CC BY
46
УДК 577.15.:577.152.3
Pénicillium sp. — ПРОДУЦЕНТ ПОЗАКЛ1ТИННО'1
a-L-РАМНОЗИДАЗИ
1нститут мiкробiологiï i вiрусологiï iM. Д. К. Заболотного НАН Украши, Кшв
E-mail: [email protected]
Отримано 03.03.2014
Метою роботи було дослщити a-L-рамнозидазу, що г1дрол1тично в1дщеплюе термiнальнi невщновлеш a-1,2-, a-1,3- та a-1,6-зв'язанi залишки L-рамнози, присутнi як у синтетичних, так i в природних глшозидах, ол^о-, полiсахаридах, глiколiпiдах i рiзних глшокон'югатах: похiдних флавоноïдiв (рутин, неогесперидин, гесперидин, нарингш, кверцитрин), сапонiнах, терпенових глшозидах. Щ властивостi ензиму можуть бути використаш для потреб харчово!, фармацевтично1 i хiмiчноï промисловостi: полiпшення якосм напо1в (зменшення гiркоти сокiв, тдсилення аромату вин), у виробництвi харчових добавок, лшарських засобiв, а також рамнози.
Унаслщок скринiнгу, проведеного серед 9 штамiв мiкромiцетiв, здатнiсть синтезувати a-L-рам-нозидазу виявлено лише у Penicillium sp. 2918. 1з супернатанта культурально! рiдини цього мшро-мщета осадженням сульфатом амонiю (90% насичення) одержано комплексний ензимний продукт та вивчено деяк його фiзико-хiмiчнi властивосм, такi як рН- i термооптимум, рН- i термоста-бiльнiсть, а також субстратну специфiчнiсть. Встановлено, що цей продукт мае рН-оптимум 6,0, а термооптимум — 60 °С. Препарат Penicillium sp. 2918 поряд з a-L-рамнозидазною виявляе також ß-D-глюкозидазну, ß-D-галактозидазну та ß-D-глюкозамiнiдазну активнiсть.
Ключовi слова: Penicillium sp. 2918, a-L-рамнозидаза, мшромщети, ензимний комплекс, субстратна специфiчнiсть.
0. В. Гудзенко Л. Д. Варбанець
1. М. Курченко Л. Т. Наконечна
У сучасних промислових технолопчних процесах дедал1 51льшого значення набува-ють г1дрол1тичн1 ензими, як1 в багатьох ви-робництвах замшили процес кислотного гщ-рол1зу. ïхня висока специф1чн1сть дае змогу одержувати готов1 продукти з м1н1мальною к1льк1стю сторонн1х речовин. Найб1льш перспективними для широкого використан-ня виявились г1дрол1тичш ензими, продуцентами яких е мшрооргашзми, передуйм завдяки необмежен1й доступност вих1дно'1 сировини та можливостям, що !х вщкрива-ють в1дб1р i штучний мутагенез для спрямо-ваного синтезу. Уншальна специф1чн1сть д11 та висока катал1тична активн1сть, а також широка доступшсть 1ндив1дуальних ензим1в зумовили широке використання !х у науко-вих досл1дженнях з молекулярно! бюлогп i генетики, а також для вир1шення деяких практичних завдань медицини, харчово!, мшробюлопчно! промисловост1, контролю навколишнього середовища. Серед глшози-даз важливе м1сце посщае a-L-рамнозидаза [КФ 3.2.1.40], яка г1дрол1тично в1дщеплюе терм1нальн1 a-1,2-, a-1,4- та a-1,6-зв'язанi
залишки L-рамнози, що присутш як у синтетичних, так i в природних глшозидах, ол1го-, пол1сахаридах, гл1кол1п1дах i р1зних глшо-кон'югатах: пох1дних флавоно!д1в (рутин, неогесперидин, гесперидин, наринг1н, кверцитрин), сапоншах, терпенових гл1козидах. Лише у кверцитрин L-рамноза безпосеред-ньо зв'язана з аглшоновою частиною, тим-часом як ус1 1нш1 субстрати — це глшозиди, в яких L-рамноза зв'язана з ß-D-глюкотра-нозильною одиницею за допомогою р1зних титв гл1козидних зв'язк1в.
