CC BY
48
УДК 577.152.34:577.151.5
ОСОБЛИВОСТІ РОСТУ І БІОСИНТЕЗУ ЕЛАСТАЗИ МУТАНТНИМ ВАРІАНТОМ BACILLUS SP. 27-88ELS+
О. В. Мацелюх
Н. А. Нідялкова Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ
Л. Д. Варбанець
varbanets@serv.imv.kiev.ua
Вивчення динаміки росту культури Bacillus sp. 27-88Els+, а також характеру синтезу еластази показало, що ензимоутворення відбувається одночасно з ростом культури. Встановлено вплив різних джерел вуглецю і азоту на синтез еластази культурами Bacillus sp. 27-88Els+ і Bacillus sp. 27. Показано, що синтез еластази батьківським штамом Bacillus sp. 27 залежить від присутності в середовищі росту низькомолекулярних джерел як вуглецю, так і азоту, при цьому вплив регуляції такого виду на синтез еластази мутантним варіантом послаблений. Додаючи в середовище росту аланін як єдине джерело азоту, виявили еластазну активність в культуральній рідині мутантного варіанта Bacillus sp. 27-54Els.
Ключові слова: еластаза, біосинтез, Bacillus sp.
Основною умовою існування будь-якого живого організму є наявність тонкої, гнучкої, скоординованої системи регуляції, в якій усі елементи тісно зв’язані один з одним. У протеїновому синтезі не тільки кількісний
і якісний склад протеїнів, але й час синтезу мають велике значення. Від цього залежить пристосованість мікроорганізмів до умов навколишнього середовища. Синтез протеїну регулюється зовнішніми і внутрішніми чинниками, які визначають синтез у клітині відповідної кількості й набору протеїнів, необхідних для виконання фізіологічних функцій. Бацили синтезують різноманітні позаклітинні ензими, серед яких однією з найбільш вивчених є група протеаз. Гени багатьох із цих ензимів клоновано й секве-новано, для деяких протеїнів встановлено просторові структури, але при цьому питання про функціональну роль і механізми регуляції їх біосинтезу дотепер залишається недостатньо з’ясованим. Раніше за допомогою N-нітрозогуанідину було отримано мутант Bacillus sp. 27-88Els+ з підвищеним синтезом еластази в 2,5 раза порівняно з батьківським штамом [1, 2]. Встановлено, що, на відміну від батьківського штаму, в якого виявлено два ензими з еластолітичною активністю, мутантний варіант здатен синтезувати лише один з них. Це дало підстави припустити, що синтез ензиму збільшився завдяки регуляторним змінам.
Метою даної роботи було встановити особливості змін у біосинтезі еластази мутантним варіантом Bacillus sp. 27-88Els+.
Матеріали і методи
Об’єктом дослідження були штами Bacillus sp. 27-88Els+ з підвищеною в 2,5 раза еластазною активністю, Bacillus sp. 27-54Els , у якого еластазну активність не було виявлено, а також батьківський штам Bacillus sp. 27. Штами Bacillus sp. 27-88Els+ і Bacillus sp. 27-54Els- отримали раніше шляхом хімічного мутагенезу [1] з вихідного штаму Bacillus sp. 27, виділеного з води Чорного моря.
Культивування бактерій проводили на рідкому середовищі такого складу (г/л): KH2PO4 — 1,6; MgSO4-7H2O — 0,75; ZnSO4 -7H2O — 0,25; (NH4)2SO4 — 0,5; мальтоза — 1,0; желатин — 10,0; дріжджовий ав-толізат — 1,5 мл або 150 мг (0,15 г) [3].
