CC BY
186
УДК 612,398; 547.965
МУТАНТНІ ШТАМИ МІКРООРГАНІЗМІВ — ПРОДУЦЕНТІВ ЛІЗИНУ ТА ТРЕОНІНУ
Г. С. Андріяш
Г. М. Заболотна ДУ «Інститут харчової біотехнології і геноміки
С. М. Шульга НАН України», Київ
E-mail: Shulga5@i.ua
Отримано 23.01.2014
Проведено дослідження штамів мікроорганізмів — продуцентів незамінних амінокислот аспар-татної родини: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. Е531 із «Колекції штамів мікроорганізмів та ліній рослин для харчової і сільськогосподарської біотехнології» ДУ «Інститут харчової біотехнології і геноміки НАН України» за біосинтетичною активністю щодо лізину і треоніну. Після УФ-опромінення було одержано активні штами-продуценти цільових амінокислот, вивчено біологічні особливості цих мікроорганізмів і визначено їхню біосинтетичну ефективність.
За допомогою аналізу регуляторної та аналогорезистентної ауксотрофності вибрано нові мутантні штами-продуценти треоніну і лізину. Досліджено чутливість вихідних і мутантних штамів-проду-центів до пеніцилінів, макролідів, цефалоспоринів, тетрациклінів та інших груп антибіотиків. Визначено біосинтетичну активність продуцентів треоніну — Brevibacterium flavum ІМВ В-7446 та лізину — Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 щодо продукування цільових амінокислот. Штами депоновано в «Національному депозитарії мікроорганізмів» Інституту мікробіології і вірусології НАН України.
Ключові слова: продукування лізину та треоніну, мутантні штами-продуценти.
Дедалі зростаючий попит на незамінні амінокислоти потребує від біотехнологічної промисловості постійного вдосконалення виробництва, впровадження нових ефективних технологій і обладнання. Цього можна досягти шляхом здешевлення субстратів або застосування нових ефективних штамів-про-дуцентів з підвищеним рівнем продукції амінокислот [1, 2].
Оскільки Ь-лізин та Ь-треонін одержують переважно мікробіологічним способом, то інтенсифікація процесу виробництва за рахунок підвищення синтезу цільових продуктів більш активними штамами мікроорганізмів не потребуватиме значних капіталовкладень в обладнання [3-5].
Це зумовлює актуальність та економічну доцільність пошуку нових активних шта-мів-продуцентів лізину і треоніну, дослідження їхніх біологічних властивостей, механізмів адаптації до засвоєння субстратів та можливості використання ефективних мікроорганізмів для біотехнології незамінних амінокислот.
Надати необхідних властивостей продуцентам можна, змінюючи геном бактерій за допомогою мутагенезу (включаючи методи
генної інженерії) або селекцією [1, 6, 7]. Після цього потрібно перевірити життєздатність, біосинтетичну активність і стабільність одержаних за культивування штамів-продуцентів.
Матеріали і методи
Об’єктами досліджень були штами-про-дуценти незамінних амінокислот: Brevibac-ієгіиш ер. 90 Н, Brevibacterium ер. 90, Brevi-Ьасіегіиш ер. Е 531, Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum 3144 В-832-10 із «Колекції штамів мікроорганізмів та ліній рослин для харчової і сільськогосподарської біотехнології» ДУ «Інститут харчової біотехнології і геноміки» НАН України.
Умови культивування та середовища. Для вирощування штамів-продуцентів використовували повноцінні живильні середовища (ПЖС) такого складу: м’ясо-пептонний агар (МПА) (г/дм3): поживний бульйон — 23,0, агар — 30,0, вода дистильована, pH 7,0 ± 0,1 та м’ясо-пептонний агар збагачений (МПАзб) (г/дм3): поживний бульйон — 23,0, глюкоза — 1,0, дріжджовий екстракт — 5,0, агар — 30,0, вода дистильована, pH 7,0 ± 0,1 [8].