Зазначен1 властивост1 дають змогу засто-совувати a-L-рамнозидази в р1зних галузях промисловост1: харчов1й, фармацевтичнш i х1м1чн1й. Головне використання ïï у харчо-в1й промисловост1 спрямоване на полшшен-ня якост1 напо!в (зменшення г1ркоти, п1дси-лення аромату вин) та виробництво харчових добавок. Бютехнолопчш п1дходи до зменшення пркоти цитрусових сок1в базуються на здатност цього ензиму г1дрол1зувати нарингш i лимон1н.
В останнi роки a-L-рамнозидаза привер-тае особливу увагу дослщнишв, якi на основ!
глiкозидiв рослинного походження створю-ють засоби для лiкування серцево-судинних захворювань, а також препарати i3 проти-вiрусною та iмунотропною дieю. Для вияву бiологiчноi дп деяких i3 цих препаратiв не-обхщна наявнiсть рамнози, iнших — ii вщ-щеплення. Використання a-L-рамнозидаз у хiмiчнiй промисловостi пов'язано 3i зде-шевленням виробництва рамнози [1].
Однак б^ьш^ть вiдомих на сьогодш a-L-рамнозидаз мшробного походження характеризуються низкою недолив [2], тому пошук нових, ефективних синтетишв a-L-рамнозидаз залишаеться актуальним питанням, враховуючи те, що в Украш1 iхнi продуценти взагалi вiдсутнi, а висока вартасть комерцiйних ензимних препаратав iноземного виробництва суттево гальмуе 'х застосування в промислових технологiях на-шо! краши.
З огляду на вищезазначене метою роботи був пошук ефективного продуцента a-L-рам-нозидази, а також дослщження деяких фiзи-ко-хiмiчних властивостей i субстратноi спе-цифiчностi одержаного ензиму.
Матерiали i методи
Об'ектами дослiджень слугували 9 шта-мiв мiкромiцетiв: Trichoderma harzianum
2915, Trichoderma sp. 344, Trichoderma viride 906, Trichoderma viride 2917, Trichoderma pseudokoningii 2928, Trichoderma virens
2916, Penicillium raciborskii 16896=0096, Aspergillus rhizopodus 16870=0152, Penicillium sp. 2918. Мшромщети вирощу-вали у пробiрках зi скошеним середовищем сусло-агару протягом 14 дiб за температу-ри 25 °С, а потiм пересiвали у колби Ерлен-мейера (750 мл), ям мiстили 100 мл рщко-го середовища Чапека такого складу, г/л: рамноза — 4; NaNO3 — 2,0; KH2PO4 — 1,0; MgSO4 • 7Н2О — 0,5; KCl — 0,5; FeSO4 • 7Н2О — 0,015; рН 5,0. Вирощування проводили за наявностi качалок при 220 об/хв за темпера-тури 25 °С упродовж 5 дiб.
Зразок a-L-рамнозидази одержували iз супернатанта культуральноi рiдини Penicillium sp. 2918 тсля вiдокремлення бюмаси фiльтруванням через 4 шари марл^ а також осадженням сульфатом амошю до 90% на-сичення. Сумш витримували 12-16 год за температури 4 °С i центрифугували (5 000 g) протягом 30 хв. Осад збирали, розчиняли у трикратному об'емi 3 М сульфату амонiю, для збер^ання додавали 0,01 М азиду натрт.
З метою визначення активност глшози-даз до 0,1 мл розчину ензиму додавали 0,2 мл
0,1 М фосфатно-цитратного буферу (ФЦБ), рН 5,2, та 0,1 мл 0,01 М розчину субстрату в цьому буферь Реакцшну сумш шкубували упродовж 10 хв за температури 37 °С. Реак-щю зупиняли додаванням 2 мл 1 М розчину бшарбонату натрт. До контролю вносили т1 самi компоненти, але у зворотному порядку. Шльшсть п-штрофенолу, який було вщще-плено в результата гiдролiзу, встановлювали колориметричним методом на спектрофото-метрi СФ-26 за поглинанням при 400 нм [3]. За одиницю активностi ензиму приймали таку його шльшсть, яка гiдролiзуе 1 мкмоль субстрату за 1 хв в умовах дослщу.
