CC BY
39
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ
УДК 541.49:546.732/3:547.496.2
КООРДИНАЦІЙНІ СПОЛУКИ КОБАЛЬТУ (II, III) З ПОХІДНИМИ ДИТІОКАРБАМОВОЇ КИСЛОТИ — МОДИФІКАТОРИ АКТИВНОСТІ ЕНЗИМІВ ГІДРОЛІТИЧНОЇ ДІЇ
Л. Д. Варбанець1
О. В. Мацелюх1 1Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного
H. А. Нідялкова1 НАН України, Київ
К. В. Авдіюк1
О. В. Гудзенко1 2Одеський національний університет ім. І. І. Мечникова
I. Й. Сейфулліна2 Г. М. Масановець2 М. В. Хитрич2
Е-mail: [email protected]
Отримано 30.07.2012
Хлоридні, бромідні та ізотіоціанатні комплекси кобальту (II) з N-заміщеними тіокарбамоїл-N'-пентаметиленсульфенамідами (1)-(12), а також комплекси кобальту (II, Ш) з похідними морфолін-4-карбодитіової кислоти (13)-(18) було використано як модифікатори активності ензимів гідролітичної дії — пептидаз Bacillus thuringiensis ІМВ В-7324, амілаз Bacillus subtilis 147 і Aspergillus flavus var. oryzae 80428, рамнозидаз Eupenicillium erubescens 248 та Cryptococcus albidus 1001. Встановлено, що сполуки кобальту (II, Ш) неоднаково впливають на активність досліджуваних ензимів, виявляючи як інгібуючу, так і стимулювальну дію. Це дає підстави припустити, що прояв активності комплексної молекули залежить від ліганду та наявності аніона — Cl-, Br- або NCS-. Висока активуюча дія комплексів кобальту (II) з N-заміщеними тіокарбамоїл-№-пентаметиленсульфенамідами (1)-(12) на еластазну і фібринолітичну активність пептидаз, порівняно з трис(4-морфолінкарбодитіоатом)кобальту (ІІІ) (14) та продуктами його взаємодії з галогенами (15)-(17), що спричинюють, навпаки, інгібування, найімовірніше, зумовлена наявністю в них слабкого зв’язку S-N, який легко піддається гомолітичному розриву. Досліджуючи вплив комплексів кобальту (II) на активність a-L-рамнозидаз Cryptococcus аlbidus та Eupenicillium erubescens, виявили, що більшість сполук інгібують їхню активність, причому інгібуюча дія більшою мірою виявляється щодо ензимного препарату C. аlbidus. Отже, можна констатувати, що характер впливу комплексів кобальту(П) з N-заміщеними тіокарбамоїл-N'-пентаметиленсульфенамідами, а також комплексів кобальту (II, Ш) з похідними морфолін-4-карбодитіової кислоти змінюється залежно як від штаму-продуцента, так і досліджуваного ензиму. Відмінність у впливі комплексів на різні ензими зумовлена характеристиками будови та функціональних груп активного центру, які також є відповідальними за зв’язування з модифікаторами.
Ключові слова: комплекси кобальту (II, Ш), дитіокарбамова кислота, ензими з еластазною, фібринолітичною, амілазною і рамнозидазною активністю.
Використання біологічно активних речовин мікробного походження в практичних і теоретичних цілях є однією з основних стратегій сучасних біотехнологічних процесів. Це пов’язано передусім з необмеженістю джерел, зокрема мікробних продуцентів, висока швидкість розмноження яких і кон-трольованість умов синтезу ними біополіме-рів створює умови для одержання речовин з попередньо заданими властивостями та специфічністю дії. На сьогодні мікроорганізми є найбільш технологічним і економічним джерелом отримання таких ензимів, як гідролази, рівень активності яких часто на порядок перевищує рослинні й тваринні
аналоги. Для підвищення активності ензимів можна застосовувати низку підходів, зокрема оптимізацію умов культивування, використання індукторів синтезу як синтетичного, так і природного походження. Але в останні роки особливу увагу дослідників спрямовано на пошук речовин, які здатні впливати на активність ензимів, зокрема координаційних сполук перехідних металів. Комплекси ^елементів є електроноакцеп-торними агентами, що приєднуються до органічних та неорганічних молекул у місцях надмірної електронної щільності. Це сприяє утворенню донорно-акцепторних зв’язків з більшою кількістю хімічно пасив-
них молекул, які містять оксиген і нітроген як донорні атоми. Відомо, що вибір ліганду справляє значний вплив на здатність координаційних сполук виявляти як інгібуючу, так і активуючу дію на активність ензимів. При цьому суттєву роль відіграє наявність того чи іншого комплексоутворювача. Раніше [1] нами вивчено вплив координаційних сполук цинку(П) з N-заміщеними тіокарбамоїл-№-пентаметиленсульфенамі-дами, які містять фрагменти диметиламіну (L1), діетиламіну (L2), піперидину (L3) та морфоліну (L4), на еластазну, a-L-рамнози-дазну і a-галактозидазну активність. Виявлено, що характер взаємодії досліджуваних комплексів цинку (II) змінюється залежно від особливостей ензиму і штаму-продуцен-та. Це свідчить про те, що відповідальними за зв’язування з модифікаторами є різні функціональні групи, які входять до складу ензиму і відрізняються будовою та донорни-ми центрами. Враховуючи одержані результати, постає питання: яким чином заміна металу може вплинути на активність аналогічних комплексів як модифікаторів різних ензимів, та чи виявлятиметься різниця у характері дії на ензими у разі використання різноманітних похідних дитіокарбамової кислоти? Для відповіді як об’єкти було вибрано координаційні сполуки кобальту (II) з N-заміщеними тіокарбамоїл-№-пен-таметиленсульфенамідами та комплекси кобальту (II, Ш) з похідними морфолін-4-карбодитіової кислоти і досліджено їх вплив на активність таких гідролітичних ензимів, як еластаза, фібринолітична пептидаза, a-амілаза, a-L-рамнозидаза.
