CC BY
41
УДК: 577.152.32
МІКРОБНІ а-ГЛЮКОЗИДАЗИ: КЛАСИФІКАЦІЯ, СУБСТРАТНА СПЕЦИФІЧНІСТЬ ТА МЕХАНІЗМ ДІЇ
Н. В. БОРЗОВА
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ
E-mail: nv_borzova@bigmir.net
В огляді наведено дані літератури щодо систематичного положення мікробних а-глюкозидаз у сучасній номенклатурі ензимів, яка ґрунтується на їхній субстратній специфічності та молекулярній будові. Подано відомості стосовно розповсюдженості цих ензимів серед мікроорганізмів, у тому числі екстре-мофільних, їхніх фізико-хімічних і каталітичних властивостей, а також субстратної специфічності та механізму дії.
Ключові слова: а-глюкозидаза, класифікація, властивості, специфічність, механізм дії.
а-Глюкозидази (ЕС 3.2.1.20, а-О-глюко-зид-глюкогідролази) — карбогідрази екзо-типу, які вивільняють а-глюкозу з невіднов-лювального кінця ланцюга субстрату. а-Глюкозидази поширені серед мікроорганізмів, рослин та в тканинах тварин. Субстратна специфічність цих ензимів надзвичайно різноманітна. Багато а-глюкозидаз здатні гідролізувати не тільки синтетичні а-глюкозиди та олігосахариди, які містять а-глюкозидні зв’язки, але й а-глюкани, такі як розчинний крохмаль і глікоген. а-Глюко-зидази часто називають трансглюкозидаза-ми через їхню здатність (зокрема частини з них) каталізувати як гідроліз, так і транс-глюкозилювання. Ці реакції можна зобразити за такою схемою:
де G, R і Н-О-А — глюкозильний залишок, аглікон і акцептор відповідно. Як гідроліз, так і трансглікозилювання з формального погляду — це обмінні реакції між глюко-зильними залишками і протонами води або акцептора. У цих реакціях глюкоза вивільнюється як а-аномер, і конфігурація ано-мерного центру субстрату (С,) зберігається в продукті трансглюкозилювання. У цьому відмінність а-глюкозидаз від глюкоамілаз, які каталізують гідроліз тих самих субстратів — в останньому випадку продуктом реакції є в-глюкоза, тобто відбувається обер-
тання конфігурації при С у залишку глюкози, який відщеплюється. Крім того, глюко-амілази не каталізують реакцію трансгліко-зилювання. Chiba [1] запропонував розділити а-глюкозидази на три групи залежно від типу субстрату. Перша група — це типові а-глюкозидази, що гідролізують такі субстрати, як феніл-а-глюкозид або сахарозу, швидше, ніж мальтозу. Друга група — це так звані «мальтази», які швидко гідролізують мальтоолігосахариди, але не активні щодо синтетичних а-глюкозидів та сахарози. До третьої групи увійшли ензими, що мають як мальтазну, так і а-глюканазну активність.
За сучасною класифікацією а-глюкози-дази потрапляють у дві родини — 13 і 31 [2]. Оліго-1,6-глюкозидази (ЕС 3.2.1.10) і саха-розо-а-глюкозидази (ЕС 3.2.1.48), хоча їх і не віднесено до однієї з 81 родин, також входять до категорії а-глюкозидаз. Цикло-декстрин-глюканотрансферази (ЕС 2.4.1.19) належать до родини 13.
Нещодавно Chiba [3] запропонував дещо іншу класифікацію а-глюкозидаз, яка також ґрунтується на виявленні гомологічних ділянок в амінокислотних послідовностях цих ензимів. Він виявив чотири консервативні ділянки в амінокислотних послідовностях а-глюкозидаз дріжджів, бацил, комах (табл. 1). Ці ж чотири консервативні ділянки виявлено в декстранглюкозидазі зі Streptococcus mutants, а-амілазах (ЕС 3.2.1.70) і трегалозо-6-фосфатгідролазі (ЕС
Таблиця 1. Консервативні блоки в амінокислотних послідовностях а-глюкозидаз [4]
Ензим Регіон
1 2 3 4 5
Родина 1
Saccharomyces cerevisae Ar 106-DLWNH 210-GFRIDTAGL 276-EVAH 344-Y1ENHD
Bacillus sp. (SAM1606) Ar 113-DLWNH 210-GFRMDVINA 71-ETGG 340-YWTNHD
Candida albicans Ar 98-DLWNH 202-GFRIDTAGM 263-EVGH 333-FIENHD
Pediococcus pentosaceus Ar 100-DLWNH 197-GFRMDVINQ 256-ETHG 327-FWNNHD
Thermus caldophilus AT 96-DLWNH 194-GFRVDVLWL 245-EMRQ 322-VLGNHD
Streptococcus mutans flr 98-DLWNH 190-GFRMDVIDM 236-ETWG 308-FWNNHD
Escherichia coli TOr 100-DLWNH 196-GLRLDWNL 25I-EMSS 320-FWCNHD
Bacillus subtilis TOr 101-DLWNH 198-GFRLDVINL 253-EMSS 324-FWCNHD
Васіllus thermoglucosidasius Or 98-DLWNH 195-GFRMDVINM 256-ETPG 325-YLNNHD
Bacillis coagulans Or 97-DLWNH 195-GWRMDVIGS 255-EAIG 327-YFENHD
Bacillis cereus Or 98-DLWNH 195-GFRMDVINF 255-EMPG 324-YWNNHD
Bacillus sp. Or 97-DLWNH 194-GWRMDVIGS 254-EAGG 326-YFENHD
Родина 2
Aspergillus niger AT 220-GWVYD.MSEV 255-EPGD 316-YVINHD 421-GADTCGF
Aspergillus oryzae АГ 488-GVWYDMAEV 523-EPGN 583-WINHV 687-GVDTCGF
Emericella nidulans АГ 496-GVWYDMSEV 531-EPGN 593-YVINHV 697-GVDTCGF
Mucor javanlcus АГ 426-GLWIDMNEP 594-GAD1CGF
Schvanniomyces occidentalis АГ 466-GIWADMNEV 665-GADVCGF
а-Глюкозидази, які не мають консервативних блоків
Sulfolobus solfataricus АГ
Thermotoga maritima АГ
Примітки: АГ — а-глюкозидаза; ДГ — декстранглюкозидаза; ТФГ — трегалоза-6-фосфатгідролаза (а,а-фос-фотрегалаза); ОГ — оліго-1,6-глюкозидаза. Жирним шрифтом виділено основні консервативні амінокислоти.
3.2.1.93) з Escherichia coli. Обидва останні ензими каталізують гідроліз синтетичного субстрату п-нітрофеніл-а^-глюкозиду. За класифікацією Chiba [1] ці ензими належать до родини І. У а-глюкозидаз із тканин ссавців, рослин, Candida tsukubaensis і Mucor javanicus відсутні ділянки 1, 3 і 4, а в а-глю-козидаз з Aspergillus niger і A. oryzae — ділянка 1, водночас для цих ензимів характерна поява п’ятої консервативної ділянки. Ці ензими входять до родини II.