Для одержання окремих колоній відбирали 0,2-10-3 дм3 та 1,0-10-3 дм3 культуральної рідини вихідних і мутантних штамів з розведень 10-6 та 10-7, відповідно, переносили в чашки Петрі й заливали охолодженим до температури 45 і 3 “С MПАзб. Інкубацію здійснювали в термостаті за температури 31 і 1 “С упродовж трьох діб. Усі колонії, які виросли на MПАзб, було взято для визначення біосинтезу лізину. Найбільш продуктивні клони відбирали для подальших досліджень. Клони пересівали один раз на квартал і зберігали на MПАзб за температури +4 “С [8].
Перевірку на чистоту культури та продуктивність проводили один раз на рік (музейні культури).
Для визначення ауксотрофності штамів та проведення мутагенезу брали бактеріальну суспензію, яку готували таким чином: відбирали дводобову культуру зі штрихових культур MПАзб, яку розводили у стерильному фізіологічному розчині до концентрації 1-105 колонієутворювальних одиниць — КУО/дм3, що відповідало 0,5 оптичної густини (ОГ). ОГ вимірювали в кюветах з d = 5,0 мм за довжини хвилі 440 нм за допомогою фото-електроколориметра (модель КФК-3).
Одержаний інокулят переносили стерильно в: а) повноцінне середовище ^ПАзб.); б) мінімальне середовище (MQ [глюкоза або сахароза — 3,0%, (NH4)2SO4 — 1,0%, K2HPO4 — 0,2%, MgSO4 x7H2O — 0,04%)]; в) MС із досліджуваною амінокислотою ДОС + лейцин або гомосерин) та досліджуваним антиметаболітом ДОС + аміноетилцистеїн (АЕЦ) або Р-оксинорвалін (НВ)]; г) мелясне середовище. Склад мелясного середовища (г/дм3): меляса — 160,0; кукурудзяний екстракт — 40,0; (NH4)2SO4 — 15,0; KH2PO4 — 0,5; K2HPO4 — 0,5; MgSO4 • 7H2O — 0,25; біотин — 3,010 ; лейцин — 2,010-4; FeSO4 • 7H2O — 0,01; MnSO4 • H2O — 0,01; ZnSO4 • 7H2O — 0,001; CuSO4 — 0,2; NiCl2 — 0,02.
Після стерилізації вносили стерильну крейду в кількості 10 г/дм3 для створення буферності середовища в процесі метаболізму бактерій. Глибинне культивування здійснювали в колбах Ерленмейєра 0,25 дм3 з живильним середовищем об’ємом 0,03 дм3 за температури 31 і 1 “С при 240 об/хв в шейкері-інкубаторі BIOSAN ES-20 (Латвія) протягом трьох діб.
Процес культивування контролювали безпосередньо за допомогою мікроскопії живих препаратів та біохімічних аналізів куль-туральної рідини (КР).
Ріст штамів-продуцентів лізину оцінювали візуально за наявністю росту й утворен-
ням пігменту (тверді живильні середовища); на рідких середовищах — вимірюванням концентрації клітин у культуральній рідині за ОГ; зміною рН середовища — за допомогою цифрового рН-метра (рН-метр 150), використанням цукрів — резорциновим методом [9]. Кількість синтезованих цільових амінокислот визначали за допомогою амінокислотного аналізатора ААА 400 (Чехія) [10].
Дослідження ауксотрофності та чутливості до антибіотиків здійснювали згідно з методиками [6, 11], модифікованими для бактеріальних продуцентів. Як повноцінне живильне середовище і позитивний контроль використовували MПАзб, як негативний — M^ Глюкозу, сахарозу та амінокислоти стерилізували окремо і вносили в M^ Розчини амінокислот (наважка амінокислоти масою 0,19 г в 0,025 дм3 дистильованої води) стерилізували протягом 15 хв за тиску 49 кПа. Стерильні розчини амінокислот об’ємом
0,004 дм3 вносили в розплавлене M0 (0,05 дм3), перемішували та розподіляли на чашки Петрі. Інкубацію проводили за температури 31 і 1 “С упродовж 2-3 діб.