Динаміку росту культури вивчали в умовах вирощування на рідкому живильному середовищі зазначеного складу при 42 °С, на качалці при 200 об/хв. Інокулюм отримували з однодобової культури, вирощеної в пробірках на скошеному м’ясопептонному агарі (МПА). Приріст біомаси визначали нефело-метрично за довжини хвилі 590 нм. В куль-туральній рідині, звільненій від клітин центрифугуванням при 6 000g, 30 хв, визначали рН, вміст протеїну, ензиматичну
активність. Визначення біомаси проводили ваговим методом після її відділення від культуральної рідини, відмивання дистильованою водою та висушування до постійної маси при 100 °С.
Для вивчення впливу різних джерел азоту та вуглецю на біосинтез еластази і ростові параметри культур як джерела азоту використовували: метіонін, валін, серин, аспарагінову кислоту, треонін, глутамінову кислоту, аланін, лейцин, аспарагін, ізолейцин, гліцин, аргінін солянокислий, гістидину гідрохлорид, фенілаланін, нітрат натрію, сульфат амонію, желатин, дріжджовий ав-толізат в концентрації 0,2% в перерахунку на вміст азоту в середовищі. Моносахариди (арабіноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, ма-ноза, рамноза, сорбоза); дисахариди (мальтоза, лактоза, сахароза); трисахариди (рафі-ноза), багатоатомні спирти (маніт, сорбіт, дульцит), а також соєве та кукурудзяне борошно слугували джерелами вуглецю. Їх вносили в концентрації 0,55% у перерахунку на вміст вуглецю в середовищі. Як контроль використовували стандартне середовище описаного вище складу.
Протеолітичну (казеїнолітичну) активність визначали за методом Ансона в модифікації Петрової [4], еластазну (ЕА) — колориметрично за інтенсивністю забарвлення розчину при ензиматичному гідролізі Елас-тину-Конго Рот [5]. Усі експерименти проводили у трьох повторностях. Наведено середні арифметичні величини; відхилення від середнього значення не перевищувало 5%.
Результати та обговорення
Встановлення фізіологічних шляхів регуляції базується на вивченні характеру біосинтезу ензимів. У мікроорганізмів існує декілька типів синтезу гідролаз: кінетична модель (утворення ензимів відбувається в експо-
ненційній фазі одночасно з ростом продуцентів), модифікація кінетичної моделі (синтез ензимів триває і після припинення росту культури, що характерно для катаболітних ензимів), двофазний процес (ензими починають синтезуватися в період уповільнення або повного припинення росту мікроорганізмів). У більшості випадків синтез катаболітних ензимів мікроорганізмів описується кінетичною моделлю і відбувається в експоненційній та постекспоненційній фазах розвитку культур. Вивчення динаміки росту культури Bacillus sp. 27-88Els+ показало (рис. 1), що максимальний синтез еластази відзначається в експоненційній фазі на 18-ту год культивування, що збігається з максимальною швидкістю росту культури. Таким чином, цей ензим можна віднести до катаболітних ензимів, тобто таких, які синтезуються за кінетичною моделлю, коли ріст культури і синтез еласта-зи відбуваються одночасно.
Основними механізмами, які регулюють катаболітні шляхи, є індукція синтезу ензимів та катаболітна репресія. Катаболітну репресію можна розглядати як пристосування клітини до використання насамперед найбільш легкодоступних джерел енергії. Біосинтез протеолітичних ензимів мікроорганізмами залежить від джерел харчування, в основному вуглецю й азоту в середовищі. Присутність в живильному середовищі сполук азоту і вуглецю, які швидко метаболізу-ються клітинами, підтримує високий пул амінокислот. Це призводить до інтенсивного синтезу нетрансляційних РНК і мРНК внутрішньоклітинних протеїнів. При цьому вміст фактора ініціації і РНК-полімерази, яка бере участь у синтезі мРНК екзопротеаз, незначний, унаслідок чого зменшується частота транскрипції мРНК екзопротеаз. Вичерпання в процесі росту будь-якого із цих субстратів спричинює зниження вмісту вільних амінокислот і посилення синтезу екзоензимів [6].