На сьогодні встановлено структуру глю-козидази екзотипу — оліго-1,6-а-глюкози-дази з B. cereus [5]. Ензим складається з трьох доменів — N-кінцевого (амінокислоти): 1 — 104 та 175 — 480), що має структуру (ß/a)8-барелу з додатковими а-спіралями, субдомену (АК: 105 — 174), в який входить а-спіраль, тринитковий антипаралельний ß-лист і довгі петлі, та С-кінцевого домену (АК: 481-558) у вигляді ß-барелу з восьми анти-паралельних ß-ниток. Три каталітичні за-
лишки — Авр199, Glu255, Авр329 — розташовані в глибокій щілині, яка утворена субдоменом та кластером спіралей (Р/а)д-баре-лу. Також було показано, що для бацилярної екзо-а-1,4-глюкозидази характерна така сама вторинна структура N термінальної ділянки [(а/Р)§-барел], як і для бацилярної оліго-а-1,6-глюкозидази [6]. В останні роки одержано попередні результати щодо структури 6-фосфо-а-глюкозида-зи із B.subtШs [7]. Цей ензим залучається в катаболізм а-глюкозидів, що утворюються через фосфоенолпіруватзалежну мальтозну трансферазну систему у B. subtШs.
Встановлено, що більшість глюкозидаз є глікозильованими протеїнами. З’ясовано, що не тільки присутність вуглеводів, але й наявність у певному положенні а-спіралі або а-нитки амінокислоти проліну є основними факторами забезпечення високої термостабільності глюкозидаз [5, 8]. Методом спрямованого сайт-мутагенезу на прикладі
а-глюкозидаз Saccharomyces cerevisiae виявлено, що Val216 є важливим залишком, який визначає специфічність цих ензимів щодо типу зв’язку (а-1,4 або а-1,6) [9]. Для ензиму з Geobacillus sp. було показано, що Asp98 разом з Asp199, Asp326 та Glu256 є необхідними для вияву ензимної активності [10].
Властивості мікробних а-глюкозидаз
На сьогодні а-глюкозидази різної специфічності знайдено у багатьох мікроорганізмів. Більшість із них одержано в гомогенному стані (табл. 2), детально вивчено їхні властивості. Однак в останні роки дедалі більшу увагу приділяють дослідженню властивостей а-глюкозидаз із архебактерій — гіпертермофілів — Pyrococcus furiosus, Thermococcus sp., Termotoga maritima, які виявляють свою активність при температурі понад 100 0С.
Екстрацелюлярну а-глюкозидазу було отримано з термофільної архебактерії Thermococcus sp. [11]. Ензим має мономерну структуру з молекулярною масою 60 кДа, рН 5,0. При 98 0С ензим втрачає половину активності за 35 хв, однак цей час зростає до
215 хв за присутності 1% дитіотреїтолу та 1% бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Застосування різних методів, включаючи іммобілізацію, хімічну модифікацію і додавання стабілізуючих сполук (БСА, солі та ін.) дозволило авторам досягти стабільності ензиму при температурі понад 100 0С. Така а-глюкозидаза зберігає 50% активності при 130 0С через 30-60 хв інкубації за присутності 90% сорбітолу, 1% дитіотреїтолу та 1% БСА.
Дослідження гіпертермофільних морських архебактерій привертає особливу увагу дослідників, оскільки окрім еволюційного значення ензими із цих мікроорганізмів дають можливість вивчати структуру та функціонування протеїнів в умовах високих температур. Такі ензими мають високий біотехнологічний потенціал для переважного використання їх у технологічних схемах. До таких організмів належать представники роду Pyrococcus, а саме P. furiosus та P. brockii.
Гіпертермофільна архебактерія P. ^гю-sus, оптимальна температура для вирощування якої становить 100 0С, продукує комплекс амілолітичних ензимів, включаючи й внутрішньоклітинну а-глюкозидазу [12].
Таблиця 2. Способи очищення а-глюкозидаз із мікробних джерел
Джерело ензиму Етапи очищення Вихід, %
Thermococcus sp [11] Гель-фільтрація на Hiload Q-Sepharose, феніл-Sepharose, HPHT-гідроксилапатиті та хроматографія на Mono Q 4 (очищення у 875 разів)
Pyrococcus furiosus [12] Фракціонування сульфатом амонію (30-70%), іонобмінна хроматографія на DEAE-целюлозі, хроматографія на гідроксилапатиті та гель-фільтрація на Sephadex G-200 8,5 (очищення в 310 разів)
Torulaspora pretoriensis [19] Хроматографія на Toyopearl HW 55F, DEAE-Toyopearl 650M, гідроксилапатиті та феніл-Toyopearl 650M, препаративний електрофорез очищення у 103 рази
Rhizobium sp. [22] Осадження сульфатом амонію, катіон-обмінна хроматографія на DEAE-TrisAcryl M, гідрофобна хроматографія на феніл-Sepharose та гель-фільтрація на Ultrogel AcA 44 18 (очищення в 475 разів)
Mortierella alliacea [21] Осадження етанолом, гідрофобна хроматографія на HiLoad Phenyl Sepharose, катіонообмінна хроматографія на Resours S, рехроматографія на Resours S, гель-фільтрація на HiLoad Superdex 200 2,3 (очищення в 33 рази)
Bacillus thermoamyloliquefa-ciens [17] Фракціонування сульфатом амонію (40-70%), іонообмінна хроматографія на DEAE-Sephadex A50, рехроматографія на DEAE-Sephadex A50, хроматографія на Bio-Gel HTP, гель-фільтрація на Sepharose CL-6B 10 (очищення в 68 разів)
Schwanniomyces occidentalis [26] Осадження сульфатом амонію(100%), іонообмінна хроматографія на DEAE-Sepharose CL-6B, хроматографія на BioGel З-200 86 (очищення в 16 разів)
Picrophilus torridus [14] Одержання клітинних екстрактів, теплова обробка (15 хв при 67 оС), іонообмінна хроматографія на Source Q, гель-фільтрація на Superdex 200 9,4 (очищення в 39 разів)
Вона має молекулярну масу 125 кДа (за даними ЕФ у SDS-ПААГ), оптимум активності досягається за рН 5,0-6,0 та температури 105-115 0С. Ензим термостабільний при 98 0С протягом 48 год (50% активності).
За будовою молекули бактеріальні а-глюкозидази найчастіше мають мономерну структуру, хоча є дані щодо пентамерної структури а-глюкозидази Sulfolobus solftari-cus з молекулярною масою 400 кДа, яка виявляє активність щодо а-1,4-зв’язків мальтоолігосахаридів та а-1,6-зв’язків ізо-мальтози [13]. Ензим має високу термостабільність: максимальну активність виявляє при 105 0С, зберігає половину активності упродовж 11 год при 85 0С, 3 год — при 95 0С та 2,75 год при 100 0С. Ця а-глюкозидаза надзвичайно стійка до протеолізу та дії денатуруючих агентів, включаючи аліфатичні спирти.
