CC BY
164
УДК 612.398:547.965
AУКСОТРОФНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ ЛІЗИНУ
Г. С. Андріяш
Г. М. Заболотна ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки» НАН України, Київ С. М. Шульга
E-mail: Shulga5@i.ua
Отримано 25.10.2011
Проведено дослідження штамів-продуцентів лізину з «Колекції штамів мікроорганізмів та ліній рослин для харчової і сільськогосподарської біотехнології» ДУ «Інститут харчової біотехнології і геноміки» НАН України. Здійснено клоновий аналіз штамів після періодичного культивування продуцентів на мелясових середовищах. Встановлено, що Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. XI дають розщеплення колоній на два типи. Усі клони оцінено за біосинтетичною активністю щодо лізину. Перевірено ауксотрофність клонів до лейцину та амінокислот аспартатної родини. Відзначено мутаційні зміни в клонах, частина яких зберігала залежність від лейцину та набувала нової ауксотрофності до треоніну, метіоніну, триптофану, гомосерину та ізолейцину. Показано, що не всі клони стійкі до аналога лізину Я-аміно-етил^-цистеїну.
Для подальших досліджень з метою підвищення рівня біосинтезу лізину штамами-продуцентами Brevibacterium вибрано клони за біосинтетичною активністю стосовно цільової амінокислоти.
Ключові слова: амінокислоти, ауксотрофність, біосинтез, клони, лізин.
Незамінна амінокислота L-лізин є одним із джерел ацетил-КоА, складником просте-тичних груп ензимів та регуляторним чинником у метаболізмі інших амінокислот.
Лізин зареєстровано в Україні як субстанцію лікарських препаратів, як харчову та кормову добавку. Біологічні функції лізину в організмі пов’язані зі збільшенням об’єму м’язів та м’язової сили, поліпшенням короткотермінової пам’яті, запобіганням розвиткові атеросклерозу, остеопорозу, рецидивам герпесу, сприянням секреції травних ензимів, формуванням еритроцитів та транспортуванням кальцію і фосфору в клітини. Уведення лізину до кормо-сумішей дає змогу зменшити витрати кормів у виробництві тваринницької продукції [1-3]. Промислове мікробіологічне виробництво лізину сягає 1 млн. т/рік. В Україні, на жаль, виробництво лізину повністю відсутнє.
Одним із головних чинників ефективності біотехнології лізину є штам-проду-цент, основними властивостями якого є його продуктивність за цільовою амінокислотою, наявність мутаційних змін і потреба у факторах росту.
Більшість промислових штамів-проду-центів лізину є ауксотрофними мутантами [4, 5]. Їхня ауксотрофність пов’язана як зі змінами у відповідних генах, так і в ензиматичній регуляції біосинтезу лізину за принципом зворотного зв’язку.
Матеріали і методи
Об’єктами досліджень слугували аук-сотрофні (лейцинозалежні) штами-проду-центи лізину Brevibacterium ер. 90 Н, Brevibacterium ер. 90, Brevibacterium ер. ХІ, продуцент треоніну Brevibacterium flavum ТН-7, продуцент глютамінової кислоти Corynebacterium glutamicum з «Колекції штамів мікроорганізмів та ліній рослин для харчової і сільськогосподарської біотехно-логії» ДУ «Інститут харчової біотехнології і геноміки» НАН України.
Умови культивування та середовища. Для вирощування штамів-продуцентів лізину використовували повноцінні живильні середовища (ПЖС) такого складу: м’ясопеп-тонний агар (МПА) (г/дм3) — поживний бульйон — 23,0, агар — 30,0, вода дистильована, pH 7,0±0,1, та м’ясопептонний агар збагачений (МПАзб.) (г/дм3) — поживний бульйон — 23,0, глюкоза — 1,0, дріжджовий екстракт — 5,0, агар — 30,0, вода дистильована, pH 7,0±0,1.
Для отримання окремих клонів брали 0,2^10-3 дм3 та 1,0 •10-3 дм3 культуральної рідини з розведень 10-6 та 10-7, відповідно, і переносили в чашки Петрі, в які потім заливали охолоджений до температури 45±3 °С МПАзб. Інкубацію здійснювали в термостаті за температури 31±1 °С протягом трьох діб. Усі колонії, які виросли на збагаченому МПА, було взято для перевірки біосинтезу
лізину. Найбільш продуктивні клони відібрали для подальших досліджень. Клони пересівали один раз на квартал і зберігали на МПАзб. за температури +4 °С.