» ЕА —я Кількість протеїну —л-.— Ріст культури
0 2 4 б Н Ю 12 14 16 1S 20 22 24 26 2S
Рис. 1. Динаміка синтезу еластази культурою Bacillus sp. 27-88Els+
Тобто, продукти дії ензимів можуть репресувати їх синтез, і таким чином синтез зовнішньоклітинних протеаз пригнічується в присутності амінокислот або пептидів. Для Bacillus megaterium показано, що амінокислоти, які синтезуються ендогенно в постло-гарифмічній і стаціонарній фазах, зупиняють синтез протеази [7]. Виявлено, що окремі амінокислоти здатні різною мірою пригнічувати синтез екзопротеаз Аrthrobot-rys compacta, при цьому найбільш виражений інгібуючий ефект спостерігався для триптофану, орнітину та гістидину [8]. Аналіз джерел літератури показав, що іони амонію також інгібують продукцію протеаз за типом азотметаболітної репресії [9]. Так, встановлено, що іони амонію інгібують продукцію протеаз Bacillus intermedius [10]. Біосинтез цих сполук можна активізувати не тільки внаслідок заміни амонію в живильному середовищі на менш ефективні джерела азоту, але й за допомогою специфічних мутацій, які усувають репресію амонієм. Загалом вплив амінокислот на накопичення протеаз неоднозначний і може спричинювати як індукцію, так і репресію синтезу ензимів.
У результаті досліджень встановлено, що високомолекулярні й низькомолекулярні сполуки азоту (окремі амінокислоти й неорганічні сполуки) неоднаково впливають на синтез екзопротеаз батьківським штамом, мутантними варіантами з підвищеним синтезом еластази і за його відсутності. Показано, що всі досліджені сполуки азоту тією чи іншою мірою пригнічували синтез еластази Bacillus sp. 27-88Els+ (рис. 2), при цьому синтез неспецифічних протеаз, які визначали за активністю до казеїну, практично не змінювався.
Найбільш виражений репресуючий ефект мали глутамінова й аспарагінова кислоти, триптофан і дріжджовий автолізат, які повністю пригнічували біосинтез еластази мутантним варіантом Bacillus sp. 27-88Els+. Закономірностей щодо впливу низькомолекулярних і високомолекулярних сполук азоту на продукування ензиму не було встановлено. Водночас синтез еластази батьківським штамом Bacillus sp. 27 був більш залежний від джерела азоту в культуральному середовищі (рис. 2).
Так, неорганічні сполуки азоту, а також деякі амінокислоти (аспарагінова, глутамінова, гістидин, аспарагін, метіонін і валін) повністю пригнічували його еластазну активність, а желатин, як єдине джерело азоту, навпаки, стимулював. Це може свідчити про змішаний тип регуляції синтезу еластази вихідною культурою, яка здійснюється за рахунок як індукції (желатин), так і репресії синтезу [8]. Дослідження впливу різних концентрацій джерел азоту (рис. 3) в культуральному середовищі Bacillus sp. 27-88Els+ показало, що синтез елас-тази відбувається за концентрації джерела азоту в середовищі не більше 0,2%. Підвищення концентрації повністю пригнічує синтез ензиму. Цікавим фактом було те, що на середовищі
з аланіном мутант, у якого не виявлено елас-тазної активності, — Bacillus sp. 27-54Els синтезує цей ензим, але в невеликій кількості — до
2 од/мл. Дане явище може означати, що в цьому штамі синтез еластази не відсутній, а, ймовірніше, заблокований певним регулювальним механізмом (можливо, підвищений синтез власного інгібітора).