Picrophilus torridus — екстремофільний організм, що належить до родини еуархеїв, в останні роки привернув увагу дослідників своєю здатністю виживати в дуже кислих умовах середовища, навіть при значеннях рН, близьких до 0. Уперше штами цього виду було ізольовано в зоні сухих сольфатаро-вих полей Північної Японії. В умовах геотермального підігріву кислотність зумовлена наявністю сірчаної кислоти, яка утворюється шляхом окиснення вулканічної сірки до 803 та реакції останньої з водою. Поряд із цим концентрація кислоти може зростати під впливом випаровування. P. torridus, виділений з такої еконіші, має відповідні властивості: оптимальними для росту є температура 60 0С та рН 0,7 [14]. Особливістю штамів цього виду є нездатність їх рости при рН, більших за 4,0, а також низькі значення рН цитоплазми (4,6), що суттєво відрізняє їх від інших термоацидофільних мікроорганізмів, які підтримують внутрішньоклітинне рН на рівні нейтральних значень.
Внутрішньоклітинний ензим з P. torridus було отримано в гомогенному стані (табл. 2); за даними ЕФ у SDS-ПААГ, його молекулярна маса становила 74,5 кДа, але активна форма ензиму має гексамерну будову та молекулярну масу 440 кДа. Максимальну активність він виявляє при 87 0С, рН 5,0 (субстрат 4-НФ-а-глюкозид), а за оптимальної температури вирощування — 60 0С — тільки 23% від максимальної активності. Після інкубації при 80 0С протягом 120 хв ензим зберігає понад 80% активності. а-Глюкозидаза P. torridus активна в досить широкому діапазоні рН з максимумом при
5,0.
Філогенетичний аналіз а-глюкозидаз-них кластерів P. torridus показав більшу подібність з віддаленим родом Sulfolobus, ніж з близькоспорідненим Thermoplasma. Висунуто гіпотезу про те, що між цими двома родами відбувалася широка латеральна передача генів. Тому не дивно, що а-глюко-зидазі P. torridus притаманні властивості, подібні до тих, що їх раніше було встановлено для її гомолога — мальтази S. solfataricus [15]. Було б цікаво також вивчити досі не охарактеризовані гомологи а-глюкозидази P. torridus, які знайдено в інших еуархеїв, таких як T. acidophilum та T. volcanium (CAC11443 та BAB60467 відповідно). Можливо, а-глюкозидаза P. torridus відіграє важливу роль в утилізації а-глюканів типу крохмалю та мальтоолігосахаридів.
Великий інтерес становить виділення а-глюкозидази з ацидофільної бактерії Ferroplasma acidiphilum [16]. Для цього організму характерним є ріст за дуже низьких значень рН — усього 1,7, а рН-оптимум виділеного ензиму — в діапазоні 1,7-4,0, що нижче від показників рН цитоплазми клітини. На думку авторів, це може свідчити про наявність не виявлених клітинних механізмів, які забезпечують розділення у цитоплазмі зон з різним значенням рН, так звану «плямистість» цитоплазми. Утім, це питання ще потребує детальних досліджень.
Відрізняється від багатьох бактеріальних ензимів а-глюкозидаза термофільної бактерії Bacillus thermoamyloliquefaciens KP1071 [17]. Цей ензим є термофільним, термостабільним та надзвичайно стійким до дії денатуруючих агентів. Встановлено, що його молекула не містить вуглеводів, а за своєю будовою є гексамером з молекулярною масою 540 кДа. Ізоелектрична точка — при 5,7. Проведений N-термінальний сіквенс 20 амінокислотних залишків (Ala1-Ile-Gln-Pro-Glu-Gln-Asp-Asp-Lys-Thr-Gln-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ile-Asp-Ile-Gly-Àsn20) не виявив гомології з жодним прокаріотичним або еукаріотичним протеїном, включаючи моно-мерні екзо-а-1,4-глюкозидази та оліго-1,6-глюкозидази мікроорганізмів. Найбільшу активність ензим виявляє при 81 0С та рН
7,0, однак за цих умов втрачає половину активності протягом 10 хв. У присутності 6,4 М сечовини, 26% етанолу або 2,5% SDS «період напівжиття» цього ензиму становить 5 год при 55 0С. Автори вважають, що висока стабільність а-глюкозидази є результатом комбінування ефекту олігомеризації зі збільшеною стабільністю субодиниць молекули ензиму, порівняно з мономерними
протеїнами, оскільки субодинична агрегація супроводжується збільшенням гідрофобних взаємодій. У а-глюкозидази B. ther-moamyloliquefaciens КР1071 виявлено значну кількість гідрофобних амінокислот (62,3 моль/моль), а відомо, що саме гідрофобні зв’язки забезпечують термостабільність ензимів, оскільки водневі та іонообмінні взаємодії значно послаблюються з підвищенням температури. Висока термо-толерантність олігомерних а-глюкозидаз S. solftaricus та B. thermoamyloliquefaciens КР1071 схиляє до думки, що олігомери-зація є одним із можливих шляхів захисту молекул ензимів від температурного стресу.
Виділено а-глюкозидази і з морських глибоководних бактерій роду GeobacШus. Молекулярна маса а-глюкозидази з GeobacШus ер., за даними ЕФ у SDS-ПААГ, дорівнює 65 кДа, однак в умовах слабкої іонної сили ензим набуває вигляду димеру (130 кДа). Він є термостабільним та стійким у лужних умовах, період «напівжиття» при 60 0С та рН
9,0 у 15 мМ гліцин-КаОН буфері — понад 13 год [10].
Іншу а-глюкозидазу з G. thermodenitrifi-сат було очищено у 25 разів з виходом 32% [18]. Молекулярна маса її, за даними ЕФ у SDS-ПААГ, становила 45 кДа. Однак цей ензим є менш термостабільним, оптимальними для вияву активності для нього були показники рН у діапазоні 6,5-7,5 та температура 55 0С. Виявляє синергічну дію з а-амілазою, що також синтезується цією культурою, але зовсім не має трансглюкози-люючих властивостей.
Молекулярна маса іншої а-глюкозидази, виділеної з Torulaspora pretoriensis [19], за даними ЕФ у SDS-ПААГ, досягала 69 кДа, а за даними гель-фільтрації — 60 кДа. Опти-муми рН та температури — при 6,8 та 35 0С відповідно.
Окрім бактеріальних продуцентів а-глю-козидаз, в останні роки активно ведуться дослідження активних грибних та дріжджових біосинтетиків. Перспективним термофільним продуцентом є гриб Thermoascus aurantiacus [20]. Термооптимум а-глюкози-дази, виділеної з нього, досягається при 70 0С, ензим зберігає 100% активності через
10 год при 60 0С, але на 50% інактивується за 15 хв при 80 0С. До того ж він стабільний у широкому діапазоні рН.