Матеріали і методи
Об’єктами дослідження були штами Bacillus thuringiensis ШВ В-7324, Bacillus subtilis 147, Aspergillusflavus var. oryzae 80428, Eupenicillium erubescens 248, Cryptococcus albidus 1001, одержаних з колекцій Інституту мікробіології і вірусології (ШВ) ім. Д. К. Заболотного НАН України.
Для синтезу позаклітинних пептидаз
B. thuringiensis ШВ В-7324 культивували на рідких живильних середовищах, оптимізо-ваних нами раніше. Для синтезу еластази використовували середовище такого складу (г/л): KH2PO4 — 1,б; MgSO4 7H2O — 0,75; ZnSO47H2O — 0,25; (NH4)2SO4 — 0,5; арабі-ноза — 1,5; желатин — 10,0; дріжджовий автолізат — 0,15; рН — б,5 [2], а для накопичення фібринолітичної пептидази (г/л): мальтозу — 19,0, (NH4)2SO4 — 12,0, КН2РО4 —
1,б, ZnSO4 7H2O — 0, 25, MgSO4 7H2O — 0,75, рН 7,5 [3]. Штам вирощували протягом 18 год (для одержання еластолітичної пептидази 1) і 48 год (фібринолітичної пеп-тидази 2) у колбах на качалках (150-200 мл середовища, 42 °С, 200 об/хв). Інокулюм отримували на відповідних середовищах упродовж 18 год і засівали в колби у кількості 105-10б КУО/мл.
Очищення пептидаз здійснювали на нейтральних і заряджених TSK-гелях Toyopearl HW-55 та DEAE-650(M) (Toyoso-da, Японія), як описано раніше [4, 5]. Вміст протеїну на всіх стадіях очищення реєстрували на спектрофотометрі СФ-26 (ЛОMО, СРСР) при 280 нм. Унаслідок очищення було отримано пептидазу 1 зі специфічністю до еластину і фібрину та пептидазу 2 — тільки до фібрину. Еластазну активність визначали колориметрично за інтенсивністю забарвлення розчину під час ензиматичного гідролізу еластину, забарвленого конго-рот [б]. Інкубаційна суміш містила 5 мг еластину, 2,0 мл 0,01 M Tris-HCl буфера (рН 7,5) з додаванням 0,005 M CaCl2 і 1 мл розчину досліджуваного препарату. Суміш інкубува-ли протягом 5 год за 37 °С. Негідролізований еластин відділяли центрифугуванням при 8 000 g, 10 хв. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі СФ-2б при 515 нм. За одиницю активності приймали таку кількість ензиму, яка каталізує гідроліз 1 мг субстрату за 1 хв у стандартних умовах.
Фібринолітичну активність вимірювали за методом Masada [7], як субстрат використовували фібрин, отриманий з плазми крові людини на станції переливання крові. Для реакційної суміші брали 1 мг фібрину, 1,8 мл 0,01 M Tris-HCl буфера (рН 7,5) з додаванням 0,005 M CaCl2 і 0,2 мл розчину досліджуваного препарату. Інкубаційну суміш витримували 30 хв при 37 °С. Утворення продуктів розщеплення вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при 275 нм. За одиницю фібринолітичної активності приймали таку кількість ензиму, яка підвищує оптичну густину реакційної суміші на 0,01 за 1 хв в умовах досліду.