Перевірку на чистоту культури та продуктивність проводили один раз на рік (музейні культури).
Для визначення ауксотрофності клонів бактерій відбирали дводобову культуру, яку розводили у стерильному фізіологічному розчині до концентрації 1,5 •Ю10 КУО/дм3, що відповідало 1,0 оптичної густини (ОГ). ОГ вимірювали в кюветах з d = б,0 мм за довжини хвилі 440 нм фотоелектроколори-метром (модель КФК-3).
Отриманий інокулят переносили стерильно в: а) повноцінне середовище; б) мінімальне середовище (МС); в) МС із досліджуваною амінокислотою; г) мелясне середовище. Склад мелясного середовища (г/дм3): меляса — 160,0; (NH4)2SO4 — 15,0; KH2PO4 — 0,5; K2HPO4 — 0,5; MgSO4-7H2O — 0,25; FeSO4-7H2O — 0,01; MnSO4-H2O — 0,01; ZnSO4 -7H2O — 0,001; CuSO4 — 0,2; NiCl2 —
0,02; дріжджовий екстракт — 5,0. Після стерилізації додавали стерильну крейду в кількості 10 г/дм3 для створення буферності в процесі метаболізму бактерій. Культивування здійснювали в колбах Ерленмеєра об’ємом 0,25 дм3 з живильним середовищем об’ємом 0,03 дм3 за температури 30±1 °С при 240 об/хв у шейкері-інкубаторі BIOSAN ES-20 (Латвія) протягом трьох діб.
Ріст штамів-продуцентів лізину оцінювали: на твердих живильних середовищах — візуально за наявністю росту та утворенням пігменту; на рідких — вимірюванням концентрації клітин в культуральній рідині (КР) за ОГ; зі зміною рН середовища — за допомогою цифрового рН-метра (рН-метр 150); з використанням цукрів — резорциновим методом [6]; з використанням амонійного азоту — методом з реактивом Неслера [7]. Кількість синтезованого лізину визначали у відцентрифугованій КР за допомогою тонкошарової хроматографії в системі ацетон : ізопропанол : аміак : вода (співвідношення 50:50:12:8), плями лізину елюювали 70%-м етанолом [8].
Дослідження ауксотрофності здійснювали згідно з методикою [4], модифікованою для потреб бактеріальних продуцентів та живильних середовищ. Як повноцінне живильне середовище і позитивний контроль використано МПАзб., як негативний контроль — МС (глюкоза або сахароза — 3,0% , (NH4)2SO4 — 1,0%, K2HPO4 — 0,2%, MgSO4 •7H2O — 0,04%). Глюкозу, сахарозу та
амінокислоти стерилізували окремо і вносили в мінімальне середовище. Розчини амінокислот (наважка амінокислоти масою 190 мг в 0,025 дм3 дистильованої води) стерилізували протягом 15 хв за 0,5 атм. Стерильні розчини амінокислот об’ємом 0,0004 дм3 додавали в розплавлене мінімальне середовище (0,05 дм3), перемішували та розподіляли на чашки Петрі. Інкубацію проводили за температури 31±1 °С протягом 2-3 діб.
Статистичну обробку даних було виконано за допомогою програми Microsoft Excel. Усі досліди проводили в 3 повтореннях. Різницю між двома середніми величинами вважали достовірною за Р < 0,05.
Результати та обговорення
Біосинтез лізину в коріне- та бревібактерій здійснюється гліколітичним (через піруват, цикл Кребса та діамінопімелат) і пентозофос-фатним шляхами за участю 60 ензимів, основними з яких є фосфоенолпіруваткарбоксилаза (pyc), гомосериндегідрогеназа (hom), аспар-таткіназа (lysC), дигідропіколінатсинтаза (dap A) (рис. 1, а) [9, 10].