Динаміка накопичення протеїну і біомаси (рис. 4, 5) була практично однаковою
20,00
- ' ' К
ъ
w
cd
- ц:.п::-
И
м
cd
Ъ
\ -
К
н
0,00
Bacillus sp. 27-88Els+
.1.1.1 III
Bacillus sp. 27-54Els-
Bacillus sp. 27
Рис. 2. Вплив джерел азоту на еластазну активність штамів Bacillus sp. 27-88Els+, Bacillus sp. 27-54Els- і Bacillus sp. 27
и
PQ
В
Ен
W
<
16 -I
14 -12 -10 -8 б
4 -
2 ] О
IEA □ Протеїн
Я
Т 9 -- 8
S
' і U
^ О ft И
+ 2 1
^ Jp <# Л* ^ <8* ¿0s
V (\/ СЧ? v7 V г\_У Л? > V с\У V" Л/ Л? v .? ‘'и1
г
#ь
#“
Рис. 3. Синтез еластази мутантним варіантом Bacillus sp. 27-88Els+ за різних концентрацій джерел азоту
I Bacillus sp. 27-88Els+ ■ Bacillus sp. 27-54Els 3 Bacillus sp. 27
S*s/S/s*/SSS/SSSSSS
£ jf -if
<r Jr &
Vу
Рис. 4. Вміст протеїну в культуральному середовищі Bacillus spp. за наявності різних джерел азоту
14 ---------------------------------------------------------------------
■ Bacillus sp. 27-88Els+ ■ Bacillus sp. 27-54Els~ В Bacillus sp. 27
12 ■
4
5 "
cd
О
C0
§
о
•I—I
и
0 -
і і F4F
пі шт По і II її
\~ ' ^
Рис. 5. Вміст біомаси в культуральному середовищі Bacillus spp. за наявності різних джерел азоту
у всіх трьох досліджуваних штамів, але зростала у варіантах з желатином і дріжджовим автолізатом. Найбільший ріст Bacillus sp. 27-88Els+, 27-54Els- і 27 спостерігався саме на середовищах з дріжджовим автолізатом. Це може бути пов’язано з тим, що він є джерелом вітамінів групи В, мікроелементів (залізо, мідь, молібден, цинк), які можуть виступати як кофактори під час біосинтезу протеїну, а також вуглеводу трегалози, однак при цьому синтез еластази не відбувається.
Досліджуючи вплив різних джерел вуглецю на синтез еластази, встановили, що в процесі вирощування на середовищах з глюкозою, манітом, сорбозою або сахарозою, як єдиними джерелами вуглецю (рис. 6), синтез еластази батьківським штамом Bacillus sp. 27 повністю пригнічувався. Крім того, показано, що збільшення мальтози в середовищі до 10 г/л також повністю інгібувало біосинтез еластази, а це може свідчити про вуглецеву катаболітну репресію синтезу еластази даним штамом. Натомість, мутантний варіант Bacillus sp. 27-88Els+ не був таким чутливим до збільшених концентрацій різних вуглеводів у середовищі і синтезував ензим на всіх використаних в роботі речовинах. Під час росту на арабінозі біосинтез еластази у Bacillus sp. 27-88Els+ був практично такий самий, як і в контрольному варіанті. Слід, однак, зауважити, що синтез еластази мутантним варіантом знижувався в 6-7 разів у присутності сорбози, лактози, рафінози, соєвого і кукурудзяного борошна, а також багато-
атомних спиртів — дульциту, маніту, сорбіту. Практично ті самі закономірності спостерігалися і в дослідженні синтезу неспецифічних протеаз: батьківський штам був більшою мірою залежний як від джерела вуглецю в середовищі, так і від його кількості.
Накопичення біомаси і протеїну (рис. 7, 8) у всіх трьох штамів зростало на комплексних середовищах з кукурудзяним і соєвим борошном, желатином і дріжджовим автолі-затом (контрольне). Вміст протеїну в культуральному середовищі у всіх штамів був дещо збільшений в присутності ксилози і сорбози.