Продуцентами a-амілази були A. flavus var. oryzae і B. subtilis. A. flavus var. oryzae культивували на рідкому живильному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 — 1; KH2PO4 — 1; KCl — 0,5; MgSO47H2O — 0,5; FeSO4-7H2O — 0,015; нерозчинний картопляний крохмаль — 10; рН 6,0. Для вирощування B. subtilis використовували рідке живильне середовище такого складу (г/л): NaNO3 — 2; KH2PO4 — 1; KCl — 0,5;
MgSO4 7H2O — 0,5; FeSO4 7H2O — 0,015; нерозчинний картопляний крохмаль — 1; соєва мука — 10; рН 6,0 [8]. Культивування мікроорганізмів на зазначених вище середовищах проводили глибинним методом в 0,5 л колбах Ерленмеєра на качалках зі швидкістю обертання 220 об/хв за температури 25 “С (A. flavus var. oryzae) та 42 “С (B. subtilis) протягом 5 і 3 діб, відповідно. Біомасу відділяли фільтруванням або центрифугуванням, а в супернатанті культуральної рідини визначали вміст протеїну й амілолітичну активність. Meтоди виділення та очищення амілаз описано раніше [8]. Вони включали гель-фільтрацію на нейтральному TSK-гелі — Toyopearl HW-50 (Toyosoda, Японія), іонообмінну хроматографію на DEAE-Toyopearl 650 M (Toyosoda, Японія), а також метод афінної сорбції на крохмалі. Амілолітичну активність визначали згідно з ГОСТом 20264.4-89 [9].
Продуценти a-L-рамнозидаз C. albidus і E. erubescens вирощували глибинним способом упродовж чотирьох діб за температури 28 “С, на качалках при 220 об/хв. C. albi-dus культивували на оптимізованому раніше [10] середовищі такого складу (г/л): рамноза — 1, пептон — 5, дріжджовий екстракт — 3, мальтекстракт — 3, рН — б, а E. erubescens — на середовищі Чапека [10], г/л: NaNO3 — 2; KH2PO4 — 1; KCl — 0,5; MgSO4-7H2O; FeSO4-7H2O — 0,015; рамноза — 2,5, рН — 5,5.
Ензимні препарати a-L-рамнозидаз виділяли з культуральних фільтратів продуцентів осадженням сульфатом амонію (до 90% насичення) з наступною хроматографією на заряджених і нейтральних TSК-гeлях (DEAE-Toyоpeаrl 650s і Toyоpearl HW-60, Toyosoda, Японія, відповідно) [11, 12].
a-L-рамнозидазну активність визначали методом Davis [13], використовуючи як субстрат нарингін. За одиницю активності ензиму приймали таку його кількість, яка гідролізує в умовах досліду 1 мкмоль субстрату за 1 хв. Реакційна суміш містила 0,1 мл розчину ензиму в 0,1 M фосфат-цитратному буфері (фЦБ), рН 5,2, 0,1 мл 2,5 hM розчину субстрату. Суміш інкубували протягом 30 хв при 37 “С. Реакцію зупиняли додаванням 3 мл 4 M розчину NaO^ Через 30 хв вимірювали інтенсивність забарвлення реакційної суміші за довжини хвилі 310 нм на спектрофотометрі СФ-26. Специфічна a-L-рам-нозидазна активність препарату становила 12 од/мг протеїну (вміст — 0,01 мг/мл) і 120 од/ мг для C. аlbidus та E. erubescens, відповідно.
Як модифікатори активності ензимів використовували хлоридні, бромідні та ізо-тіоціанатні комплекси кобальту (II) з N заміщеними тіокарбамоїл-№-пентаметилен-сульфенамідами (1)-(12) [14, 15], комплекси кобальту (II, Ш) з похідними морфолін-4-карбодитіової кислоти (13)-(18) [16-18], склад і будову яких наведено на рис. 1, а також СоС12 [19].
Rw4
R' 4S-C?-X X
N. X R2 Вг СІ NCS
(СН3)2 (1) (2) (3)
(С2н5)2 (4) (5) (6)
(СН2)5 (?) (8) (9)
о(сн2)2 (10) (И) (12)
<н
о,
у—\ s—S /
О N=( )=N
4 7 S-S 4
хс?х
(13)
• СНСІз
(14)
^О);22
(15)
(16) - X = СІ
(17) - X = Вг
N"C
k'Yc°)
I 'N
3^.s..^s^C\vs^\s'N'c«,
o
(18)
(NCS)2
Рис. 1. Склад і будова координаційних сполук кобальту (ІІ, ІІІ) з похідними дитіокарбамової кислоти:
К=СНз(Ь1), (Ь2), К=(СИ2)5 (Ьз),
К=(СИ2)20(СИ2)2 (Ь4)
Усі сполуки (1)-(18) синтезовано за розробленими методиками, підтверджено їх індивідуальність та здійснено ідентифікацію сукупністю фізико-хімічних методів дослідження: елементного і рентгенофазового аналізів, мас-спектрометрії, спектроскопії (електронної, ІЧ-, 1Н ЯМР-), термогравімет-рії, кондуктометрії, магнетохімії [14-18].