Охарактеризовано ще одну нову а-глю-козидазу з МогНегеШШа аіііасеа [21]. Молекула цього ензиму складається з двох різних за масою субодиниць — 61 та 31 кДа, які не зв’язані між собою ковалентними зв’язка-
ми, але стабільно агрегуються за високих концентрацій солей (0,5 М). У процесі гель-фільтрації спостерігається вихід одного протеїну з молекулярною масою 92 кДа, що також підтверджує гетеродимерну будову молекули ензиму. Автори вважають, що він утворюється у вигляді одного поліпептиду, який потім піддається обмеженому протеолізу. Є попередні дані, які свідчать про те, що 2 субодиниці а-глюкозидази M. alliacea кодуються одним геном. Оптимальними умовами для гідролізу мальтози є рН 5,0 —
6.0 та температура 55 0С. Для трансглюкози-люючої активності у присутності етанолу під час утворення етил-а-глюкозиду оптимальними є рН 5,0 і температура 45-50 0С. Ензим стабільний у діапазоні рН від 4,0 до
10.0 протягом 24 год. Після 15-хвилинної інкубації при 60 0С реєструється 80% від вихідної активності.
Досить добре на цей час вивчено а-глю-козидазу Rhizobium sp. Це мономерний не-глікозильований протеїн з молекулярною масою 59±0,5 кДа, рН 4,75 [22]. Ензим стабільний при -20 0С упродовж декількох місяців, ліофілізація суттєво не впливає на його активність. Оптимальними умовами для вияву активності є рН 6,0 — 6,5 і температура 35 0С. Показано, що активність ензиму зростала у присутності NH4+ та К+-іонів (10 мМ). Проте його активність інгібується іонами міді, срібла, ртуті та заліза (ІІ), а також різними похідними фенілу, фенолу та флавоноїдів.
а-Глюкозидаза, виділена з культуральної рідини Acremonium implicatum, являє собою тетрамерний протеїн (мол. маса 440 кДа), мономери якого (мол. маса 103 кДа) складаються з двох поліпептидів (мол. маса 51 та 60 кДа), що утворюються, ймовірно, в результаті посттрансляційного протеолізу [23].
Було отримано в очищеному вигляді а-глюкозидазу з Candida albicans [24], молекула якої, за даними ЕФ у SDS-ПААГ, мала у своєму складі поліпептиди (36 та 47 кДа).
Також досліджено іншу дріжджову а-глюкозидазу, виділену з Xanthophyllomyces dendrorhous [25]. Її молекулярна маса, за даними ЕФ у SDS-ПААГ, становить 60,2 кДа, а за даними гель-фільтрації — 115 кДа. Ця глюкозидаза є глікопротеїном, а тому частка вуглеводів досягає 12% від маси молекули. Ензим не належить до найбільш термотоле-рантних, його термооптимум — при 45 0С, а при 50 0С він втрачає половину активності за 3 год.
а-Глюкозидаза з Schwanniomyces occi-dentalis мала рН-оптимум у діапазоні
3,5-5,0 і була стабільною в діапазоні 3,0-9,0 [26]. Однак цей ензим виявляє низьку термостабільність і при 60 0С втрачає активність за 15 хв.
Умови культивування
На прикладі вирощування культури S. solfataricus показано, що активними індукторами синтезу а-глюкозидази можуть бути ізопропіловий ефір а^-тіогалактопіра-нозиду або лактоза [27]. Індукція синтезу ензиму також відбувається з додаванням у живильне середовище дріжджового субстрату та триптону. В умовах біореактора з ульт-рафільтраційними мембранами при концентрації клітин 50 г сух. маси/л одержували продукцію а-глюкозидази на рівні 11,5 тис. Од/л. Комбінація генно-інженерних та мік-рофільтраційних технологій дозволяє підвищити вихід ензимів у 2 тис. разів.
Для глибинної культури Т. а^апНас^ встановлено, що максимальний рівень активності — 30 Од/мл — досягається на 336-й год вирощування. Індукторами в цьому разі були пшеничні висівки та м’якоть касави [20].
На прикладі бактерії Р. furiosus, яку вирощували на середовищі з морською водою, додаючи 10 г 8°, 5 г триптону та 1 г дріжджового екстракту (на 1 л), було з’ясовано, що найкращими індукторами синтезу а-глюкозидази є крохмаль, глікоген та пулу-лан, а також мальтоза [12]. Оскільки глюкоза не метаболізується Р. furiosus, то мальтоза або інші продукти гідролізу полісахаридів надходять у клітину в активній або пасивній формі, за допомогою мальтозопермеази, як індуктори синтезу амілолітичних ензимів. Як і в багатьох бактеріальних системах, а-глюкозидаза Р. furiosus відіграє роль останньої ланки в гідролізі крохмалю до глюкози.
Субстратна специфічність а-глюкозидаз
Мікробні а-глюкозидази мають значні відмінності у субстратній специфічності. До того ж ці ензими можуть бути екстрацелю-лярними, внутрішньоклітинними або зв’язаними з мембраною. Таким чином, класифікація та порівняння ензимів з різних джерел вкрай ускладнюються. а-Глюкози-дази, виділені з тваринних, рослинних та грибних джерел, зазвичай виявляють вищу активність щодо мальтоолігосахаридів, ніж до сахарози чи амілоглюкозидів. Зокрема, грибні ензими гідролізують переважно ко-ротколанцюгові вуглеводні субстрати. Так,
а-глюкозидаза з А. отугае та А. підег надто повільно гідролізує а-глюкани, однак ензими з Mucor iavanicus, М. racemosus, РаесіШо-myces varioti та РепісШшт врр. здатні деякою мірою деградувати розчинний крохмаль. Така специфічність відрізняє ці ензими від інших екзоглюкозидаз, таких як грибні глюкоамілази.
Дані щодо гідролітичної активності а-глюкозидази М. аіііасеа [21] наведено у табл. 3. Гомогенні субстрати, такі як мальтоза або крохмаль, гідролізуються нею краще, ніж гетерогенні, зокрема сахароза або 4-нітрофеніл-глюкозид. Ензим найкраще атакує а-1,4-зв’язок, меншою мірою а-1,2 і майже не розщеплює а-1,6-зв’язок. Але найцікавішим є те, що розчинний крохмаль розщеплюється ефективніше, ніж мальтоза. Загалом, характерною особливістю а-глюко-зидази з М. аіііасеа є те, що полісахариди гідролізуються нею значно краще, ніж олігосахариди. На основі вивчення ефективності гідролізу мальтоолігосахаридів з різною довжиною ланцюга було встановлено, що найбільшу афінність ензим має до маль-тотетрози (&саі/Кш = 23,9 мМ-1^-1), а найбільшу афінність до субстрату — субсайт зв’язування 2 (4,91 &еа1/мо1), далі йде субсайт
1 (0,98 &еа1/мо1), а потім — 3 (0,16 &еа1/мо1). Такий розподіл також свідчить про те, що йдеться саме про а-глюкозидазу, а не про глюкоамілазу. Ще одним доказом того, що виділений ензим належить до а-глюкозидаз, є наявність у нього трансглюкозилюючої активності (табл. 3). Причому тут також показано перевагу розчинного крохмалю та глікогену перед мальтозою для перенесення глюкозного залишка на молекулу етанолу.