Схему синтезу лізину через а-діамінопі-мелінову кислоту наведено на рис. 1, б. Бактерії синтезують лізин з аспартату через діамінопімелат, який формує діамінопіме-латні блоки пептидоглікану клітинної стінки корінебактерій [2]. Крім лізину, за розгалуженою схемою з аспартату синтезуються також метіонін, гомосерин, треонін та ізолейцин. Контроль біосинтезу амінокислот аспартатної родини здійснюється на рівні першого ензиму — аспартаткінази (АК) [5].
Біосинтез лізину від аспарагінової кислоти через діамінопімелінову кислоту має тільки один контрольований кінцевим продуктом етап — фосфорилювання аспарагінової кислоти. Реакція каталізується АК, здатною у штамах дикого типу до полівалентного інгібування лізином і треоніном. Трео-нін пригнічує ензим АК, присутність лізину підсилює цей ефект. Треонін здатен репресувати також і дегідрогеназу напівальдегіду аспарагінової кислоти та гомосериндегідро-геназу (ГД), метіонін пригнічує ГД, а ізолейцин — треоніндегідрогеназу (ТД). Синтез залежить від активності ГД, що здатна до інгібування треоніном і репресії метіоніном. Спільний попередник у синтезі лізину та треоніну — напівальдегід аспарагінової кислоти — витрачається у корінебактерій переважно на синтез треоніну, оскільки активність ГД у 15 разів вища за активність дигідропіколінатсинтази.
МАЛЬТОЗА ГЛЮКОЗА
Аспарагіном
кислота
—Т-----------
a б
Рис. 1. Біосинтез лізину у бревібактерій:
а — гліколітичним (через піруват, цикл Кребса та діамінопімелат) і пентозофосфатним шляхами;
б — через а-діамінопімелінову кислоту
Для підвищення синтезу лізину в клітинах корінебактерій передусім має бути усунено інгібування аспартаткінази. Цього можна досягнути:
- зниженням внутрішньоклітинного вмісту треоніну;
- генетичною зміною АК, що полягає у втраті її чутливості до дії лізину та треоніну;
- блокуванням ГД;
- підвищенням активності дигідропіко-лінатсинтази.
Саме тому для мікробіологічного виробництва лізину використовують ауксотрофні штами-продуценти глутаматпродукуючих корінебактерій.
Відомі три основні класи ауксотрофних лізинпродукуючих мутантів:
- ауксотрофи за гомосерином з відсутністю активності АК або ауксотрофи за треоніном з відсутністю активності гомосеринкінази (ГК);
- метіонін- або треонінчутливі мутанти з низькою активністю ГД;
- аналогорезистентні прототрофні продуценти лізину, стійкі до аналога амінокислоти, у яких АК нечутлива до ретроінгібу-вання лізином і треоніном.
Проведення клонового аналізу штамів-продуцентів лізину
Культивування Brevibacterium sp. 90 Н, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. ХІ, Brevibacterium flavum TH7, Corynebacte-rium glutamicum проводили в періодичних режимах упродовж 96 год на ензиматичному середовищі.
Основні показники культивування досліджуваних бактерій наведено в табл. 1. Зміна рН культуральної рідини показала, що в процесі росту відбувалось кислотоутворен-ня, а присутність у середовищі крейди забезпечувала підтримання рН на нейтральному рівні. Загальне споживання цукру хоча й було різним для кожного продуцента, проте становило незначний відсоток. Додавання лейцину в ензиматичне мелясне середовище неістотно підвищило рівень синтезу біомаси, але суттєво не вплинуло на біосинтетич-ну активність штамів щодо лізину.
Нами було проведено перевірку ауксо-трофності штамів щодо лейцину та інших амінокислот аспартатної родини для виявлення більш продуктивних штамів за цільовою амінокислотою. Для цього після культивування всі зразки культуральної рідини кожного продуцента було розсіяно на чашки Петрі зі збагаченим живильним середовищем, основним компонентом якого був МПБ. На цьому агаризованому середовищі виявили два типи колоній штамів Brevi-bacterium 90, 90Н та ХІ (типові колонії — випуклі, блискучі, жовтувато-лимонного кольору та колонії непігментовані). Штами
B. flavum і C. glutamicum у процесі росту утворювали тільки окремі жовті колонії.
Розщеплення на два типи колоній для штамів Brevibacterium відбулось у співвідношеннях, наведених на рис.2.