Вивчаючи вплив різних сполук кобальту (II, III) на активність ензимів, використовували концентрацію від 0,1 до 0,001%, час експозиції 30-60 хв. Сполуки кобальту (II, III) розчиняли в 0,1% ДМСО. У всіх дослідах за 100% прийнято ензиматичну активність за відсутності сполук кобальту (контроль).
На рисунках наведено середні арифметичні значення за результатами п’яти повторювань, відхилення від середнього значення не перевищувало 5%.
Результати та обговорення
Проведені дослідження показали, що сполуки кобальту (II, III) в концентрації 0,01 і 0,001% неоднаково впливають на активність пептидаз (рис. 2). Еластазна активність, порівняно з контролем неістотно збільшувалась у разі використання сполук (концентрація 0,01%) (1), (7), (9), (12), і значно (у 2, 3 рази) — у випадку (11). Водночас інші сполуки практично не впливали або знижували активність — на ~30% у випадку сполуки (4). Слід зазначити, що в концентрації 0,001% досліджені сполуки можна розташувати в такий ряд за зменшенням їхньої активуючої дії на еластазну активність пептидази 1: (9) > (3) > (1) > (4) > (6) > (11) > (12) > (10) > (8) > (2) > (5) > (7). Слід звернути увагу на те, що сполуки (9), (6), (4) істотніше впливають на еластазну активність пептидази 1 за концентрації 0,001% порівняно з концентрацією 0,01%. Варто відзначити, що сполука (19) (СоС12) інгібувала еластазну активність пептидази 1 ~30%, а комплекси (1) (12), на відміну від неї, підвищували її, тимчасом як сполуки (13)-(18) — повністю пригнічували. Із цього можна зробити висновок, що вплив має загалом стабільна комплексна молекула
(I)—(18), прояв активності якої залежить від ліганду та наявності аніона, зокрема у випадку МСБ-аніона [сполуки (9), (3)] вона максимальна.
Найбільш сильний вплив сполуки кобальту (II) справляють на фібринолітичну активність. Так, показано, що максимальна активність пептидази 1 (рис. 3) в 11,2 і 4,5 раза вища за контроль у присутності комплексу (12) в концентраціях 0,01% і 0,001%, відповідно. Фібринолітична активність підвищувалася під дією сполук (1), (5), (6), (7), які активують ензим в 3,5-6 разів, але пригнічувалася за дії сполук (15)-(18) в обох концентраціях на 40-100%. Окрім того, встановлено стабілізуючий вплив сполуки (19), що може також свідчити про вплив різних складових частин молекул комплексних сполук кобальту(П) на активацію або інгібування фібринолітичної активності цього ензиму.
Дослідження впливу сполук кобальту (II, III) на пептидазу 2 показало (рис. 4), що максимальне збільшення фібринолітич-ної активності відбувається під дією сполук
(6) і (18) у концентрації 0,001% і 0,01%, відповідно. Активуючу дію в 1,15-2,0 рази спостерігали і в разі сполук (1), (5), (6), (8),
(II), (12) у концентрації 0,01% та в 1,2 раза —
(10), (12), (13) у концентрації 0,001%. Було
встановлено інгібуючий вплив сполук (2), (3), (4), (9), (14)-(17) в обох концентраціях. Було також виявлено підвищення на 40% фібринолітичної активності за дії сполуки (19). Це може свідчити про участь кобальту (II) в складі досліджуваних координаційних сполук в активації пептидази 2.
Висока активуюча дія комплексів кобальту (II) з М-заміщеними тіокарбамоїл-№-пентаметиленсульфенамідами (1)—(12) на еластазну і фібринолітичну активність пептидаз, порівняно з трис(4-морфолінкарбоди-тіоатом)кобальту (ІІІ) (14) і продуктами його взаємодії з галогенами (15)-(17), що спричинюють, навпаки, інгібування, найімовірніше, зумовлена наявністю в них слабкого зв’язку Б-М, який легко піддається гомолі-тичному розриву.