Вивчення зміни рН культурального середовища Bacillus sp. 27-88Els+ на 18-ту год культивування свідчить (рис. 9), що зниження рН до значення менше 5 пригнічує синтез еластази (глутамінова і аспарагінова кислоти, гістидину гідрохлорид). Оптимальними для синтезу еластази були кінцеві показники рН від 6,5 до 8. За лужних значень рН 8-8,2 еластазна активність була максимальною під час росту на желатині й лише для Bacillus sp. 27. Для Bacillus sp. 27-88Els+ найвище значення рН 8,2 було на середовищі з ізолейцином, при цьому синтез елас-тази знижувався. Усе це може свідчити про те, що еластаза мутантного штаму нестійка до знижених і підвищених (більше 8) значень рН.
Таким чином, еластаза Bacillus sp. 27-88Els+ є конститутивним катаболітним ензимом, синтез якого описується кінетичною моделлю
2І
2D
Bacillus sp. 27-88Els+ — Bacillus sp. 27
я ■ j K
Eh
K
C0 Cd ffi M C0 b §
Л '
10
H
1
Li
if
А/
■Ф
Рис. 6. Вплив різних джерел вуглецю на еластазну активність штамів Bacillus sp. 27-88Els+ і Bacillus sp. 27
и
Ен
О
ft
G
I Bacillus sp. 27-88Els+ ■ Bacillus sp. 27-54Els B Bacillus sp. 27
^^У У,/^ ^ ■/‘У У J'
c/,/
у
Рис. 7. Накопичення протеїну культурами Bacillus spp. за різних джерел вуглецю в середовищі
I Bacillus sp. 27-88Els+ Л Bacillus sp. 27-54Els Q Bacillus sp. 27
j? j? 4? у j J- j f & J' у у у z5 <f j?
^ <»* <f ф ^ ü tí* * ^ ^ .fcP4
Л0 ^
cf
*4?
Рис. 8. Накопичення біомаси культурами Bacillus spp.за різних джерел вуглецю в середовищі
ензимоутворення. Синтез еластази батьківського штаму Bacillus sp. 27 регулюється катаболітною репресією за змішаним типом (як вуглецева, так і азотна), і вплив цього виду регуляції на синтез еластази мутантним варіантом найімовірніше послаблений. Синтез еластази Bacillus sp. 27-88Els+ залежить від концентрації джерела азоту в середовищі: з підвищенням вмісту азоту до 0,5% синтез ензиму припиняється. Синтез еластази у мутантного варіанта
Bacillus sp. 27-54Els- очевидно заблокований власним інгібітором, який взаємодіє
з ензимом за допомогою алостеричних взаємодій, що впливають на активність ензиму.
Автори висловлюють подяку проф. В. О. Іваниці (зав. кафедрою мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова) за надану культуру Bacillus sp. 27.
Bacillus sp. 27-88Els+
S Bacillus sp. 27
Контроль Дріждж. автолізат Желатин 0^Н4)25О, НаГО, Триптофан Гістидин Аргінін Гліцин Ізолейцин Аспарагін Лейцин Аланін Глугамінова кислота Треонін Аспарагінова кислота Серин Валін Метіонін
Контроль Кукурудзяне борошно Соєве борошно Рафіноза Сахароза Мальтоза Лактоза Сорбоза Сорбіт Рамноза Маноза Маніт Ксилоза Дульцнг Глюкоза Галактоза Арабіноза
Н
н
ЩЩДрЩЩ
»Ж**ЖЦН 1
шшЛш Ьн
10
pH
10
Рис. 9. Зміна рН культуральних середовищ Bacillus sp. 27-88Els+ і Bacillus sp. 27 під час вирощування на різних джерелах азоту та вуглецю (вісь ординат)
ЛІТЕРАТУРА
1. Мацелюх О. В. Отримання мутантів Вacillus sp. з підвищеною здатністю до синтезу еластази // Біотехнологія. — 2010. — Т. 3, № 2. — С. 42-47.
2. Шубчинська А. С., Варбанець Л. Д., Нагор-на С. С., Сафронова Л. А. Скринінг мікроорганізмів — продуцентів протеаз // Мік-робіол. журн. — 2О08. -Т. 70, № 1. — С. 3-9.