Далі було здійснено перевірку клонів за продуктивністю синтезу лізину. Синтез проводили в періодичних умовах культивування за температури 31±1 °С та 250 об/хв.
Таблиця 1. Біосинтез лізину штамами-продуцентами
Продуценти Показники культуральної рідини
рН ОГ (1:10), À440 РР, % Концентрація лізину, г/дм3
Brevibacterium sp. 90 Н 7,42±0,12 1,4±0,1 5,6±0,3 5,9±0,5
Brevibacterium sp. 90 Н (+лейцин) 7,34±0,15 1,6±0,1 5,4±0,4 6,0±0,5
Brevibacterium sp. 90 7,16±0,18 1,2±0,1 5,2±0,4 5,1±0,4
Brevibacterium sp. 90 (+ лейцин) 7,14±0,14 1,3±0,1 5,3±0,4 5,2±0,4
Brevibacterium sp. ХІ 7,64±0,15 1,5±0,2 5,1±0,6 6,2±0,6
Brevibacterium sp. ХІ(+ лейцин) 7,46±0,13 1,6±0,1 5,4±0,4 6,2±0,6
Brevibacterium flavum TH7 7,28±0,14 1,3±0,1 6,5±0,4 6,1±0,6
Brevibacterium flavum ТН7(+лейцин) 7,32±0,17 1,4±0,1 6,7±0,6 6,2±0,6
Corynebacterium glutamicum 7,20±0,15 1,3±0,1 6,3±0,4 6,1±0,4
Corynebacterium glutamicum (+ лейцин) 7,35±0,13 1,4±0,1 6,9±0,6 6,1±0,5
Вихідне середовище 8,00±0,10 0,2±0,1 8,2±0,5 2,1±0,1
< і І * : * І
чі 5 <ю хр і<р ». г
Рис. 3. Синтез лізину Brevibacterium:
К2,5, К7,5 — стандартні розчини лізину з різною концентрацією; 7і, 8і — інокулят 7, 8 клонів після 24 год культивування; Кф — ензиматичне середовище без культури; 6ф, 7ф, 8ф, 11ф — КР після ферментації 6, 7, 8, 11 клонів
sp. 90Н і Brevibacterium sp. ХI, були подібні за характеристиками та величинами, отриманими для Brevibacterium sp. 90, тому на рисунку наведено тільки дві діаграми.
З кожного типу колоній було отримано клони (номери згідно з табл. 2) і досліджено їхню продуктивність за лізином на 60-ту год культивування на ензиматичному мелясному середовищі.
На збагаченому середовищі у процесі ферментації протягом 60 год клони №2, №5, №8 (непігментовані колонії) та №6, №7, №11 (жовті) продукували. Вищезазначені клони відібрали для подальшого дослідження їхньої ауксотрофності.
Дослідження ауксотрофності штамів-продуцентів лізину
Згідно з методикою, наведеною в роботі [3], ауксотрофність спочатку визначали на твердому живильному середовищі.
Brevibacterium sp. ХІ Brevibacterium sp. 90
Brevibacterium sp. 90 Н
68%
Рис. 2. Утворення двох типів колоній штамами Brevibacterium
Культивування здійснювали протягом 96 год. В інокуляційному середовищі на 24-ту год культивування у пробах 7і та 8і лізин практично відсутній, тобто протягом першої доби синтез його не відбувався (рис. 3). Це можна пояснити активним синтезом біомаси та витратою діамінопімелату на формування клітинних стінок.
Вміст лізину в КР кожного клону визначали після 24 год з інтервалом у 12 год протягом подальшого терміну культивування.
Як видно з рис. 4, жовті колонії Brevibac-terium sp. 90 синтезують більше лізину, ніж білувато-сірі. Активне утворення лізину відбувається на другу добу і досягає максимальної величини на 60-ту год росту штамів. На 72-гу год культивування клітини активно споживали лізин, суттєво знижуючи його концентрацію в КР. Результати (термін культивування та рівень синтезу лізину), отримані під час дослідження Brevibacterium
60 год культивування
72 год культивування
4,5
3,3
Клони
Таблиця 2. Накопичення лізину на 60-ту годину культивування клонами штамів Brevibacterium
і : ’ Клони
Рис. 4. Накопичення лізину двома типами колоній штаму Brevibacterium sp.90
(жовті колонії — помаранчевий колір; непігментовані — без забарвлення)
Позитивний контроль дослідів на повноцінному середовищі МПАзб, яке містило всі необхідні фактори росту, подано на рис. 5, а. Клони, які росли на позитивному контролі, не росли на МС як з глюкозою, так і з сахарозою (рис. 5, б).