0,01% ■ 0,001%
1
і І т 1 ]і
1 и і іїІІ
ІГ шг 1 ГШЙШ
15 16 17 18 19
Сполуки кобальту
Рис. 2. Вплив координаційних сполук кобальту (II, III) на еластазну активність пептидази 1 B. thuringiensis: тут і на рис. 3-8 за 100% прийнято ензиматичну активність за відсутності сполук кобальту •0,01% ■ 0,001%
1
! 11 1 [ і 1 1
шш ШІІ Іньс.і
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Сполуки кобальту
Рис. 3. Вплив координаційних сполук кобальту (II, III) на фібринолітичну активність пептидази 1 B. thuringiensis
На активність а-амілази B. subtШs 147 і А flavus уаг. oryzae 80428 досліджені сполуки кобальту (II, III) впливали по-різному: виявляли як активуючу, так і інгібуючу дію. Активність а-амілази B. suЫШs 147 активувалася такими сполуками кобальту (II, III), як (1), (2), (3), (4), (5), (7), (10),
(11), (12), (13), (14) у концентрації 0,01%
0,01% ■ 0,001%
І
і
і І і | | .
1,1 і 1 і
І1ІПІІПМІІНІ11І
0,01% ■ 0,001%
1 2 З 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Сполуки кобальту
Рис. 4. Вплив координаційних сполук кобальту (II, III) на фібринолітичну активність пептидази 2
Б. thuringiensis
(активація від 7 до 37%) і (1), (3), (4), (5), (6),
(7) за концентрації 0,1% (активація від 3 до 25%). Сполуки (8), (13) (17) у концентрації
0,01% виявляли інгібуючу дію на активність цього ензиму (ступінь інгібування становив 11-51%), а сполуки (2), (13)-(17) у концентрації 0,1% інгібували ензим на 23,5-81% (рис. 5). Вивчення впливу сполук кобальту (II, III) на активність а-амілази А. /Іаиив уаг. вгугае 80428 показало, що перші 12 сполук у концентрації 0,01% активували дію ензиму на 7-21,5%. Слабку інгібуючу дію на активність а-амілази виявляли сполуки (1), (4), (5), (6), (7), (8) (від 5 до 10,5%), більш виражену — сполуки
(13)-(18) у концентраціях 0,01% і 0,1% — від 10 до 86%. Виняток становили сполуки (16) і (17), які в концентрації 0,01%, не впливали на активність ензиму (рис. 6).
Отже, найбільшу інгібуючу дію на активність а-амілази Б. виМШв 147 справляли сполуки (14), (15) (0,01%) — активність знижувалася на 33% і 55%; (13), (14), (15), (16), (17), (18) (0,1%) — активність знижувалася на 24%, 41%, 48%, 33,5%, 81%, 26%, відповідно.
Найбільший інгібуючий вплив на активність а-амілази А. /Іаиив уаг. вгугае 80428 мали сполуки (15) (0,01%) — 30% інгібування, а також (13), (14), (15), (17), (18) (0,1%) — 27%, 16%, 85,5%, 86%, 51%, відповідно.
Досліджуючи вплив комплексів кобальту (II) на активність а-Ь-рамнозидаз С. аІЬі-dus та Е. ег^Ьевеепв, виявили, що більшість сполук інгібують їхню активність (рис. 7 і 8). Причому інгібуюча дія більшою мірою виявляється щодо ензимного препарату С. аlЬidus. Сполука (18) у концентрації 0,1% підвищує активність а-Ь-рамнозидази Е. етЬевоепв на 10%, а С. аlЬidus — на 18%.
Отже, можна констатувати, що характер впливу досліджених комплексів кобальту (II) з М-заміщеними тіокарбамоїл-№-пен-таметиленсульфенамідами змінюється залежно від штаму-продуцента та ензиму.
Сполуки кобальту
Рис. 5. Вплив сполук кобальту (II, III) на активність а-амілази B. эпЫШв
п 0,01% ■ 0,001%
Сполуки кобальту
Рис. 6. Вплив сполук кобальту (II, III) на активність а-амілази Л. flavus var. oryzae
Рис. 7. Вплив сполук кобальту (II, III) на активність а^-рамнозидази С. аІШйш
За активністю дії на а-Ь-рамнозидазу С. аШ-dus ліганди можна розташувати в такий ряд: Ь: > Ь3 > Ь4 > Ь2, а відповідні аніони таким чином: С1- > МСБ- > Бг-. Порівняно з даними, отриманими раніше для комплексів цинку (II) [1], зазначені ряди змінюються: Ь: > Ь3 > Ь2 > Ь4 і: МСБ- > Бг- > С1-. Дія комплексів цинку (II) на а-Ь-рамнозидазу
С. аlЬidus дещо відрізняється від дії комплексів кобальту (II): незважаючи на те, що більшість сполук цинку (II), так само як і кобальту (II), є інгібіторами або діють на рівні контролю, ізотіоціанатні комплекси
ї т 1 І т тт
і
^шштитт
піп іп
Сполуки кобальту
Рис. 8. Вплив сполук кобальту (II, III) на активність а^-рамнозидази Е. erubescens
цинку (II) з Ь1 та Ь3 є активаторами незалежно від часу експозиції.