Реактиви. У роботі застосовували аналоги лізину — S-(2-aminoethyl)-L-cysteine і треоніну — Р-оксинорвалін (Sigma, США), набори незамінних амінокислот (Китай) та дисків з антибіотиками (Україна).
Згідно з методикою [12] проведено мутагенез опроміненням бактеріальних суспензій за кімнатної температури протягом 60-720 с на установці, що складалася з двох ламп Fillips потужністю 30 Вт кожна (А, = 254 нм, відстань до об’єкта опромінення — 0,12 м).
Опромінену бактеріальну суспензію розсівали на чашки Петрі у різних розведеннях (від початкової концентрації суспензії до 10-6) на мінімальне середовище з амінокислотами та аналогами цільових амінокислот [11].
Інкубацію здійснювали в термостаті за температури 31і1“С протягом трьох діб. Усі колонії, які виросли на MС з амінокислотами та на MС з аналогами амінокислот, що були ауксотрофними до лейцину та гомосерину, перевірено щодо продукування амінокислот. Найпродуктивніші клони відбирали для наступних етапів опромінювання та подальших досліджень.
Статистичну обробку даних здійснювали за допомогою програми Microsoft Excel. Усі досліди проводили в 3 повторах. Різницю між двома середніми величинами вважали вірогідною за Р < 0,05 (позначено *).
Визначення життєздатності шта-мів-продуцентів під дією УФ-опромінення. Згідно з [6, 7] мутації в бактеріальній кліти-
ні продуцентів біологічно активних сполук можуть бути як позитивними, так і негативними.
Один із шляхів одержання продуцентів лізину та треоніну — селекція регуляторних мутантів, у яких гомосериндегідрогеназа нечутлива до треоніну. Селективними агентами слугували аналоги треоніну Р-оксинорвалін і лізину S-(2-aminoethyl)-L-cysteine. Mутанти, стійкі до НВ та АЕЦ, мали дві регуляторні мутації, що порушували ретроінгібування як гомосериндегідрогенази, так і аспартаткіна-зи. У таких штамів у середовище одночасно виділялися треонін і лізин [13].
У популяції мікроорганізмів після УФ-опромінення з рівним ступенем імовірності могли з’явитися як мутанти, так і ре-вертанти. Тому важливо після опромінення штамів-продуцентів лізину виявити штами з підвищеним синтезом лізину, а серед му-тантів-ревертантів також і продуценти з підвищеним синтезом треоніну. «Повернення» мутантів (опромінені продуценти лізину) до «диких» штамів може змінити регулювання синтезу амінокислот. Використання аналогової резистентності як генетичного маркера дало змогу вибрати найбільш продуктивні штами за цільовими амінокислотами [6, 13].
Аналоги лізину S-(2-aminoethyl)-L-cysteine та треоніну Р-оксинорвалін діяли як ретроінгібітори чи корепресори синтезу природних метаболітів, проте вони не могли
замінити їх функціонально. Тому на мінімальному середовищі з антиметаболітом виживали та утворювалися колонії лише тих клітин, у яких порушений механізм негативної регуляції біосинтезу амінокислоти і які, унаслідок цього порушення, синтезували надлишок цільової амінокислоти [11]. Мутагенез здійснювали згідно зі схемою, що її подано на рис. 1.
Результати та обговорення
На першому етапі дослідження було визначено вплив мутагенних факторів на життєздатність клітин бактерій. Як контроль брали відповідні розведення неопроміненої суспензії бактерій. Життєздатність клітин встановлювали до та після УФ-опромінен-ня бактеріальної суспензії. Кількість клітин у популяції, що виживали, визначали за кількістю утворених колоній на МПАзб. і залежно від тривалості дії УФ-фактора. Контролем слугувала неопромінена бактеріальна суспензія.
За даними [6, 12], імовірність мутацій у бактеріальних популяціях тим вища, чим більше гине клітин, проте має залишитись певна кількість живих клітин для відбору мутантів (близько 1%).
Встановлено, що летальна доза (ЬБ) та термін опромінення для одержання 1% живих клітин для різних штамів були різними (рис. 2, 3).