Негативний контроль в усіх подальших дослідах на середовищі МС був таким для клонів № 2, 5, 8, 7, 11. Виняток становив клон № 6, який не потребував факторів росту.
Для кожного клону проводили паралельні посіви на МС з амінокислотами. Як джерела вуглецевого живлення використовували глюкозу або сахарозу. На середовищі з глюкозою більшість клонів не виявляли ауксотрофності й не утворювали пігментації. Наявність росту всіх клонів на МС (джерело вуглецю — сахароза) з лейцином та гомосерином показано на рис. 6.
Бревібактерії на МС із сахарозою виявляли ауксотрофність стосовно ширшого кола амінокислот (табл. 3).
№ клону Пігмент Концентрація лізину, г/дм3
Brevibacterium sp.90 Н
1 Жовтий 7,3±0,4
2 Непігментовані 8,7±0,5*
3 Жовтий 7,4 ±0,3
4 Жовтий 5,7±0,3
5 Непігментовані 9,4±0,5*
6 Жовтий 10,0±0,5*
Brevibacterium sp.90
7 Жовтий 12,6±0,5*
8 Непігментовані 9,5±0,4*
9 Жовтий 6,5±0,3
10 Жовтий 4,5±0,3
Brevibacterium sp.XI
11 Жовтий 11,7±0,5*
12 Жовтий 5,7±0,3
13 Непігментовані 6,3±0,3
14 Жовтий 4,5±0,3
15 Непігментовані 4,5±0,3
Brevibacterium flavum
16 Жовтий 5,0±0,2
Corynebacterium glutamicum
17 Жовтий 7,1±0,3
ш<
bjj yU ^
-ms
Примітка: * — найбільш продуктивні клони для подальших досліджень.
Рис. 5. Позитивний (а) та негативний (б) контроль дослідження ауксотрофності клонів Brevibacterium
Таблиця 3. Визначення ауксотрофності клонів Brevibacterium на твердому МС із сахарозою
Рис. 6. Ауксотрофність клонів на МС (джерело вуглецю — сахароза) з лейцином (а) та гомосерином (б)
За даними табл. 3, усі клони були лейци-нозалежними і набули ауксотрофності до інших амінокислот, а саме метіоніну (№ 5,
7, 11), треоніну (№ 8, 11), ізолейцину (№ 8), триптофану (№ 2, 5, 11) та гомосерину (№ 8, 11). Для клону № 6 було виявлено позитивний результат на МС, оскільки він не потребував факторів росту. Це підтверджують дані, наведені на рис. 5, б та 6, б.
На наступному етапі досліджень було здійснено культивування на рідкому середовищі МС з амінокислотами тільки аспартатної родини (табл. 4). Серед усіх клонів досліджували три найбільш продуктивні за лізином та гомосеринзалежні — № 7, № 8, № 11 (табл. 2).
Для клону № 7 на рідкому МС із додаванням амінокислот аспартатної родини було підтверджено ауксотрофність за лейцином та метіоніном. На таких середовищах клон інтенсивно ріс, продукував пігмент, лізин та активно використовував цукор із середовища. На МС із треоніном та ізолейцином клон ріс, споживав цукор, проте не синтезував лізин. На МС із додаванням аспарагіну, триптофану, гомосерину клон не використовував цукор і не синтезував біомасу та лізин.
Для клону № 8 на рідкому МС із амінокислотами було підтверджено ауксотроф-ність за лейцином, ізолейцином, треоніном та гомосерином. На таких середовищах він
Середовища Клони
2 5 6 7 8 11
Контроль ППС +++ +++ +++ +++П +++ +++п
Контроль МС - - ++ - - -
МС+Аспарагін
MC+Tреонін - - ++ - + +
МС+Ізолейцин - - + - + -
МС+Лейцин +++ +++ +++ +++п +++ +++п
МС+Метіонін - + ++ +п - +
MC+Tриптофан + + +++ - - +
МС+Гомосерин - - +++ - + +
Примітка: +++ — інтенсивний ріст; + — наявність росту; - — відсутність росту; п — жовтий пігмент.
