCTTGCACCGGGT
GGATGAGTGG
Brevibacterium sp. E 531
CCCTTCCAGCTTGCTGGGAGTGTGGTTG
AGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGT
AACCTGCCCTCCACTTCGGGATAAGCTTGG
GAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCA
GCCGAGGCATCTTGTGTTGGTGGAAAGTTT
TTTCGGTGGGGGATGGGCTCGCGGCCTATC
AGCTTGATGGTGGGGTAATGGCCTACCATG
GCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCG
ACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC
AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT
ATTGCACAATGGGGGGAACCCTGATGCAGC
GACGCAGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGG
TTGTAAACCGCTTTCAGCAGGGAAGAAGCG
GAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGTACC
GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
ACGTAGGGTACGAGCGTTGTCCGGAATTAT
TGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTGGTC
GCGTCTGCTGTGGAAACGCAACGCTTAACG
TTGCGCGTGCAGTGGGTACGGGCTGACTAG
AGTGCAGTAGGGGAGTCTGGAATTCCTGGT
GTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAG
GAACACCGGTGGCGAAGGCGGGACTCTGGG
CTGTGACTGACACTGAGGAGCGAAAGCATG
GGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTA
GTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTG
TGGGGGGCATTCCACGTTCTCCGCGCCGTAG
CTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGT
42
Experimental articles
ACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAAT
TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCAT
GCGGATTAATTCGATGCAACGCTTAACACA
TGCAAGTCGAACGCGAC
Breibacterium sp. ІМВ В-7447
GCTGGCGGCGACACATGCAAGTCGAAC
GCTGAAGCACTGTGCTTGCACGGTGTGGAT
GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAG
TAACCTGCCCCTGACTTCGGGATAAGCTTG
GGAAACTGGGTCTAATACCGGATGTGACTA
CTGGCCGCATGGTCTGGTGGTGGAAAGGGT
TTTACTGGTTGGGGATGGACTGCTTATCGC
GGCCTATCAGTTTGTTGGTGGGGTAGTGGC
CTACCAAGACGACGACGGGTAGCCGGCCTG
AGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGA
CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG
TGGGGAATATTGCACAATGGGGGGAGCAG
CGACGCCGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGG
GTTGTAAACCGCTTTCAGTAGGGAAGAAG
CGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGTA
CCGGCTAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
TACGTAGGGTACAAGCTTTGTACCCTGATC
CGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAG
GTGGTTGGTCGCGTCTCCTGTGGAAACGCA
ACGCTTAACGTTGCGCGTGCAGTGGGTACG
AGCTGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGTCTGG
AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGGATA
TAAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGG
ACTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG
AAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATA
CCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGGGAAC
TAGGTGTGGGGTCCGTTCCACGGATTCCGT
GCCGGAGTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTG
GGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAA
AGGAATTGACGGGGGCCCTT
Секвеновані послідовності відповідають таким положенням у гені 16S рРНК: 18-898, 87868, 75-938, 34-898 для Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. Е531 та Brevibacterium sp. ІМВ В-7447, відповідно.
Для встановлення родинних зв’язків здійснено філогенетичний аналіз і побудовано філогенетичне дерево. Мірою відповідності набору вирівняних послідовностей даної топології дерева вважають міру (критерій), що ґрунтується на принципі найбільшої правдоподібності. Було досліджено дендрограму філогенетичних зв’язків штамів Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. Е531 та Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 із Колекції і філогенетично близьких представаників роду Brevibacterium.
Нижче наведено філогенетичне дерево з найвищим значенням логарифма подібності (log-likelihood value) — 2018,5, побудоване за допомогою методу максимальної правдоподібності (махішиш likelihood) з використанням моделі Tamura-Nei [13] для оцінювання еволюційної відстані. Кількість повторів (bootstrap) — 1000 (рис. 2). Філогенетичне дерево, побудоване іншим статистичним методом — приєднання сусідів (Neighborjoining), — мало таку саму топологію.
Рис. 2. Дендрограма філогенетичних зв’язків деяких представників роду Brevibacterium
43
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 6, 2014
Із дендрограми випливає, що штами з Колекції за рівнем філогенетичної спорідненості за геном 16S рРНК належать до трьох груп. Перша — Brevibacterium sp. 90Н, Brevi-bacterium sp. FXJ8.052, Brevibacterium casei DY 40-62, Brevibacterium ammoniilyticum A1; друга — Brevibacterium sp. Е531, Brevibacterium sp. BS05; третя — Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. TUT та мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447.
Результати свідчать про філогенетичну гетерогенність досліджених штамів бреві-бактерій і підтверджують належність мутантного штаму Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 до роду Brevibacterium. Показано, що подібність сиквенованих фрагментів гена 16S рРНК Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 та вихідного штаму Brevibacterium sp. 90 становила 98% (обидва розташовані в межах однієї групи), а мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 не має аналогів у базі даних GenBank.
Збільшення накопичення лізину мутантним штамом Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 відбувається, можливо, внаслідок зміни
REFERENCES
1. Andriiash G. S., Zabolotna G. M., Shulga S. M. Regulation and intensification ways of lysine biosynthesis. Mikrobiologiia ta biotechnologiia. 2012, V. 4, P. 6-17 (In Ukrainian).
2. Andriiash G. S., Zabolotna G. M., Shulga S. M. Auxotrophity of producers of lysine Brevibacterium sp. Biotechnologia Acta. 2012, 1 (4), 70-77 (In Ukrainian).