Вирощування вихідної культури на ЫПБзб. (18-24 год, t = 31 і 1 “С)
I
Приготування бактеріальної суспензії (титр клітин 106-10 ) на стерильному ________фізіологічному розчині__________
Розподілення бактеріальної суспензії на чашки Петрі (по 0,01 дм3)
УФ-опромінення чашок Петрі із суспензією _______________(t = 1-12 хв)____________
Витримування опромінених зразків у темряві (24 год, t = 31 і 1 “С)
Встановлення кількості життєздатних клітин у вихідній популяції та опромінених (МПА зб.)
Виявлення ана-логорезистент-них мутантів на ЖС + АЕЦ або ЖС + НВ
Виявлення ауксотрофних мутантів на MС + лейцин, ЫС + гомосерин
Рис. 1. Загальна схема досліджень мутагенезу продуцентів лізину та треоніну
Термін опромінення, с
- Brevibacterium sp. 90 -ш— Brevibacterium sp. E531
- Brevibacterium sp. 90H
Рис. 2. Життєздатність клітин Brevibacterium sp. під дією УФ опромінення.
Тут і далі: * — Р < 0,05. Контролем слугував показник «колонієутворювальні одиниці» — КУО (100%) в неопроміненій бактеріальній суспензії
^ 100 о" 95 - - т а К М -1' 3 ^ ч: К " £ •'с Е- 20 .2 ^ ■ ' Й і 2
\ V •
\ » \
\ \ ■
V - \ *
\ «
\
120 240 360 480 600 720 Термін опромінення, с \^^Вге»і>ас:епит /Іспит ^^СогупеЬасІеПит ^гаатісім \
Рис. 3. Життєздатність клітин БгеиіЬаеЬегіит Ааиит та СогупеЬаеЬегіит glu-Ьатіеит під дією УФ опромінення Як видно з рис. 2, життєздатність клі-
тин під дією УФ змінювалася залежно від тривалості опромінення. Для трьох штамів ВгвьіЬасівгіит ер. летальною дозою було опромінення протягом 4-5 хв. Оптимальним терміном для мутагенезу встановлено 3 хв, що корелює з даними роботи [12], у якій автори здійснювали УФ-мутагенез на ВтвьіЬасівтіит lactofвrmвntum.
Згідно з рис. 3 летальною дозою для Brвvibactвrium flavum та СогупвЬа^вгіит дІМатісит було опромінення протягом 12 та 10 хв відповідно, а оптимальний термін для мутагенезу становив 10 хв для Brвvibactвrium flavum і 8 для Corynвbactвrium glutamicum.
Серед усіх одержаних мутантів для подальшого дослідження відібрали представників роду Brвvibactвrium і перевірили їх на біосинтез цільових амінокислот (рис. 4, 5).
Як випливає з рис. 4, у мутантних штамів рівень синтезу лізину був вищим більш ніж у п’ять разів. З рис. 5 видно, що у мутантних штамів рівень синтезу треоніну був вищим більш ніж у 2 рази.
Стійкість до аналогів можуть спричинювати також мутації, які просто блокують надходження їх у клітини. Тому було проведено декілька етапів селекції з використанням поступового підвищення концентрації аналогів (від 0,25 мг/дм3 до 0,4 мг/дм3 АЕЦ та НВ).
Опромінену бактеріальну суспензію висівали глибинним способом на чашки Петрі з МПАзб. (для встановлення титру клітин), на МС із лейцином або гомосерином, з АЕЦ або НВ (для відбору мутантів за критеріями
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Мутантні штами-продуценти лізину
Рис. 4. Накопичення лізину мутантними штамами БгеиіЬаеЬегіит sp.:
1 — штами до опромінення УФ;
2-11 — одержані УФ-мутанти.
Контролем слугував показник синтезу лізину штамом до опромінення
Мутантні штами-продуценти треоніну
Рис. 5. Накопичення треоніну мутантними штамами БгеиіЬаеЬегіит Ааиит:
1 — штам до опромінення УФ;
2-9 — одержані УФ-мутанти.