Подібну до ензиму з М. аіііасеа високу специфічність щодо мальтоолігосахаридів (розчинного крохмалю зокрема) має й а-глюкозидаза, яку виділено з культури
S. occidentalis (табл. 4) [26]. Ензим виявляє дуже високу каталітичну ефективність щодо крохмалю (&саі/Кш), тому його спочатку ідентифікували як глюкоамілазу. Однак у результаті дослідження аномерної конфігурації продуктів гідролізу та нуклеотидного сиквенсу цей ензим було остаточно віднесено до а-глюкозидаз (ЕС 3.2.1.20).
Нова а-глюкозидаза дріжджового гриба Xanthophyllomyces dendrorhous також має високі показники каталітичної ефективності [&еа1/Кш (хв^-мМ1)] щодо мальтооліго-сахаридів: 873 — для мальтотріози, 698 — для мальтогептози. Цей ензим гідролізує розчинний крохмаль, але у 3,5 та 1,4 раза повільніше, ніж мальтотріозу та мальтозу
Таблиця 3. Субстратна специфічність а-глюкозидази M. alliacea [21]
Субстрат Гідроліз, мкМ глюкози/мг протеїну/хв Утворення етил а-глюкозидів, мг а-ЕГ/мг протеїну/хв
Мальтоза (а-1,4) 29,8 ± 1,7 0,91 ± 0,05
Трегалоза (а,а-1,1) 0,3 ± 0,1 нв
Ізомальтоза (а-1,6) 1,0 ± 0,1 нв
Малтитол 5,3 ± 0,1 0,06 ± 0,01
Амілоза (а-1,4) 8,3 ± 0,4 —
Койобіоза (а-1,2) 7,0 ± 0,3 0,16 ± 0,03
Етил а-глюкозид 0,3 ± 0,1 —
Нігероза (а-1,2) 26,1 ± 0,7 0,28 ± 0,04
Сахароза (а-1, а-2) 0,9 ± 0,1 нв
Розчинний крохмаль 42,9 ± 5,2 1,19 ± 0,08
Глікоген (а-1,4) 30,2 ± 2,9 1,56 ± 0,06
Амілопектин (а-1,4) 34,3 ± 1,9 —
Декстран (а-1,6) 0,2 ± 0,1 нв
Пулулан (а-1,6) 0,9 ± 0,1 нв
4-НФ-глюкозид 3,4 ± 0,2 0,02 ± 0,01
Примітка: нв — не визначалась (менше ніж 0,0005 мг а-ЕГ/мг протеїну/хв).
Таблиця 4. Кінетичні характеристики а-глюкозидази 5. occidentalis [26]
Субстрат kcat, c 1 Km, мМ kcat/Km, с-1 ‘мМ-1
Мальтоза 190 0,096 2,000
Мальтотріоза 230 0,064 3,590
Мальтотетроза 180 0,051 3,500
Мальтопентоза 200 0,087 2,300
Мальтогексоза 140 0,078 1,800
Мальтогептоза 140 0,11 1,270
Розчинний крохмаль 140 0,66 210
4-нітрофеніл-а-глюкозид 8,0 0,48 16,7
4-нітрофеніл-а-мальтозид 260 0,12 2,170
Койобіоза 33 0,61 54,1
Нігероза 59 3,0 19,7
Ізомальтоза 130 1,6 81,2
відповідно, та зовсім не діє на сахарозу, аріл-а-глюкозиди або ізомальтоолігосахари-ди. За своєю специфічністю він є а-глюкози-дазою типу ІІ [4].
а-Глюкозидаза Rhizobium sp. не відщеплює глюкозу від метил-а-глюкозиду, маль-тотріози, мальтотетрози, мальтопентози, мальтогексози, мальтогептози, мальтозо-1-фосфату, туранози, малтитолу мальто-триїтолу, ізомальтози, ізомальтитолу, панози, крохмалю, амілопектину, а-циклодекстри-ну, декстрану, пулулану, целобіози, целюлози, лактози. За своєю специфічністю цей ензим є типовою а-глюкозидазою і може бути використаний як специфічний агент щодо ароматичних сполук рослин, таких як феніл-глікозиди, флавоноїди та гормони [22].
Для термофільного гриба Т. а^а^іас^ характерним є синтез а-глюкозидази, яка переважно гідролізує мальтозу й дуже повільно крохмаль, декстрини, синтетичні субстрати (4-нітрофеніл-а-глюкозид) і зовсім не гідролізує сахарозу. Тобто, за своїми властивостями вона є а-глюкозидазою типу
ІІ [20].
Дослідження широкого спектра оліго-, полісахаридів та синтетичних глікозидів показало, що а-глюкозидаза термоацидофіль-ного мікроорганізму Р. іогМш найефективніше гідролізувала мальтозу та р-нітрофеніл-глюкозид [14]. Від синтетичних субстратів ензим відщеплює виключно глюкозу та виявляє строгу специфічність щодо типу зв’язку (тільки а-1,4). Швидкість гідролізу мальтоолігосахаридів зменшувалася
зі збільшенням кількості молекул мальтози в субстраті. Активність щодо мальтотетрози становила 54, а щодо декстрину 10 — усього 27% від активності в разі використання мальтози. На відміну від близького гомолога із 5. solfataricus або а-глюкозидази ссавців, ця глюкозидаза не здатна відщеплювати глюкозу від полімерних субстратів типу глікогену. Аналіз продуктів гідролізу маль-тоолігосахаридів методом тонкошарової хроматографії показав відсутність будь-якої трансферазної активності в а-глюкозидази Р. torridus [14].
Для а-галактозидази А. підег, яка однаково швидко гідролізує як глюко-, так і кси-лопіранозиди від синтетичних субстратів, було встановлено, що зв’язування ізомаль-този та ксилопіранозил а-1,6-глюкопірано-зиду відбувається на одному й тому самому сайті зв’язування [28].
Аналіз субстратної специфічності а-глю-козидази В. thermoamyloliquefaciens КР1071 [17] свідчить, що ензим виявляє як оліго-
1,6-глюкозидазну, так і екзо-а-1,4-глюкози-дазну активність, але переважає гідроліз а-1,4-глюкозидних зв’язків з нередукуючого кінця субстрату. Активність щодо пулулану та декстрану не перевищувала гідролізу 1% субстрату за 2 год. Найбільшу афінність ензим виявляє до мальтози, мальтотріози, мальтотетрози та мальтопентози, дещо меншу — щодо декстрину та амілози А. Було з’ясовано, що в разі використання як субстратів 4-нітрофеніл-глюкозиду, мальтози та ізомальтози, Трис є конкурентним інгібітором каталітичної реакції.
Інша термофільна а-глюкозидаза 5. sol-fataricus гідролізує переважно субстрати, де глюкоза поєднана а-1,4-зв’язком у такому порядку: мальтоза > мальтотріоза > мальто-тетроза > мальтогептоза > 4-НФ-а-глюкозид (але зовсім не відщеплює від синтетичного субстрату а-глюкозид). Їй не притаманна здатність розщеплювати крохмаль та декстрани. Дуже повільно гідролізує ізо-мальтозу, але не декстрини, що свідчить про здатність ензиму розщеплювати а-1,6-зв’язок, однак лише в коротких ланцюгах. Показано, що активність цієї а-глюкозида-зи щодо мальтози можна значно підвищити п-пропанолом або етанолом: до 50% — з використанням 50% -го пропанолу та 20% -го етанолу, а при 85 0С присутність 7,5%-го п-пропанолу підвищує показники Кт та Vmax для мальтози в 3 рази.