Щодо дії комплексів кобальту (II) на а-Ь-рамнозидазу Е. егиЬеэсепэ, відповідні ліганди зменшують свою активність у такій послідовності: Ь4 > Ь3 > Ь2 > Ь1, аніони: МСБ- > С1- > Бг-. Ці ряди мають інший вигляд для комплексів цинку (II): Ь4 > Ь1 > Ь3 > Ь2 і: Бг- > С1-> МСБ-. Окрім того, комплекси цинку (II) справляють різноманітну дію на а-Ь-рамнози-дазу Е. егиЬеэсепэ: інгібуючу — на рівні контролю та активуючу, яка суттєво залежить від часу експозиції, зі збільшенням якого всі сполуки цинку (II) виявилися активаторами.
З проведеного порівняння дії досліджених комплексів кобальту (II) та цинку (II) випливає, що присутність кобальту (II) у складі комплексів надає їм властивості інгібіторів, тимчасом як сполуки цинку (II), залежно від умов, виявляють ще й активуючу дію. Здатність морфолін-4-карбодитіоа-тів (14), (15) більшою мірою інгібувати активність а-амілази Б. эиЫШэ 147 та а-Ь-рамнозидази С. alЬiduэ порівняно з комплексом (13) можна пояснити різним станом окис-нення в них кобальту- III і II, відповідно, і свідчить про те, що процес інгібування/активації має окисно-відновний характер.
Таким чином, хлоридні, бромідні та ізо-тіоціанатні комплекси кобальту (II) з N заміщеними тіокарбамоїл-№-пентаметилен-сульфенамідами (1)-(12), а також комплекси кобальту (II, Ш) з похідними морфолін-4-карбодитіової кислоти (13)-(18) було вико-
ристано як модифікатори активності ензимів гідролітичної дії — пептидаз Bacillus thuringiensis ШЪ В-7324, амілаз Bacillus subtilis 147 і Aspergillus flavus var. oryzae, рамнозидаз Eupenicillium erubescens 248 та Cryptococcus albidus. Встановлено, що сполуки кобальту (II, Ш) неоднаково впливають на активність досліджених ензимів, виявляючи як інгібуючу, так і стимулюючу дію. Це дає підстави припустити, що у вияві активності комплексної молекули відіграє роль сумарний ефект від усіх складових комплексів, як лігандів, так і певних аніонів — Cl-, Br- або NCS-. Висока активуюча дія комплексів кобальту (II) з N-заміщеними тіокарбамоїл-№-пентаметиленсульфенамі-дами (1)-(12) на еластазну і фібринолітичну активність пептидаз, порівняно з трис(4-морфолінкарбодитіоато)кобальтом (ІІІ) (14) і продуктами його взаємодії з галогенами (15)-(17), що спричинюють, навпаки, інгібування, найімовірніше, зумовлена наявністю в них слабкого зв’язку S-N, який легко піддається гомолітичному розриву. Досліджуючи вплив комплексів кобальту (II, III) на активність a-L-рамнозидаз Cryptococcus аlbidus та Eupenicillium erubescens, встановили, що більшість сполук інгібують їхню активність, причому інгібуюча дія більшою мірою виявляється щодо ензимного препарату C. аlbidus.
Отже, можна констатувати, що характер впливу комплексів кобальту (II) з N-заміщеними тіокарбамоїл-№-пентаметиленсульфе-намідами, а також комплексів кобальту (II, Ш) з похідними морфолін-4-карбодитіової кислоти змінюється залежно як від штаму-продуцента, так і досліджуваного ензиму. Відмінність у впливі комплексів на різні ензими зумовлена тим, що вони мають різні будову і функціональні групи активного центру, які також є відповідальними за зв’язування з модифікаторами.
Автори висловлюють подяку співробітникам ШВ НАН України, які надали для досліджень штами мікроорганізмів: к. б. н. Курченко І. M., к. б. н. Харкевич О. К., к. б. н. Нагорній С. С., к. б. н. Сафроновій Л. А.
ЛІТЕРАТУРА
1. Варбанец Л. Д., Мацелюх Е. В., Гудзенко Е. В. и др. Координационные соединения цин-ка(П) с N-замещенными тиокарбамоил-N'-пентаметиленсульфенамидами — модификаторы ферментов протеолитического и
гликолитического действия // Укр. біохім. журн. — 2011. — Т. 83, № 3. — С. 25-36.
2. Нідялкова Н. А., Мацелюх О. В., Варбанець Л. Д. Оптимізація середовища для синтезу фібри-нолітичної пептидази Bacillus thuringiensis ШВ В-7324// Біотехнологія. — 2012. — Т. 5, № 4. — С. 74-81.