інтенсивно ріс, продукував лізин і активно використовував цукор із середовища. На МС із додаванням треоніну й ізолейцину клон ріс, споживав цукор, проте не синтезував лізин, на МС з аспарагіном, триптофаном, метіоніном — не використовував цукор і не синтезував біомасу та лізин.
Клон № 11 виявив ауксотрофність за лейцином, треоніном та триптофаном. Цей клон інтенсивно ріс і утворював пігмент на МС із вищезазначеними амінокислотами, виявляв ауксотрофність також і до гомосерину, проте не утворював пігмент. Найбільше споживання цукру відзначено на МС із додаванням гомосерину, треоніну, лейцину. Клон № 11 на МС з аспарагіном, ізолейцином, метіоніном не використовував цукор і не синтезував біомасу та лізин.
Ріст клонів на МС із додаванням лізину свідчить про відсутність пригнічення кінцевим продуктом. ^му клони № 7, 8, 11 перевірили на стійкість до аналога лізину — S-аміно-етил^-цистеїну (АЕЦ). Було одержано підтвердження стійкості клонів № 7 і 11 до АЕЦ.
Tаким чином, відібрані окремі клони оцінено стосовно синтезу лізину. Найбільш продуктивні за лізином клони перевірено на аук-сотрофність щодо амінокислот аспартатної родини. Досліджені клони зберігали ауксо-трофність за лейцином і набули нової ауксо-трофності до треоніну, метіоніну, триптофану та гомосерину. Найбільш продуктивні за лізином клони можна віднести і до аналогорезис-тентних ауксотрофів. Отримані екперимен-тальні дані щодо ауксотрофності свідчать, що для продуцентів лізину ауксотрофність пов’язана з блокуванням гомосериндегідроге-нази та зміною активності аспартаткінази.
Таблиця 4. Вплив амінокислот аспартатної родини на біосинтез лізину клонами № 7, 8, 11
Середовище Показники КР, одиниці вимірювань
рН ОГ (1:10), À440 РР, % Синтез лізину
Контроль — МС 7,85 0,10 3,0 -
Клон №7
МС+Аспарагін 7,80 0,14 2,9 -
МС+Лізин 6,83 0,42 1,9 +
МС+Лейцин 6,81 0,64 +П 1,3 +
МС+Ізолейцин 7,00 0,38 1,9 -
MC+Tреонін 6,84 0,40 1,9 -
МС+Метіонін 6,80 0,42 +П 1,4 +
MC+Tриптофан 7,20 0,32 2,6 -
МС+Гомосерин 7,90 0,14 2,8 -
Клон №8
МС+Аспарагін 7,78 0,20 2,8 -
МС+Лізин 6,81 0,34 2,0 +
МС+Лейцин 6,62 0,50 1,4 +
МС+Ізолейцин 7,73 0,30 2,2 +
MC+Tреонін 7,28 0,36 1,7 +
МС+Метіонін 6,95 0,25 2,7 -
MC+Tриптофан 7,48 0,20 2,8 -
МС+Гомосерин 7,00 0,40 1,5 +
Клон №11
МС+Аспарагін 7,92 0,12 3,0 -
МС+Лізин 7,03 0,42 1,9 +
МС+Лейцин 7,05 0,40 +П 1,5 +
МС+Ізолейцин 7,33 0,25 2,5 -
MC+Tреонін 7,01 0,56 +П 1,3 +
МС+Метіонін 7,00 0,20 2,0 -
MC+Tриптофан 7,05 0,52 +П 1,4 +
МС+Гомосерин 7,10 0,42 1,3 +
Примітка: + — присутність амінокислоти в культуральному середовищі; - — відсутність амінокислоти в
культуральному середовищі; +П — жовтий пігмент.
ЛІТЕРАТУРА
1. Пирог Т. П., Ігнатова О. А Загальна біотехно-логія: Підручник. — К.: НУXT, 2009. — 336 с.
2. Лысак В. В. Л88 Микробиология: Уч. пособие. — Минск: БГУ, 2007. — 469 с.