Глшозидазну активнiсть визначали, використовуючи вщповщш синтетичнi суб-страти: n-нiтрофенiл-а-L-рамнопiранозид, п-штрофешл-а- та ß-D-глюкопiранозид; п-штрофешл-а- i ß-D-галактотранозид; п-ттрофешл-а- та ß-D-ксилопiранозид; п-нь трофешл-а^-манотранозид; п-штрофешл-a-D-фукотранозид; п-штрофешл^^-глю-козамiнiд (Sigma-Aldrich, США).
У разi визначення a-L-рамнозидазноi ак-тивностi iз застосуванням природного субстрату нарингшу послуговувались методом Davis [4].
Вм^т протеiну на вйх етапах дослщжен-ня реестрували на спектрофотометрi СФ-26 при 280 нм, його шльшсть встановлювали за методом Lowry et al. [5]. 1нтенсившсть забарвлення проб вимiрювали за довжини хвилi 750 нм. Як стандарт використовували бичачий сироватковий альбумш.
Дослщження впливу температури та рН середовища здшснювали в iнтервалi температур вщ 4 до 90 °С та рН вiд 2,0 до 10,0, останнш створювали 0,01М унiверсальним фосфатним буфером (УФБ).
Термостаб^ьшсть ензиму визначали при температурi 37 °С (час експозицп 90 хв), рН-стаб^ьшсть — за показникiв рН середовища 4,0; 5,0; 6,0 та 7,0 (час експозицп 30 хв). Шсля вичерпання часу дп на ензим вщповщного чинника вщбирали алiквоти по 0,1 мл i оцiнювали активнiсть, як описано вище.
Уй дослiди виконували у 5-8 повторах. Статистичну обробку результайв проводили методами варiацiйноi та кореляцiйноi статистики з використанням i-критер^ Стьюдента [6]. Вираховували середш зна-чення величин i стандартнi похибки (М ± m). Значення за Р < 0,05 розглядали як до-стовiрнi. Результати, що поданi графiчно, обробляли за допомогою програми Microsoft Excel 2003.
Результати та обговорення
Вщомо, що a-L-рамнозидазу здатнi син-тезувати мшрооргашзми рiзних таксоно-мiчних груп, передуйм мiкромiцети, серед яких видьлено найбiльшу кiлькiсть проду-центiв глшозидаз [7, 8]. На сьогоднi в про-мисловостi використовують ензимнi пре-парати Penicillium decumbens i Aspergillus niger, ям синтезують вiдповiдно нарингша-зу i гесперидиназу (Sigma-Aldrich, США). Бактерiальнi продуценти a-L-рамнозидаз виявлено серед Bacteroides, Fusobacterium K-60, Sphingomonas paucinmobilis, Bacillus sp., Clostridium stercorarium [9-11]. Що стосуеться дрiжджiв, то низьк рiвнi a-L-рамнозидазноï активностi було зафш-совано у Saccharomyces cerevisiae Tokaj 7, Hansenula anomala, Debaryomyces pоly-morphus, Aureobasidium pullulans, Candida guillermondii i Pichia angusta X349 [12, 13]. Але осшльки вй дрiжджi синтезують вну-трiшньоклiтиннi a-L-рамнозидази, це ^тот-но ускладнюе процеси вид^ення та очищен-ня ензимiв.
Скринiнг продуцентiв a-L-рамнозидази здiйснювали серед 9 штамiв мiкромiцетiв на середовишД, яке мiстило потенцiйний iндуктор ензиму — L-рамнозу. Встановле-но, що в супернатант культурально! рщи-ни Penicillium sp. 2918 (таблиця) виявлено a-L-рамнозидазну актившсть, яка становила 0,3 од/мг протешу.
Для одержання частково очищеного ензи-му проводили осадження супернатанта куль-турально! рщини Penicillium sp. сульфатом амошю (90% насичення). Дослщження фiзи-ко-хiмiчних властивостей (рис. 1) показало, що рН оптимум ензиму становить 6,0, хоча за рН 4,0 та 5,0 a-L-рамнозидаза Penicillium sp. зберпала 80%, а при рН 7,0 та 8,0 — 55% вщ початково! активност ензиму. Однак за значень рН 9,0 i 3,0 актившсть ензиму зни-жувалась до 22-35% вщ вихщно!.