Було виявлено надзвичайно високу трансглікозилюючу активність ензиму з GeobacШus ер. [10]. Ця а-глюкозидаза мала
здатність гліколізувати різні невуглеводні молекули, використовуючи мальтозу як донора. Така властивість дозволяє застосовувати ензим для біосинтезу різних складних вуглеводів.
Цікавими є результати, що їх одержано для рекомбінантної а-глюкозидази (Pichia pastoris) із ячменю. Цей ензим гідролізував мальтозу в 3 рази швидше, ніж нігерозу, та в 20 разів швидше, ніж трегалозу та ізомаль-тозу. Уперше на цьому ензимі було показано можливість субстратного інгібування а-глю-козидази, оскільки мальтоза в концентрації вище за 20 мМ була інгібітором гідролізу мальтози [29].
а-Глюкозидаза C. albicans переважно гідролізувала нігерозу, де глюкоза зв’язана а-1,3-зв’язком [24]. Також очищений ензим конвертував олігосахарид GlcMan9GlcNAc2 до Man9GlcNAc2. Ці та інші властивості дозволяють залучати цю а-глюкозидазу до оброблення N-гліканів.
Ще одну високоспецифічну до а-1,3-зв’язку а-глюкозидазу було виділено з A. implicatum [23]. Нігероза та мальтоза гідролізуються цим ензимом швидко, проте повільніше, ніж койобіоза. Ізомальтоза гідролізується дуже повільно, а сахароза не розщеплюється взагалі. Найбільшу афін-ність він виявляє до мальтоолігосахаридів та 4-нітрофеніл-а-мальтозиду, добре гідро-лізує розчинний крохмаль. Ця глюкозидаза має а-1,3- та а-1,4-глюкозилтрансферазну активність і може синтезувати олігосахари-ди, але їй не притаманна здатність утворювати а-1,2- та а-1,6-глюкозидні зв’язки. Слід наголосити, що її здатність формувати а-1,3-глюкозидні зв’язки в 2-3 рази вища, ніж здатність утворювати а-1,4-зв’язки. За допомогою трансглюкозилюючої активності цього ензиму вдалось отримати дві нові сполуки: 3(2)-0-а-нігерозил-мальтозу та 3(2)-O-а-мальтозил-мальтозу.
Глюкозидаза T. pretoriensis має найбільшу спорідненість до синтетичного нітро-фенільного субстрату, а найменшу — до мальтози [19]. Km (мМ) для 4-нітрофеніл-а-глюкозиду, мальтози, мальтотріози, ізо-мальтози, метил-а-глюкозиду та сахарози становлять 0,15, 150, 45, 17, 18 та 29, а Vmax (мМ/хв/мг протеїну) для тих самих субстратів — 87; 0,23; 2,4; 9,0; 12; 7,4 відповідно. Ензим піддавався інгібуванню AgNO3, HgCl2, SDS та N-етилмалеїмідом. За своїми властивостями він близький до а-глю-козидази із S. cerevisiae.
Субстратні пріоритети а-глюкозидази Thermococcus sp. можна розташувати в такому
порядку: 4-НФ-а^-глюкозид > нігероза > паноза > палатіноза > ізомальтоза > мальтоза й тураноза [11]. Кт при 70 0С для 4-нітро-феніл-а^-глюкозиду дорівнює 0,41 мМ. Проте ензим був зовсім не здатний гідролізу-вати крохмаль, пулулан, амілозу, маль-тотріозу, мальтотетрозу, ізомальтотріозу, целобіозу та а-гентіобіозу. Було встановлено, що дитіотреїтол (1%) та БСА (0,4%) значною мірою підвищували активність а-глюкозидази.
Термостабільна а-глюкозидаза Р. furio-sus [12] виявляє активність щодо 4-НФ-глю-козиду й не атакує крохмаль і сахарозу. Було показано, що мальтоза виступає інгібітором а-глюкозидазної активності в разі використання 4-нітрофеніл-глюкозиду як субстрату (К = 14,3 мМ). Преінкубація з 1% SDS або
1,0 М гуанідин-НСІ суттєво знижує активність ензиму, тимчасом як 30-хвилинна пре-інкубація з 100 мМ дитіотреїтолом або 1 М сечовиною при 98 0С майже не впливала на його активність. Надзвичайно висока термостабільність та стійкість до дії денатуруючих агентів свідчать про наявність унікальних, ще не розкритих властивостей у цієї а-глюкозидази, виявлення яких є вкрай важливим.
Завдяки широкому спектру різноманітних каталітичних властивостей а-глюкози-дази використовують у різних технологічних процесах. Трансглікозилюючі реакції у присутності етанолу дозволяють отримувати етил-а-глюкозид, підсолоджуючу та ароматизуючу речовину, що запобігає утворенню карієсу й підсилює бар’єрний ефект шкіри. Зазвичай цю речовину одержують за допомогою мальтози як донора глюкозиль-них залишків, однак використання у цих процесах а-глюкозидаз, високоспецифічних щодо крохмалю та глікогену, уможливить одержання етил-а-глюкозидів із полісахаридів.
Каталітичний механізм а-глюкозидаз
а-Глюкозидази каталізують реакції двох типів — перенесення глюкозного залишку з невідновлювального кінця олігосахариду на воду (гідроліз) або перенесення цього залишку на молекулу акцептора (трансгліко-зилювання). Ці реакції з формального погляду є нуклеофільним заміщенням у насиченому вуглеці С1 аномерного центру і можуть відбуватись як зі збереженням, так й з інверсією аномерної конфігурації продукту. Відповідно розглядають два типи ензимів, що переносять глюкозил, — «зберігаючі» та
«інвертуючі». а-Глюкозидази належать до першого типу, а глюкоамілази — до другого (рис. 1).
Рис. 1. Процеси гідролізу та трансглікозилювання під дією а-глюкозидази (а) та глюкоамілази (б) [4]
Особливе значення у встановленні тонких механізмів дії глікозидаз (особливо а-глюкозидаз) мають роботи Hehre [30], Liu et al. [31] та Lehmann et al. [32], присвячені вивченню взаємодії цих ензимів із субстратами, в яких С1 перебуває або в подвійному зв’язку (глікалі, глікогептенітоли, глікоок-тенітоли), або ж аномерна конфігурація «неправильна», як у ß-D-глюкозилфториду. Було встановлено, що а-глюкозидази реагують із вищезазначеними субстратами, зв’язуючись з ними продуктивно, ймовірно внаслідок відсутності у них громіздких замісників при С1 з «неправильною» орієнтацією. Показано, що глюкозидази гідролізують усі ці субстрати, тоді як жодна а-глюкозидаза не реагує з найменшим «неправильним» глюкозидом — метил^^-глюкопіранозидом, можливо через те, що на екваторіальний замісник при С1 накладено конформаційні обмеження амінокислотними залишками, що визначають порожнину активного центру.