3. Підгорський В. С., Іутинська Г. О., Пирог Т. П. Інтенсифікація технологій мікробного синтезу. — К.: Наук. думка. — 2010. — 328 с.
4. Федоренко В. О., Осташ Б. О., Гончар М. В., Ребець Ю. В. Великий практикум з генетики, генетичної інженерії та аналітичної біо-технології мікроорганізмів: Навч. посіб. — Львів: Видавничий центр ЛНУ ім. Івана Франка, 2006. — 279 с.
5. Дебабов В. Г., Лившиц В. А Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. — М.: Высш. школа. — 1988. — 208 c.
6. Полыгалина Г. В. Tехнохимический контроль спиртового и ликеро-водочного производств. — М.: Колос, 1999. — 336 с.
7. КНД 211.1.4.030-95. Охорона навколишнього природного середовища та раціональне використання природних ресурсів. Методика фотометричного визначення амоній-іонів з реактивом Неслера в стічних водах. — К., 1995. — 17 с.
8. Шульга С. М., Ткаченко А. Ф., Тигунова Е. А. и др. Влияние компонентов энзиматической среды на биосинтез триптофана // Біотехно-логія. — 2011. — T. 4, № 3. — С. 51-55.
9. Ohnishi J., Mitsuhashi S., Hayashi M. et al. A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine- producing mutant // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2002. — V. 58. — Р. 217-223.
10. Ohnishi J., Katahira R., Mitsuhashi S. et al. A novel gnd mutation leading to increased L-lysine production in Corynebacterium glu-tamicum // FEMS Microbiol. Lett. -2005. — V. 242. — Р. 265-274.
AУКСОТРОФНОСТЬ ПРОДУЦЕНТОВ ЛИЗИНА
А С. Андрияш Г. М. Заболотная
С. М. Шульга
ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики» НАН Украины,
Киев
Е-таИ:БНи^а5^.иа
Проведено исследование штаммов-проду-центов лизина из «Коллекции штаммов микроорганизмов и линий растений для пищевой и сельскохозяйственной биотехнологии» ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики» НАН Украины. Осуществлен клоновый анализ штаммов после периодического культивирования продуцентов на мелассных средах. Установлено, что штаммы Brevibacterium эр. 90, Brevibacterium эр. 90Н, Brevibacterium эр. XI дают расщепление колоний на два типа. Все клоны оценены по биосинтетической активности относительно лизина. Отмечены мутационные изменения в клонах, часть которых сохраняли зависимость от лейцина и получали новую ауксотрофность к треонину, метионину, триптофану, гомосерину и изолейцину. Показано, что не все клоны устойчивы к аналогу лизина Я-амино-этил^-цистеину. Отобраны клоны по биосинтетической активности относительно целевой аминокислоты для дальнейших исследований с целью повышения уровня биосинтеза лизина штаммами-продуцентами Brevibacterium.
Ключевые слова: аминокислоты, ауксотроф-ность, биосинтез, клоны, лизин.
AUXOTROPHITY OF PRODUCENTS OF LYSIN
G. S. Andriyash G. M. Zabolotna
S. M. Shulga
State organization «Institute of Food Biotechnology and Genomics» of National Academy of Sciences of Ukraine,
Kyiv
E-mail: Shulga5@i.ua
The investigation of lysine producer strains of «Collections of microbial strains and plant lines for food and agricultural biotechnology» of the State organization «Institute of Food Biotechnology and Genomics» of National Academy of Sciences of Ukraine was carried out. Clonal analysis of the strains was done after batch fermentation of producers on molasses medium. It was found that Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90H, and Brevibacterium sp. XI strains gave colonies scission into two types. All the clones were estimated by biosynthetic activity relatively lysine. Mutational changes were observed in the clones some of which remained dependent on leucine and get a new auxotrophity for threonine, methionine, tryptophan, isoleucine and homoserine. It was shown that only some clones were resistant to S-amino-ethyl-L-cysteine — analogue of lysine. Clones on biosynthetic activity relative to the target amino acid were selected for further research with the aim to improve lysine biosynthesis by Brevibacte-rium producer strains.
Key words: amino acids, auxotrophity, biosynthesis, clones, lysine.