3. Колтукова Н. В., Васкивнюк В. Т. Подбор методов выделения протеолитического комплекса из Bacillus mesentericus 316м при глубинном выращивании // Там же. — 1980. — Т. 42, № 2. — С. 245-248.
4. Петрова И. С., Винцюнайте М. Н. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения // Прикл. биохим. микробиол. — 1966. — Т. 2, № 1. — С. 322-327.
5. Trombridg G. O., Moon H. D. Purification of human elastase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. — 1972. — V. 141, N 3. — P. 928-931.
6. Иваница В. А. Биосинтез внеклеточных протеаз культурой Aspergillus candidus: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — М., 1978. — 23 с.
7. Fayyaz U. D., Chaloupka J. Regulation of formation of proteases in Bacillus megaterium IV. The formation of the enzyme in the sporogenous strain KM // Folia Microbiol. — 1999. — V. 15, N 4. — Р. 267-274.
8. Намазов Н. Р., Касумова С. Ю, Гасанов Х. А., Мурадов П. З. Влияние различных источников азота на образование протеолитичес-ких ферментов гриба Arthrobotrys compacta // Вестник МГОУ. — М.: Изд-во МГОУ. — 2010. — № 1. — С. 48-51.
9. Шамсутдинов Т. Р., Балабан Н. П., Марда-нова А. М. и др. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus inter-medius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста // Биоорг. химия. — 2008. — Т. 34, № 3. — С. 322-326.
10. Балабан Н. П., Шарипова М. Р., Габдрахманова Л. А. и др. Синтез и секреция протеи-наз Bacillus intermedius на поздних стадиях спорообразования // Микробиология. — 2003. — Т. 72, № 3. — С. 338-342.
ОСОБЕННОСТИ РОСТА И БИОСИНТЕЗА ЭЛАСТАЗЫ МУТАНТНЫМ ВАРИАНТОМ BACILLUS sp. 27-88ELS+
Е. В. Мацелюх Н. А. Нидялкова Л. Д. Варбанец
Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Изучение динамики роста культуры Bacillus sp. 27-88Els+, а также характера синтеза эластазы показало, что образование энзима происходит одновременно с ростом культуры. Установлено влияние разных источников углерода и азота на синтез эластазы культурами Bacillus sp. 27-88Els+ и Bacillus sp. 27. Показано, что синтез эластазы исходным штаммом Bacillus sp. 27 зависит от присутствия в среде роста низкомолекулярных источников как углерода, так и азота, при этом влияние регуляции такого вида на синтез эластазы мутантным вариантом ослаблено. Обнаружена эластазная активность в культуральной жидкости мутантного варианта Bacillus sp. 27-54Els-при добавлении в качестве единственного источника азота аланина.
Ключевые слова: эластаза, биосинтез,
Bacillus sp.
CHARACTERISTICS OF GROWTH AND ELASTASE PRODUCTION BY MUTANT OF BACILLUS sp. 27-88ELS+
O. V. Matselyukh N. A. Nidialkova L. D. Varbanets
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
The dynamic of growth and character of elas-tase synthesis by strain of Bacillus sp. 27-88 Els+ was investigated. It was established that elastase synthesis occurs simultaneously by growth of culture. Influence of different carbon and nitrogen sources on elastase synthesis by strain of Bacillus sp. 27-88Els+ and Bacillus sp. 27 was studied. It was shown that elastase synthesis via parental strain of Bacillus sp. 27 depends on low-molecular sources of carbon and nitrogen. Influence of such kind of regulation on elastase synthesis via mutant is depressed. It was established the elastolytic activity in the culture fluid of the mutant of Bacillus sp. 27-54Els- at addition of alanine as the sole nitrogen source.
Key words: elastase, biosynthesis, Bacillus sp.