Контролем слугував показник синтезу треоніну штамом до опромінення
ауксотрофності та аналогорезистентності). Результати наведено в табл. 1.
Опромінювали кожен штам, а вибір мутантів здійснювали за критеріями аук-сотрофності та стійкості до АЕЦ і НВ для продуцентів лізину й треоніну. За частоти мутацій (1,1 ± 0,2)10-3 одержано АЕЦ-стій-кі продуценти лізину, а (1,4 ± 0,2)10-3 — НВ-стійкі продуценти треоніну.
Вихідні культури й одержані мутантні штами перевіряли на чутливість до антибіотиків з метою встановлення генетичних маркерів. Результати подано в табл. 2.
Як випливає з наведених даних, серед досліджених вихідних і мутантних штамів є такі, що змінили чутливість до антибіотиків (тетрацикліну, стрептоміцину та левоміцетину).
Таблиця 1. Утворення мутантних штамів під дією УФ-
Розведення КУО мутантних клонів на МС+
Лейцин Гомосерин АЕЦ НВ
Brevibacterium sp.
101 0 0 0 0
10-2 0 0 0 0
10-3 (2,1 ± 0,3)10-3 (1,4 ± 0,2)-10-3 (1,1 ± 0,2)10-3 0
1 О 1 ( , 3 If 0 2) 1 О 1 ( 3 If р 2) 1 О 1 (1,2 ± 0,3)10-4 0
1 О 1 сд (10,5 ± 0,3)10 4 (4,2 ± 0,4)-10 4 (1,0 ± 0,2)10-5 0
Brevibacterium flavum
101 0 0 0 0
10-2 0 0 0 0
10-3 (2,5 ± 0,3)10-3 (2,1 ± 0,3)10-3 0 (1,4 ± 0,2)10-3
1 О 1 (3,3 ± 0,2)10-4 (3,4 ± 0,3)10-3 0 (1,5 ± 0,3)10-4
1 О 1 сд (1,8 ± 0,3)10-5 ( 2 If 2 1 о і 0 (1,8 ± 0,3)10-5
Таблиця 2. Чутливість вихідних та мутантних штамів до антибіотиків
Антибіотики Штами-продуценти
Brevibacterium sp. E531 Brevibacterium sp. 90 Brevibacterium sp. 90Н m u v >■2 m u ri e ct a ib vi e r Br Мутантний штам-продуцент треоніну Мутантний штам-продуцент лізину Мутантний штам, стійкий до АЕЦ Мутантний штам, стійкий до НВ
Азитроміцин S S S S S S S S
Ампіцилін S S S S S S S S
Цефтріаксон S S S S S S S S
Бензилпеніцилін S S S S S S S S
Гентаміцин S S S S S S S S
Тетрациклін S S S S R S S S
Стрептоміцин S S S S S S S R
Левоміцетин S S S S S S R S
Канаміцин S S S S S S S S
Примітка. й — чутливий; Я — резистентний до дії антибіотика. Контролем слугувала наявність росту культур на МПА зб. без додавання антибіотиків.
З метою визначення стабільності одержа-
них мутантних штамів їх пересівали впродовж 2 міс з інтервалом 2 тижні на тверде і рідке середовища з послідовним визначенням кількості синтезованих треоніну та лізину відповідно. Показник синтезу треоніну від пересіву до пересіву був майже однаковим (7,85-7,9 г/дм3), лізину — також не змінювався (30,85-31,9) г/дм3.
Використовуючи одержані мутантні штами, провели культивування на мелясовому середовищі в умовах аерації за t = 31 ± 1 °С. Критеріями оцінювання процесу культивування слугували кількість синтезованих амінокислот, коефіцієнт конверсії цукру (розрахункова величина), концентрація біомаси штамів-продуцентів за ОГ та зміна рН середовища (табл. 3).