3. Мацелюх О. В., Нідялкова Н-А., Варбанець Л.Д. Особливості росту і біосинтезу еластази мутантним варіантом Bacillus sp. 27-88ELS+ // Там само. — 2011. — Т. 4, № 3. — С. 43-50.
4. Мацелюх О. В., Нідялкова Н. А., Варбанець Л. Д. Очистка і фізико-хімічні властивості пептидази Bacillus thuringiensis ШВ В-7324 з еластазною і фібринолітичною активністю // Укр. біохім. журн. — 2012. — Т. 84, № б. — C. 25-36.
5. Нідялкова Н. А., Мацелюх О. В., Варбанець Л- Д. Виділення фібринолітичної пептидази Bacillus thuringiensis ШВ В-7324 // Mікробіол. журн. — 2012. — Т. 74, № 5. — С. 10-16.
6. Trombridg G. O., Moon H. D. Purification of human elastase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. — 1972. — V. 141, N 3. — P. 928-931.
7. Masada M. Determination of the thrombolytic activity of Natto extract // Food style. — 2004. — V. 8, N 1. — Р. 92-95.
8. Авдиюк Е. В., Варбанец Л. Д. Очистка, a-амилаз Aspergillus flavus var. oryzae и Bacillus subtilis и их свойства// Біотехнологія. — 2012. — Т. 5, № 5. — С. 91-99.
9. ГОСТ 20264.4-S9. Препараты ферментные. Meтоды определения амилолитической активности // Изд-во стандартов. — 1989. — 17 с.
10. Гудзенко О. В., Борзова Н. В., Варбанець Л. Д. Оптимізація умов культивування продуцентів a-L-рамнозидаз — представників різних таксономічних груп мікроорганізмів // Mікробіол. журн. — 2011. — Т. 73, № 3. — С. 46-53.
11. Гудзенко Е. В., Варбанец Л. Д. Очистка и физико-химические свойства a-L-рамнози-
КООРДИНАЦИОННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ КОБАЛЬТА (II, III) С ПРОИЗВОДНЫМИ ДИТИОКАРБАМОВОЙ КИСЛОТЫ — МОДИФИКАТОРЫ АКТИВНОСТИ ЭНЗИМОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
Л. Д. Варбанец1, Е. В. Мацелюх1,
Н. А. Нидялкова1, Е. В. Авдиюк1,
А. В. Гудзенко1, И. И. Сейфуллина2,
Г. Н. Масановец2, Н. В. Хитрич2
1Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев
2Одесский национальный университет им. И. И. Meчникова
E-mail: [email protected]
Хлоридные, бромидные и изотиоцианат-ные комплексы кобальта (II) с N-замещенными тиокарбамоил-№-пентаметиленсульфенами-дами (1) (12), а также комплексы кобальта (II, Ш) с производными морфолин-4-карбодитио-
дазы Eupenicillium erubescens // Там же. — 2012. — Т. 74, № 2. — С. 14-21.
12. Гудзенко Е. В., Варбанец Л. Д. Очистка и физико-химические свойства a-L-рамнози-дазы Cryptococcus albidus // Там же. — 2012. — Т. 74, № б, — С. 16-23.
13. Davis D. W. Determination of flavonones in citrus fruits // Anal. Chem. — 1947. — V. 19, N 1. — P. 4б-48.
14. Сейфуллина И. И., Хитрич Г. Н., Овчаров В. И., Охтина О. В. Синтез и вулканизационная активность N-замещенных тио-карбамоил-№-пентаметиленсульфенамидов и их бромидных комплексов с кобаль-том(П) и цинком(П) // Вопр. химии и хим. технол. — 2010. — № 3. — С. 111-116.
15. Сейфуллина И. И., Хитрич Г. Н., Вологжанина А. В. Mолeкyлярныe комплексы хлоридов и бромидов кобальта(П) и цинка(П) с пиперидин-1-ил диметилкарбамодитиоа-том (L). Кристаллические структуры L и [ZnLBr2] // Журн. неорг. химии. — 2011. — Т. 56, № 2. — С. 222-227.
16. Хитрич М. В., Сейфулліна І. Й. Синтез та будова трис(дитіокарбаматів) кобальту(ІІІ) // Вісн. Одеськ. нац. ун-ту. Хімія. — 2000. — Т. 5, № 2. — С. 27-32.
17. Хитрич Н. В., Сейфуллина И. И., Старикова З. А Mолeкyлярныe комплексы дитиокар-баматов кобальта(Ш) с иодом // Журн. неорг. химии. — 2002. — Т. 47, № 1. — С. 85-91.
18. Хитрич Н. В., Сейфуллина И. И. Особенности взаимодействия дитиокарбаматов кобальта (III) с хлором и бромом // Коорд. химия. — 2000. — Т. 26, № 11. — С. 848-853.