Результати узгоджуються з даними л^е-ратури, згщно з якими показники рН-опти-MyMiB грибних глшозидаз лежать в штер-валi рН 4,0-6,0. Так, для a-L-рамнозидази A. nidulans оптимальними значеннями рН були 4,5-6,0, а для ензиму A. terreus — 5,5, тимчасом як a-L-рамнозидаза A. flavus вияв-ляла оптимальну актившсть за рН 6,5 [14].
Важливими характеристиками ензим-них препаратав, суттевими для практичного використання, е стаб^ьшсть за певних значень рН i температури. Встановлено, що доотджуваний ензим a-L-рамнозидази Penicillium sp. 2918 був стаб^ьним у дiапа-зош рН вщ 4,0 до 6,0 впродовж 30 хв (рис. 2). У разi значення рН 7,0 актившсть ензиму дещо зменшувалась i становила до 80% вщ вихщно!. За оптимального значення рН 6,0 та температури 20 °С дослщжувана a-L-рам-нозидаза була стаб^ьна протягом двох дiб.
За даними лггератури [1], a-L-рамнозида-за з A. niger стшка в iнтервалi рН 3,0-5,0. Ензим A. terreus збер^ав понад 95% активност за рН 4,0-6,5, тодi як за рН > 6,5 актившсть a-L-рамнозидази прогресивно знижувалась, а при рН 8,5 становила лише 10% вщ максимально'! [15]. a-L-рамнозидаза A. aculeatus стабильна за рН 3,0-5,0 [16], а A. nidulans — 4,5 [17]. Ензим, видьлений iз P. paucimobilis [14], був стабьльним за рН 5,5-9,0.
Вщомо, що температурний оптимум б!ль-шост a-L-рамнозидаз становить 40-80 °С, винятком е бактерiальна a-L-рамнозидаза Pseudoalteromonas sp., яка виявляла актившсть при 4 °С [18]. Температурний оптимум для очищено'! a-L-рамнозидази A. kawachii становив 60 °С, за таких умов ензим збер^ав 80% вщ максимально! активност протягом 1 год [19].
Стосовно доойджувано! a-L-рамнози-дази Penicillium sp. 2918: !! температурний оптимум спостершався при 60 °С (рис. 3), а за 30 °С та 80 °С вона збер^ала 30% ензимно! активноста вiд максимально! упродовж 3 год.
Скриншг продуцентiв a-L-рамнозидази
Р1д м1кроорган1зм1в Актившсть, од/мг Джерело видшення
Trichoderma harzianum 2915 0 Грунт 2011 р., Кшвська область
Trichoderma sp. 344 0 Грунт зони ввдчуження 30 км, Чорнобиль
Trichoderma viride 906 0 Л^овий ^рунт, Кшвська область
Trichoderma viride 2917 0 Шдлога квартири, м. Кшв
Trichoderma pseudokoningii 2928 0 Грунт зони ввдчуження 30 км, Чорнобиль
Trichoderma virens 2916 0 Грунт дубових посадок, Кшвська область
Penicillium raciborskii 16896=0096 0 Грунт 1999 р., Кшвська область
Aspergillus rhizopodus 16870=0152 0 Деревина верби, Кшвська область
Penicillium sp. 2918 0,3±0,015 Пов^ря, м. Кшв
рН
Рис. 1. рН-оптимум a-L-рамнозидази Penicillium sp. 2918
LI 2« 25 30
Час, хв
Рис. 2. рН- стабшьшсть (4—7) a-L-рамнозидази Penicillium sp. 2918
Температура, °С Рис. 3. Термооптимум a-L-рамнозидази Penicillium sp. 2918
Рис. 4. Термостабшьшсть препарату a-L-рамнозидази Penicillium sp. 2918
при 37 °С (* — P < 0,05)
о,s
•й ^ il.:
I
h
s
1 я
S '■"
M " !