Таблиця 3. Синтез цільових амінокислот та коефіцієнти конверсії джерел живлення
Продуценти рН ОГ (1:10), ^440 Концентрація сахарози,% Концентрація лізину, г/дм3 Концентрація треоніну, г/дм3 Конверсія цукру в цільову аміно-кислоту,%
Вихідне середовище 7,9 ± 0,1 0,2 ± 0,1 8,2 ± 0,5 2,0 ± 0,1 0,9 ± 0,1 -
Продуценти лізин1 у
Brevibacterium sp. 7,4 ± 0,1 1,4 ± 0,1 5,6 ± 0,3 5,9 ± 0,5 1,5 ± 0,3 22,7 ± 1,7
Brevibacterium sp. !МВ В-7447 7,3 ± 0,1 1,8 ± 0,1 1,3 ± 0,3 31,9 ± 0,4 1,8 ± 0,4 46,4 ± 2,2
Продуценти треоніну
Brevibacterium flavum 6,6 ± 0,1 1,1 ± 0,1 5,4 ± 0,2 2,0 ± 0,4 2,0 ± 0,2 7,1 ± 0,1
Brevibacterium flavum !МВ В-7446 6,7 ± 0,1 1,4 ± 0,1 1,5 ± 0,3 4,5 ± 0,5 7,9 ± 0,3 11,8 ± 0,2
Вихідний штам-продуцент лізину на мелясових середовищах накопичував біомасу, проте мав низький рівень синтезу лізину і в незначній кількості споживав цукор із середовища (конверсія цукру — 22,7%). Мутантний штам на мелясових середовищах активно накопичував біомасу і мав підвищений рівень синтезу лізину — більш ніж у 5 разів порівняно з вихідним штамом. Також мутантний штам активно споживав цукор із середовища (конверсія цукру становила 46,4%).
Вихідний штам ВтеьіЬасіетіит Ааииш на мелясових середовищах накопичував біомасу, мав низький рівень синтезу треоніну і споживав цукор із середовища в незначній кількості (конверсія — 7,1%). Мутантний штам ВтеьіЬасіегіиш Ааииш за культивування на мелясових середовищах продукував у 4 рази більше треоніну, ніж вихідний, та інтенсивно споживав цукор (конверсія — 11,8%).
Таким чином, досліджено вплив УФ-оп-ромінення на вегетативні клітини бревібак-терій та коринебактерій, визначено ЬБ для культур і відібрано, з використанням генетичних маркерів, найперспективніші мутантні штами для продукування незамінних амінокислот. У результаті дії УФ-опромінен-ня на продуценти треоніну та лізину одержано мутантний штам ВтеьіЬасіегіиш ^аииш ІМВ В-7446 (продуцент треоніну), який за біо-синтетичною активністю та продукуванням амінокислоти відрізнявся від вихідної культури більш ніж у 4 рази, а також мутантний штам ВтеьіЬасіегіиш ер. ІМВ В-7447, який продукував майже у 5 разів більше лізину порівняно з вихідним штамом. Отримані штами-продуценти депоновано в Національному депозитарії мікроорганізмів «Інституту мікробіології і вірусології» НАН України.
REFERENCES
1. Pyrog T. P., Ignatova O. A. General Biotechnology: Textbook. Kyiv: NUFT. 2009, 336 p. (In Ukrainian).
2. Pidgorsky V. S., Iutynska G. O., Pyrog T. P. Intensification of technologies of microbial synthesis. Kyiv: Naukova dumka. 2010, 328 p. (In Ukrainian).
3. avaiable at http://www.biotechnolog.ru (In Russian).
4. Hermann T. Industrial Production of amino acid by coryneform bacteria. J. Biotechnol. 2003, V.104, P.155-172.
5. Anastassiadis S. L-Lysine Fermentation. Recent Patent Biotechnology. 2007, N 1, P. 11-24.
6. Fedorenko V. O, Ostash B. O, Honchar M. V., Rebets Yu. V. Large workshop on genetics, genetic engineering and analytical biotechnology of microorganisms. Lviv: Vidavnichyi tsentr LNU imeni Ivana Franka. 2006, 279 p. (In Ukrainian).