Відомо, що а-глюкозидази швидко гідро-лізують а-глюкозилфторид з утворенням а-глюкози. ß-Глюкозилфторид, хоча й значно повільніше, але також гідролізується цими ензимами з утворенням а-глюкози. Прохі-ральні субстрати (глюкаль, енітоли) під час гідролізу утворюють а-аномерні продукти (2-дезокси-а-глюкозу, а-глюкогептулозу, а-глюкооктулозу). Matsui et al. [33] запропонував мінімальну схему (рис. 2), що може пояснити ці ефекти із загальних позицій.
Припускають, що в кожному випадку не-поділена пара електронів кисню кільця субстрату бере участь у розщепленні глікозидного зв’язку при С1 з утворенням загального перехідного стану зі структурою карбо-катіону. Принциповим у схемі є положення,
Рис. 2. Можливі механізми гідролізу субстратів з різною аномерною конфігурацією а-глюкозидазою.
Зліва — пластична фаза реакції, справа — консервативна [33]
що для випадків а та б протонування каталітичних карбоксилів є оборотним (рис. 2). Це підтверджують ЯМР-експерименти з визначення розташування протона під час С2 (аксіальне або екваторіальне відносно площини кільця) гідратації глюкалю в D2O [1]. Hehre робить висновок, що каталітичний акт для а-глюкозидаз (й інших глікозидаз) можна розділити на дві фази — пластичну та консервативну. У пластичній фазі залежно від субстрату каталітичні карбоксили можуть мінятися місцями — нуклеофіл стає загальною кислотою й навпаки. Наприклад, подвійний зв’язок глюкалю поблизу нуклео-філа збільшує його рК та сприяє протону-ванню. У консервативній фазі гідратація жорстко контролюється структурою протеїну, незалежно від конфігурації субстрату, і для а-глюкозидаз завжди відбувається в аксіальній позиції з утворенням а-аномер-них продуктів.
Слід зазначити, що механізми ß-глюкози-даз досліджено повніше, ніж а-глюкозидаз. Ймовірно, це пов’язано передусім з меншими труднощами одержання синтетичних субстратів, що мають ß-аномерну конфігурацію.
Біологічні функції а-глюкозидаз
На сьогодні а-глюкозидази виявлено в багатьох представників симбіотичних мікроорганізмів, зокрема родини Rhizobiaceae. Вважають, що вони присутні на всіх стадіях проникнення мікроорганізму до клітини рослини. Вищі рослини продукують ароматичні сполуки у глікозильованій формі, що має важливе значення для розпізнавання бактерій та проникнення їх у рослину.
Глюкозидази відіграють важливу роль і в деградації клітинної стінки рослин. а-Глюкозидазу та а-галактозидазу було виявлено у 45 штамів ризобіальних мікроорганізмів. Целюлолітичну та пектінолітичну активність відзначено в Rhizobium legumi-nosarum. Значну глікозидазну активність мали штами Bradyrhizobium lupini.
Таким чином, різні глюкозидази, маль-тази, амілази, трегалази та целюлази забезпечують симбіоз та утворення бульбочки на корінцях вищих рослин.
Високу а-глюкозидазну активність мають також біфідобактерії — представники нормофлори кишечнику людини. Така властивість дозволяє швидко ідентифікувати ці бактерії, використовуючи ензиматичні методи [34]. Цілком очевидно, що в даному разі а-глюкозидаза є необхідною для участі в перетравленні вуглеводів.
Підсумовуючи вищевикладене, слід наголосити, що всебічне дослідження мікробних глюкозидаз, зокрема а-глюкозидаз, дасть змогу не тільки ширше і з високою ефективністю використовувати їх у біотех-нологічних процесах, але й поглибить наші
ЛІТЕРАТУРА
1. Chiba S., Brewer C. F., Okada G., Matsui H, Hehre E. J. Stereochemical studies of D-glucal hydration by alpha-glucosidases and exo-alpha-glucanases: indications of plastic and conserved phases in catalysis by glycosylases // Biochemistry. — 1988. — V. 27, N5. — Р. 1464-1469.
2. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. — 1991. — V. 280 , Pt. 2. — Р. 309-316.
3. Chiba S. Molecular mechanism in alpha-glu-cosidase and glucoamylase // Biosci. Bio-technol. Biochem. — 1997. — V. 61, N8. — Р. 1233-1239.
4. Красиков В. В., Карелов Д. В., Фирсов Л. М. а-Глюкозидазьі // Биохимия. — 2001. — Т. 66, №3. — С. 332-348.
5. Watanabe K., Hata Y., Kizaki H., Katsube Y. et al. The refined crystal structure of Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase at 2.0 A resolution: structural characterization of prolinesubstitution sites for protein thermostabilization // J. Mol. Biol. — 1997. — V. 269, N1. — Р. 142-153.
6. Suzuki Y., Yonezawa K., Hattori M. et al. Assignment of Bacillus thermoamyloliquefa-ciens KP1071 alpha-glucosidase I to an exo-alpha-1,4-glucosidase, and its striking similarity to bacillary oligo-1,6-glucosidases in N-terminal sequence and in structural parameters calculated from the amino acid composition // Eur. J. Biochem. — 1992. — V. 205, N1. — Р. 249-256.
7. Varrot A., Yamamoto H., Sekiguchi J. et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the 6-phospho-alpha-glucosidase from Bacillus subtilis // Acta Cryst. D. Biol. Crystallogr. — 1999. — V. 55, Pt. 3. — P. 1212-1214.
8. Clark S. E., Henson C. A. The effect of proline insertions on the thermostability of a barley alpha-glucosidase // Prot. Eng. — 2002. — V. 15, N1. — Р. 29-33.
9. Yamamoto K., Nakayama A., Yamamoto Y. et al. Val216 decides the substrate specificity of alpha-glucosidase in Saccharomyces cerevisi-ae // Eur. J. Biochem. — 2004. — V. 271, N16. — Р. 3414-3420.
10. Hung V.S., Hatada Y., Goda S. et al. Alpha-glucosidase from a strain of deep-sea Geoba-
знання щодо еволюційного походження ензимів, їхньої структури й механізму дії, що в кінцевому підсумку дозволить вирішити одне з головних питань сучасної ензимології — розкрити взаємозв’язок між будовою активного центру ензиму та специфічністю його дії.
cillus: a potential enzyme for the biosynthesis of complex carbohydrates // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2005. — V. 68, N6. — Р. 757-765.
11. Piller K., Daniel R. M., Petach H. H. Properties and stabilization of an extracellular alpha-glucosidase from the extremely thermophilic archaebacteria Thermococcus strain AN1: enzyme activity at 130 degrees C // Biochim. Biophys. Acta. — 1996. — V. 1292, N1. — Р. 197-205.
12. Costantino H. R., Brown S. H., Kelly R. M. Purification and characterization of an alpha-glucosidase from a hyperthermophilic archaebacterium, Pyrococcus furiosus, exhibiting a temperature optimum of 105 to 115 degrees C // J. Bacteriol. — 1990. — V. 172, N7. — Р. 3654-3660.