Я
S .,.„:
Lu
Субстрати
Рис. 5. Субстратна специфiчнiсть препарату a-L-рамнозидази Penicillium sp. 2918:
1 — n-нiтрофенiл-a-L-рамнопiранозид;
2 — n-нiтрофенiл-a-D-глюкопiранози;
3 — п-нггрофенш-Р^-глюкошранозид;
4 — n-нiтрофенiл-a-D-галактопiранозид;
5 — п-штрофенш-Р^-галактошранозид;
6 — n-нiтрофенiл-a-D-ксилопiранозид;
7 — п-штрофенш-Р^-ксилошранозид;
8 — n-нiтрофенiл-a-D-манопiранозид;
9 — n-нiтрофенiл-a-a-D-фукопiранозид;
10 — п-нггрофешл-Р^-глюкозамшщ;
11 — нарингiн
Досл1дження термостаб1льност1 ензиму Penicillium sp. 2918 показало (рис. 4), що при 37 °С та рН в1д 4,0 до 7,0 вш е стаб1льним про-тягом 90 хв. За -18 °С ензим не втрачав актив-ност1 впродовж к1лькох м1сящв. Аналопчш дан1 було отримано дослщниками для a-L-рам-нозидази P. paucimobilis [14], яка тсля заморо-жування також не втрачала активност1.
Вивчення субстратно! специф1чност1 ензиму Penicillium sp. 2918 (рис. 5) показало, що вш г1дрол1зуе так1 синтетичн субстрати, як n-нiтрофенiл-a-L-рамнопiранозид, п-штрофешл-Р^-глюкотранозид, п-штро-фенiл-Р-D-галактопiранозид та п-штрофе-шл-Р^-глюкозамшщ.
Подiбну широку субстратну специфiч-шсть виявлено також у супернатантi культу-рально! рiдини ранiше вивченого нами про-
дуцента Eupenicillium erubescens [20], який окрiм n-нiтрофенiл-a-L-рамнопiранозиду гiдролiзував n-нiтрофенiл-Р-N-ацетилгалак-тозамiнiд, п-штрофешл-Р^-ацетил-глюко-замiнiд i п-штрофешл-Р^-глюкотранозид.
Однак на вiдмiну вiд a-L-рамнозидази E. erubescens [21], доойджуваний ензим Penicillium sp. 2918 найбьльшу активтсть виявляв стосовно природного субстрату — нарингшу.
Monti D. зi ствавт. [21] показали, що a-L-рамнозидази, iзольованi з рiзних видiв гри-бiв, виявляють рiзну специфiчнiсть щодо таких L-рамнозовмiсних природних гль козидiв, як рутин, гесперидин, нарингiн, кверцитрин, гшзенозид та азiатикозид. Так, препарати a-L-рамнозидаз, одержаних ie представникiв б^ьшост видiв дослiджених
грибiв, були не здатш гiдролiзувати кверци-трин, тимчасом як ензим з A. aculeatus, який характеризувався широкою субстратною специфiчнiстю щодо рiзних субстратiв, був ефективним також i стосовно кверцитрину.
Вивчення субстратно! специфiчностi a-L-рамнозидаз Penicillium commune показало, що ензим 1 мае широку субстрат-ну специфiчнiсть i здатен вщщеплювати ß-D-глюкозу, ß-D-ксилозу, a-D-манозу, a-D-галактозу, N-ацетил-ß-D-глюкозамiн вiд вiдповiдних n-штрофешльних субстра-тiв, тодi як a-L-рамнозидаза 2 характеризу-валась вузькою субстратною специфiчнiстю, гiдролiзуючи тiльки n-нiтрофенiл-a-L-рам-нотранозид. Обидва ензими виявляли ви-соку спорщнешсть до природних субстратiв: нарингшу i неогесперидину [22]. Так, Кт становила 1,7 та 1,6 мМ для рамнозидази 1 та 1,32 i 1,95 мМ — для рамнозидази 2, вщ-
повiдно для нарингшу та неогесперидину. Проте a-L-рамнозидази 1 i 2 виявляли меншу спорщнешсть до n-нiтрофенiл-a-L-рамнопi-ранозиду порiвняно з ензимом E. erubescens: значення Кт 2,97, 2,81 i 1,0 мМ вщповщно.