3. Borshchevskaya L. N., Kalinina A. N., Sineokii S. P. Design of a PCR-test based on the gyrA gene sequence for identification of closely relative species of the Bacillus subtilis group. Biotekhnologiia. 2012, V. 3, P. 32-43 (In Russian).
4. Andriiash G. S., Zabolotna G. M., Shulga S. M. The mutant strains of microorganisms — producers of lysine and threonine. Biotechnologia Acta. 2014, 3 (7), 95-101.
5. GenBank (Base sequences of DNA) URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
6. Wilson K. Preparation of Genomic DNA from bacteria. Current protocol in Molecular biology. 2001, 2.4.1-2.4.5.
7. Fedorenko V., Ostash B., Rebets Y.,Gonchar M. Large workshop on genetics, genetic engineering and biotechnology analysis of microorganisms. Lviv. 2006, P. 185-188, 193-196. (In Ukrainian).
ключових генів (pyc, lysC, hom, dapA, mgo) в результаті мутагенезу.
Таким чином, молекулярно-філогенетичним аналізом послідовностей гена 16S рРНК підтверджено належність штамів-продуцен-тів незамінних амінокислот аспартатної родини з Колекції до роду Brevibacterium і встановлено філогенетичні зв’язки цих штамів та споріднених з ними штамів бревібактерій із бази даних GenBank. Показано, що подібність гена 16S рРНК Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 та вихідного штаму Brevibacterium sp. 90 становила 98% . Мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 належить до роду Brevibacterium. Послідовність гена 16S рРНК мутантного штаму Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 не має аналогів у базі даних GenBank.
Автори висловлюють подяку к. б. н. Кваско О. Ю. за допомогу в здійсненні аналізу геномної ДНК.
8. Martinenko O. I. Methods of molecular biotechnology: Laboratory workshop. Kyiv. 2010, P. 212-215, 221-223 (In Ukrainian).
9. Edwards K. Real-time PCR: An essential guide. K. Edwards, Logan J., Sauders N., Wy-mondham. HorizonBioscience. 2004, 346 p.
10. Melnichuk M. D. Biotechnology of plants.
D. Melnichuk, Т. V. Novak, V. A. Kunach. Eyiv: Poligraphconsalting. 2003, 520 p.
11. Guttel R., Larsen N., Woese C. Lessons from an evolving rRNA:16S and 23S rRNA structures from a comparative perspective. Microbiol. Rev. 1994, 8 (1), 10-24.
12. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994, 22 (22), 4673-4680.
13. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 1993, V. 10, P. 512-526.
14. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 2013, V. 30, P. 2725-2729.
44
Experimental articles
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЛИЗИНА СРАВНЕНИЕМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА 16S рРНК
А. С. Андрияш1 Г. М. Заболотная1 В. С. Бондаренко2
С. М. Шульга1
1ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины», Киев 2НУЦ «Институт биологии» Киевского национального университета имени Тараса Шевченко, Украина
E-mail: [email protected]
Исследованы филогенетические связи штаммов-продуцентов незаменимых аминокислот аспартатноого семейства Brevibac-terium sp. УКМ Ас-674 (Brevibacterium sp. 90), Brevibacterium sp. ИМВ Ас-5004 (Brevibacterium sp. 90Н), Brevibacterium sp. УКМ Ас-675 (Brevibacterium sp. Е531) и мутантного штамма Brevibacterium sp. ИМВ В-7447 из «Коллекции штаммов микроорганизмов и линий растений для пищевой и сельскохозяйственной биотехнологии» ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины». По секвенированной последовательности гена 16S рРНК подтверждена принадлежность полученного мутантного штамма ІМВ В-7447 к роду Brevibacterium.
Построена дендрограмма филогенетических связей исследованных штаммов и близкородственных к ним штаммов бревибактерий из баз данных GenBank. Показано, что по уровню гомологии последовательности гена 16S рРНК исследованные штаммы-продуценты относятся к трем филогенетическим группам.
Установлено, что мутантный штамм Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 не имеет аналогов в базе данных GenBank.
Ключевые слова: Brevibacterium, ген 16S рРНК.
GENE 16S rRNA SEQUENCE PHYLOGENETIC ANALYSIS OF LYSINE PRODUCERS STRAINS
G. S. Andriiash1 G. M. Zabolotna1 V. S. Bondarenko2
S. M. Shulga1
1State organization «Institute of Food Biotechnology and Genomics» of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2SEC «Institute of Biology» of Taras Shevchenko Kyiv National University, Ukraine
E-mail: [email protected]
The phylogenetic relationships of strains-producers of essential amino acids of aspartate family Brevibacterium sp. UCM Ac-674 (Brevibacterium sp. 90), Brevibacterium sp. IMV Ac-5004 (Brevibacterium sp. 90H), Brevibacterium sp. UCM Ac-675 (Brevibacterium sp. E531), mutant strain Brevibacterium sp. IMV B-7447 from the «Collections strains and lines of plants for food and agricultural biotechnology «SO «Institute for Food Biotechnology and Genomics of National Academy of Sciences of Ukraine» were investigated. The affiliation strain Brevibacterium sp. IMV B-7447 to the genus Brevibacterium within the sequences of the genes based on 16S rRNA was confirmed.
The dendrogram of phylogenetic relationships of studied strains and related strains Brevibacterium from database GenBank was constructed. It was shown that by the criterion of homology gene sequences based on 16S rRNA the investigated strains-producers belong to three phylogenetic groups.
It was established that the mutant strain Brevibacterium sp. MV B-7447 has no analogues in the database GenBank.
Key words: Brevibacterium, gene 16S rRNA.
45