13. Rolfsmeier M., Blum P. Purification and characterization of a maltase from the extremely thermophilic crenarchaeote Sulfolobus solftaricus // Ibid. — 1995. — V. 177, N2. — P. 482-485.
14. Angelov А., Putyrski М., Liebl W. Molecular and siochemical ^a^^ernation of а-glu-cosidase and а-mannosidase and their clustered genes from the thermoacidophilic archaeon Picrophilus torridus // Ibid. — 2006. — V. 188, N20. — Р. 7123-7131.
15. Rolfsmeier M., Haseltine C., Bini E. et al. Molecular characterization of the alpha-glu-cosidase gene (malA) from the hyperther-mophilic archaeon Sulfolobus solfataricus // Ibid. — 1998. — V. 180, N5. — Р. 1287-1295.
16. Golyshina O.V., Golyshin P.N., Timmis K.N. et al. The pH optimum anomaly of intracellular enzymes of Ferroplasma acidiphilum // Environ. Microbiol. — 2006. — V. 8, N3. — Р. 416-425.
17. Suzuki Y., Nobiki M., Matsuda M. et al. Bacillus thermoamyloliquefaciens KP1071 alpha-glucosidase II is a thermostable M(r)
540,000 homohexameric alpha-glucosidase with both exo-alpha-1,4-glucosidase and oligo-1,6-glucosidase activities // Eur. J. Biochem. — 1997. — V. 245, N1. — Р. 129-136.
18. Ezeji T.C., Bahl H. Purification, characterization, and synergistic action of phytate-resistant alpha-amylase and alpha-glucosi-dase from Geobacillus thermodenitrificans HR010 // J. Biotechnol. — 2006. — 125, N1. — Р. 27-38.
19. Oda Y., Iwamoto H., Hiromi K. et al. Purification and characterization of alpha-glucosidase from Torulaspora pretoriensis YK-1 // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1993. — V. 57, N11. — P. 1902-1905.
20. Carvalho A. F., Goncalves A. Z., da Silva R. et al. specific short dextrin-hydrolyzing extracellular glucosidase from the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus 179-5 // J. Microbiol. — 2006. — V. 44, N3. — P. 276-283.
21. Tanaka Y., Aki T., Hidaka Y. et al. Purification and characterization of a novel fungal alpha-glucosidase from Mortierella alliacea with high starch-hydrolytic activity // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2002. — V. 66, N11. — P. 2415-2423.
22. Berthelot K., Delmotte F. M. Purification and characterization of an a-glucosidase from Rhizobium sp. (Robinia pseudoacacia L.) strain USDA 4280 // Appl Environ Microbiol. — 1999. — V. 65, N7. — P. 2907-2911.
23. Yamamoto T., Unno T., Watanabe Y. et al. Purification and characterization of Acremo-nium implicatum alpha-glucosidase having regioselectivity for alpha-1,3-glucosidic linkage // Biochim. Biophys. Acta. — 2004. — V. 1700, N2. — P. 189-198.
24. Torre-Bouscoulet M. E., Lopez-Romero E., Balcаzar-Orozco R. et al. Partial purification and biochemical characterization of a soluble alpha-glucosidase II-like activity from Candida albicans // FEMS Microbiol. Lett. —
2004. — V. 236, N1. — P. 123-128.
25. Marin D., Linde D., Lobato M. F. Purification and biochemical characterization of an alpha-glucosidase from Xanthophyllomyces dendrorhous // Yeast. — 2006. — V. 23, N2. — P. 117-125.
26. Sato F., Okuyama M., Nakai H. et al. Glucoamylase originating from Schwannio-myces occidentalis is a typical alpha-glucosi-dase // Biosci. Biotechnol. Biochem. —
2005. — V. 69, N10. — P. 1905-1913.
27. Schiraldi C., Martino A., Acone M. et al. Effective production of a thermostable alpha-glucosidase from Sulfolobus solfatari-cus in Escherichia coli exploiting a microfiltration bioreactor // Biotechnol. Bioeng. — 2000. — V. 70, N6. — P. 670-676.
28. Yoshikawa K., Yamamoto K., Okada S.
Classification of some alpha-glucosidases and alpha-xylosidases on the basis of substrate specificity // Biosci. Biotechnol. Bio-chem. — 1994. — V. 58, N8. —
P. 1392-1398.
29. Muslin E. H., Kanikula A. M., Clark S. E. et al. Overexpression, purification, and characterization of a barley alpha-glucosidase secreted by Pichia pastoris // Protein Exp. Pur. — 2000. — V. 18, N1. — P. 20-26.
30. Hehre E. A fresh understanding of the stereochemical behavior of glycosylases: structural distinction of «inverting» (2-MCO-type) versus «retaining» (1-MCO-type) enzymes // Adv. Carbohydr. Chem. Bio-chem. — 1999. — V. 55. — P. 265-310.
31. Liu W., Madsen N., Braun C. et al. Reassessment of the catalytic mechanism of glycogen debranching enzyme // Biochemistry. — 1991. — 30, N5. — P. 1419-1424.
32. Weiser W., Lehmann J., Chiba S. et al. Steric course of the hydration of D-gluco-octenitol catalyzed by alpha-glucosidases and by tre-halase // Biochemistry. — 1988. — V. 27, N7 — P. 2294-2300.
33. Matsui H., Blanchard J.S., Brewer C. F. et al. Alpha-secondary tritium kinetic isotope effects for the hydrolysis of alpha-D-glu-copyranosyl fluoride by exo-alpha-glucanas-es // J. Biol. Chem. — 1989. — V. 264, N15. — P. 8714 — 8716.
34. Vlkovа E., Nevoral J., Jencikova B. et al. Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods // J. Microbiol. Methods. — 2005. — V. 60, N3. — P. 365-373.
МИКРОБНЫЕ а-ГЛЮКОЗИДАЗЫ: КЛАССИФИКАЦИЯ, СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
Н. В. Борзова
Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: nv_borzova@bigmir.net
В обзоре представлены данные литературы относительно систематического положения а-глюкозидаз микроорганизмов в современной номенклатуре энзимов, основанной на их субстратной специфичности и молекулярном строении. Приведены сведения о распространении этих энзимов среди микроорганизмов, в том числе экстремофильных, их физико-химических и каталитических свойствах, а также о субстратной специфичности и механизме действия.
Ключевые слова: а-глюкозидаза, классификация, свойства, специфичность, механизм действия.
MICROBIAL a-GLUCOSIDASES: CLASSIFICATION, SUBSTRATE SPECIFICITY AND MECHANISM OF ACTION
N. V. Borzova
Institute of microbiology and virology National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: nv_borzova@bigmir.net
The present review focuses on systematic identification of microbial a-glucosidases in present enzyme nomenclature, which basis on substrate specificity and molecular structure. Particular attention is given to a-glucosidase occurrence among microorganisms, including extremophiles, their physical and chemical properties, catalytical abilities, substrate specificity and mechanism of action.
Key words: a-glucosidase, classification, properties, specificity, mechanism of action.