Таким чином, за результатами скриншгу серед 9 штамiв мiкромiцетiв вiдiбрано лише один штам — Penicillium sp. 2918, який ви-явився продуцентом a-L-рамнозидази. Показано, що ензим Penicillium sp. е стабьль-ним i мае рН-оптимум 6,0, а термооптимум 60 °С. Препарату Penicillium sp. 2918 поряд з a-L-рамнозидазною (нарингшазною) при-таманна ß-D-глюкозидазна, ß-D-галактози-дазна та ß-D-глюкозамiнiдазна активнiсть. Отже, цей продуцент a-L-рамнозидази може бути використаний для подальших досль джень з метою його застосування в рiзних бютехнолопчних процесах.
REFERENCES
1. Gudzenko O. V., Varbanets L. D. Mikrobial a-L-rhamnosidases: producers, properties, practical use. Biotechnologiya. 2012, 5(6), 9-26. (In Ukrainian).
2. Yadav V., Yadav P. K, Yadav S, Yadav K. D. S. a-L-Rhamnosidase: A review. Process Biochemistry. 2010, 45(8), 1226-1235.
3. Romero C., Manjon A., Bastida J. A method for assaying rhamnosidase activity of naringinase. Anal. Biochem. 1985, 149(2), 566-571.
4. Davis D. W. Determination of flavonones in citrus juice. Anal. Biochem. 1947, 19(1), 46-48.
5. Lowry O. H, Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193(1), 265-275.
6. Lakin G. F. Biometrics. Moscow: Vysshaya shkola. 1990, 325 p. (In Russian).
7. Yadav S., Yadav R. S. S., Yadav K. D. S. a-L-Rhamnosidae from Aspergillus awamori MTCC-2879 and its role in debittering of orange juice. Int. J. Food Sci. Technol. 2013, 48(5), 927-923.
8. Yadav V., Yadav K. D. S. New fungal for a-L-rhamnosidase an important enzyme used in the synthesis of drugs and drug precursors. Appl. Biochem. Microbiol. 2010, 48(3), 295-301.
9. Jang I. S., Kim D. H. Purification and characterization of alpha-L-rhamnosidase from Bacteroides JY-6, a human intestinal bacterium. Biol. Pharmaceut. Bul. 1996, 19(1), 1546-1549.
10. Park S., Kim J., Kim D. Purification and characterization of quercitrin-hydrolyzing alpha-L-rhamnosidase from Fusobacterium K-60, a human intestinal bacterium. J. Microbiol. Biotechnol. 2005, 15(3), 519-524.
11. Hashimoto W., Murata K. a-L-Rhamnosidase of Sphingomonas sp. R1 producing an unusual exopolysaccharide of sphingan. Biosc. Biotechnol. Biochem. 1998, 62(6), 1068-1074.
12. Rodrguez M. E., Lopes C. A., Broock M. Screening and typing of Patagonian wine yeasts for glycosidase activities. J. Appl. Microbiol. 2004, 96(1), 84-95.
13. Yanai T., Sato M. Purification and Characterization of a-L-Rhamnosidase from Pichia angusta X349. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000, 64(10), 2179-2185.
14. Varbanets L. D., Borzova N. V. Glycosydases of microorganisms and methods of their investigations. Kyiv: Naukova dumka. 2010. 437 p. (In Ukrainian).
15. Gerstorfenova D., Fliedrova B., Halada P., Marhola P., K ena V., Weignerov La. Recombinant a-L-rhamnosidase from Aspergillus terreus in selective trimming of rutin. Proc. Biochem. 2012, 47(5), 828-835.
16. Manzanares P., Orejas M., Gil J. V. Construction of a Genetically Modified Wine Yasts Strain Expressing the Aspergillus aculeatus rhaA Gene, Encoding and a-L-Rhamnosidase of Enological Interest. Appl. Envir. Microbiol. 2003, 69(12), 7558-7562.
17. Tamayo-Ramos J., Flipphi M., Pardo E. L-Rhamnose induction of Aspergillus nidulans a-L-rhamnosidase genes is glucose repressed via a CreA-independent mechanism acting at the level of inducer uptake. Microb. Cell Fact. 2012, V. 11, P. 11-26.
18. Orrillo A. G., Ledesma P., Delgado O. D. Cold-active a-L-rhamnosidase from psychro-tolerant bacteria isolated from a sub-
Antarctic ecosysteme. Enz. Microb. Technol. 2007, 40(2), 236-241.