7. Totskiy V. Genetics. Odesa: Astroprint. 2002,712 p. (In Russian).
8. Shulga S. M, Tigunova O. O, Tkachenko A. F, Bejko N. E, Andriiash G. S., Pryyomov S. G. Threonine biosynthetic process intensification. Biotechnologiya. 2011,4(5), 97-102. (InUkrainian).
9. Polygalina G. V. Technochemical control of alcohol and distillery industries. Moscow: Kolos. 1999, 336 p. (In Russian).
10. Lysak V. V. Microbiology. Uchebnoe posobie. Minsk: BGU. 2007, 469 p. (In Russian).
11. Andriiash G. S., Zabolotna G. M., Shulga S. M. Auxotrophity of producents of lysin. Biotechnologiya. 2012, 5(1), 70-77. (In Ukrainian).
12. Yetti M. I., Pudjiraharti S. Strain improvement of Brevibacterium sp ATCC 21866 for L-lysine production using ultra violet irradiation. Technol. Indonez. 2004, N 27, P. 9-16.
13. Andriiash G. S., Zabolotna G. M., Shulga S. M. Regulation and intensification ways of lysine biosynthesis. Microbiologiya ta Biotechnologiya. 2012, N 4, P. 6-17. (In Ukrainian).
МУТАНТНЫЕ ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ЛИЗИНА И ТРЕОНИНА
Г. С. Андрияш Г. М. Заболотная С. М. Шульга
ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины», Киев
E-mail: Shulga5@i.ua
Исследованы штаммы микроорганизмов — продуцентов незаменимых аминокислот аспартатного семейства: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. Е531 из «Коллекции штаммов микроорганизмов и линий растений для пищевой и сельскохозяйственной биотехнологии» ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины» по биосинтетической активности относительно лизина и треонина. После УФ-облучения были получены активные штаммы-продуценты, изучены биологические особенности этих микроорганизмов и определена их биосинтетическая эффективность.
С помощью анализа регуляторной и аналогорезистентной ауксотрофности выбраны новые мутантные штаммы треонина и лизина. Исследована чувствительность исходных и мутантных штаммов-продуцентов к пени-циллинам, макролидам, цефалоспоринам, тетрациклинам и другим группам антибиотиков. Определена биосинтетическая активность полученных продуцентов треонина — Brevibacterium flavum ШВ В-7446 и лизина — Brevibacterium sp. MB В-7447 по продуцированию целевых аминокислот. Штаммы депонированы в «Национальном депозитарии микроорганизмов» Института микробиологии и вирусологии НАН Украины.
Ключевые слова: продуцирование лизина и треонина, мутантные штаммы-продуценты.
THE MUTANT STRAINS OF MICROORGANISMS — PRODUCERS OF LYSINE AND THREONINE
G. S. Andriiash G. M. Zabolotna
S. M. Shulga
SI «Institute of Food Biotechnology and Genomics of the National Academy of Sciences of Ukraine», Kyiv, Ukraine
E-mail: Shulga5@i.ua
Strains-producers of essential amino acids of aspartate family such as Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90H, Brevibacterium sp. E531 from «Collections strains and lines of plants for food and agricultural biotechnology» of «Institute of Food Biotechnology and Genomics of the National Academy of Sciences of Ukraine» for biosynthetic activity for lysine and threonine were investigated. Active strains-producers of amino acids were obtained after UV irradiation, biological characteristics of these organisms were studied and their biosynthetic efficiency was estimated.
New mutant strains of threonine and lysine were selected using analysis of regulatory and analogorezistent auxotrophy. Sensitivity of output and mutant strain-producers to penicillins, macrolides, cephalosporins, tetracyclines, and other groups of antibiotics was investigated. Biosynthetic activity of obtained threonine producers — Brevibacterium flavum IMB B-7446 and lysine — Brevibacterium sp. IMB B-7447 on the production of target amino acids was determined. Strains are deposited in the «National Depository microorganisms» of the Institute of Microbiology and Virology of the National Academy of Sciences of Ukraine.
Key words: lysine, threonine, mutant strains-producers, ultraviolet irradiation.