THE COORDINATION COMPOUNDS OF COBALT (II, III) WITH DITHIOCARBAMIC ACID DERIVATIVES — MODIFICATORS OF HYDROLYTIC ENZYMES ACTIVITY
L. D. Varbanets1, О. V. Matselyukh1,
N. А. Nidyalkova1, Е. V. Аvdiyuk1,
А. V. Gudzenko1,1.1. Seifullina2,
G. N. Маsаnоvets2, N. V. Khitrich2
1Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2Mechnikov Odesa National University
E-mail: [email protected]
Chloride, bromide and isothiocyanate complexes of cobalt(II) with N-substituted thiocar-bamoyl-N' -pentamethylenesulfenamides (1)-(12), and also complexes of cobalt(II, Ш) with derivatives of morpholine-4-carbodithioic acid (13)-(18) have been used as modificators of enzymes of hydrolytic action — Bacillus thurin-
вой кислоты (13)-(18) были использованы как модификаторы активности энзимов гидролитического действия — пептидаз Bacillus thu-ringiensis ШВ В-7324, амилаз Bacillus subtilis 147 и Aspergillus flavus var. oryzae 80428, рам-нозидаз Eupenicillium erubescens 248 и Cryptococcus albidus 1001. Установлено, что соединения кобальта (II, Ш) неодинаково влияют на активность исследуемых энзимов, проявляя как ингибирующее, так и стимулирующее действие. Это дает основание предположить, что проявление активности комплексной молекулой зависит от лиганда и наличия аниона — Cl-, Br- или NCS-. Высокое активирующее действие комплексов кобальта (II) с N-заме-щенными тиокарбамоил-^-пентаметилен-сульфенамидами (1)-(12) на эластазную и фиб-ринолитическую активность пептидаз, по сравнению с трис(4-морфолинкарбодитиоа-том)кобальта (III) (14) и продуктами его взаимодействия с галогенами (15)-(17), которые, наоборот, вызывают ингибирование, вероятнее всего обусловлено наличием в них слабой связи S-N, которая легко поддается гомолити-ческому разрыву. При исследовании влияния комплексов кобальта(П) на активность a-L-рамнозидаз Cryptococcus аlbidus и Eupenicillium erubescens было показано, что большинство соединений ингибируют их активность, причем ингибирующее действие в большей степени проявляется по отношению к энзимному препарату C. аlbidus. Таким образом, можно констатировать, что характер влияния комплексов кобальта (II) с N-замещенными тиокарбамоил-№-пентаметиленсульфенамида-ми, а также комплексов кобальта (II, Ш) с производными морфолин-4-карбодитиовой кислоты изменяется в зависимости как от штамма-продуцента, так и исследуемого энзима. Отличие во влиянии комплексов на разные энзимы обусловлено характеристиками строения и функциональных групп активного центра, которые также являются ответственными за связывание с модификаторами.
giensis ШВ В-7324 peptidases, Bacillus subtilis 147 and Aspergillus flavus var. oryzae 80428 amylases, Eupenicillium erubescens 248 and Cryptococcus albidus 1001 rhamnosidases.
It was shown that cobalt (II, Ш) compounds influence differently on the activity of enzymes tested, exerted both inhibitory and stimulatory action. It gives a possibility to expect that manifestation of activity by complex molecule depends on ligand and anion presence — Cl-, Br-or NCS-. The high activating action of cobalt(II) complexes with N-substituted thiocarbamoyl-N'-pentamethylenesulphenamides (1)-(12) on elastase and fibrinolytic activity of peptidases compared to tris(4-morpholinecarbodithioato)cobalt(III)
(14) and products of its interaction with halogens (15)-(17), causes inhibitory effect that is probably due to presence of a weekly S-N link, which is easy subjected to homolytic breaking. The studies of influences of cobalt(II) complexes on activity of C. аlbidus and E. erubescens a-L-rhamnosidases showed, that majority of compounds inhibits of its activity, at that the most inhibitory effect exerts to C. аlbidus enzyme. To sum up, it is possible to state that character of influence of cobalt(II) complexes with N-substituted thiocarbamoyl-N'-pentamethylenesul-phenamides, and also cobalt(II, Ш) complexes with derivatives of morpholine-4-carbodithioic acid varies depending on both strain-producer and enzyme tested. The difference in complex effects on enzymes tested are due to peculiarities of building and functional groups of their active centers, which are also responsible for binding with modificators.
Key words: complexes of cobalt(II, ffl), dithio-carbamic acid, enzymes with elastase, fibrinolytic, amylase and rhamnosidase activities.
Ключевые слова: комплексы кобальта (II, III), дитиокарбамовая кислота, энзимы с эластаз-ной, фибринолитической, амилазной и рамно-зидазной активностью.