19. Koseki T., Mese Y., Nishibori N. Characterization of an a-L-rhamnosidase from Aspergillus kawachii and its gene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, 80(6), 1007-1013.
20. Gudzenko E. V., Varbanets L. D. Purification and physico-chemical properties of Eupeni-cillium erubescens a-L-rhamnosidase. Mikro-biol. zh. 2012, 74(2), 14-21. (In Russian).
Penicillium sp. — ПРОДУЦЕНТ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ a-L-РАМНОЗИДАЗЫ
Е. В. Гудзенко Л. Д. Варбанец И. Н. Курченко Л. Т. Наконечная
Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Целью роботы было исследовать a-L-рам-нозидазу, которая гидролитически отщепляет концевые невосстановленные a-1,2-, a-1,4- и a-1,6-связанные остатки L-рамнозы, которые присутствуют как в синтетических, так и в природных гликозидах, олиго-, полисахаридах и различных гликоконъюгатах: производных флавоноидов (рутин, неогесперидин, геспе-ридин, нарингин, кверцитрин), сапонинах, терпеновых гликозидах. Эти свойства энзима могут быть использованы для нужд пищевой, фармацевтической и химической промышленности: улучшения качества напитков (уменьшения горечи соков, усиления аромата вин), в производстве пищевых добавок, лекарственных препаратов, а также рамнозы.
В результате скрининга, проведенного среди 9 штаммов микромицетов, способность синтезировать a-L-рамнозидазу выявлена только у Penicillium sp. 2918. Из супер-натанта культуральной жидкости этого микромицета осаждением сульфатом аммония (90% насыщения) получен комплексный энзимный продукт и изучены его некоторые физико-химические свойства, такие как рН- и термооптимум, рН- и термостабильность, а также субстратная специфичность. Установлено, что этот продукт имеет оптимум рН 6,0, а термооптимум — 60 °С. Препарат Penicillium sp. 2918 наряду с a-L-рамнозидазной проявляет также Р^-глюкозидазную, Р^-галактозидазную и Р^-глюкозаминидазную активность.
Ключевые слова: Penicillium sp. 2918, a-L-рамнозидаза, микромицеты, энзимный комплекс, субстратная специфичность.
21. Monti D., Pisvejcova A., Kren V. Generation of an a-L-rhamnosidase library and its application for the selective derhamnosylation of natural products. Biotechnol. Bioengin. 2004, 87(6), 763-771.
22. Varbanets L. D., Gudzenko E. V. a-L-Rhamnosi-dase microorganisms. Abstracts of the I All-Russian Conference «Fundamental glycobiology», Kazan, 20-24 June 2012. (In Russian).
Penicillium sp. — PRODUCER OF EXTRACELLULAR a-L-RHAMNOSIDASE
E. V. Gudzenko L. D. Varbanets I. M. Kurchenko L. T. Naconechnaya
Institute of Microbiology and Virology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
The purpose of this work was to investigate a-L-rhamnosidase that hydrolytically cleaves the terminal unreduced a-1,2-, a-1,4- and a-1,6-linked rhamnose residues in both synthetic and natural glycosides, oligo-, and polysaccharides, various glycoconjugates: flavonoid derivatives such es rutin, neohesperidin, hesperidin, naringin, quercitrin, saponins, terpene glycosides. These properties of the enzyme could be used for the needs of food industry, pharmaceutical and chemical industry: to improve the quality of beverages (reduction of bitterness, flavor enhancing wines), for production of food additives, medicine preparations and rhamnose.
As a result of screening conducted among 9 strains of micromycetes, ability to synthesize a-L-rhamnosidase was revealed only in Penicillium sp. 2918. Complex enzyme preparation was obtained from culture supernatant of this micromycete by fractionation with ammonium sulfate (90% saturation) and its physico-chemical properties such as pH- and thermooptimum, pH- and thermal stability and substrate specificity were studied as well. It is shown that enzyme has pH optimum is about 6.0 and thermooptimum is about 60 °C. Preparation of Penicillium sp. 2918 with a-L-rhamnosidase reveals P-D-glucosidase, P-D-galactosidase and P-D-glucosaminidase activity.
Key words: Penicillium sp. 2918, a-L-rhamnosi-dase, micromycetes, physical and chemical properties, substrate specificity.
