CC BY
18
с коллектив авторов, 2011 удк 615.9:575.21.0«
Е. И. Степченкова'2, О. В. Коченова', А. С. Жук', Ю. В. Андрейчук', С. Г. Инге-Вечтомов'2
ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ И ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, УЧИТЫВАЕМЫХ В АЛЬФА-ТЕСТЕ, У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
'Санкт-Петербургский государственный университет, гСанкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН; 'Медицинский центр Университета штата Небраска, Омаха, США
Первичные повреждения генетического материала, спонтанные гаи индуцированные внешними воздействиями, часто превращаются в наследуемые изменения — генные мутации, перестройки и нерасхождения хромосом — и служат причиной онкологических, наследственных и врожденных заболеваний. Предполагают, что первичные повреждения могут оказывать влияние на фенотип до их устранения системами репарации или закрепления в виде мутаций в ходе неточной репарации. Использование альфа-теста у дрожжей Sac-charomyces cerevisiae может дать ответ на фундаментальные вопросы о природе первичных повреждений, способных проявляться фенотипически, их возникновении, превращении друг в друга, репарации или превращении в наследуемые изменения генетического материала.
Ключевые слова: первичные повреждения генетического материала, альфа-тест, Saccharomyces cerevisiae
Е. I. Stepchenkova, O.V. Kochenova, A. S. Zhuk, Yu. V. Andreichuk, S. G. lnge-Vechtomov—PHEHOTiP\C MANIFESTATION AND TRANSMUTATIONS OF PRIMARY GENETIC MATERIAL DAMAGES CONSIDERED IN THE ALPHA-TEST ON THE YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Primary (spontaneous and externally induces) damages to genetic material frequently lead to heritable changes (gene mutations, chromosome aberrations and nondisjunction), which may cause cancer, inherent and inborn diseases. It is suggested that primary damages may affect a phenotype until they are repaired or become mutations during inaccurate repair. The alpha-test on the yeast Saccharomyces cerevisiae can answer the fundamental questions as the nature of primary damages that can be phenotypically manifested, their occurrence, conversion to each other, and repair or conversion to heritable changes in genetic material.
Key words: primary damages to genetic material, alpha-test, Saccharomyces cerevisiae
Первичные повреждения генетического материала, их взаимопревращение и фенотипическое проявление Развитие многих заболеваний человека связывают с дестабилизацией генома. Ранее была обнаружена связь между рядом патологических состояний и мутационными изменениями определенных генов или накоплением в геноме хромосомных нарушений. Для успешного лечения и профилактики таких заболеваний необходимо изучать молекулярные механизмы контроля стабильности генома. Согласно физиологической теории мутационного процесса, которую в своих работах развил М. Е. Лобашев, возникновению мутаций предшествует пред-мутационное состояние [3, 4], которое по современным представлениям есть повреждение структуры ДНК, или первичное повреждение. Повреждения ДНК возникают в результате естественной химической нестабильности молекулы ДНК или под действием различных экзогенных и эндогенных факторов (ультрафиолетового и ионизирующего излучений, активных форм кислорода, промежуточных продуктов метаболизма, экзогенных химических веществ, ошибок белков репликации и репарации и других факторов). Повреждаться могут как азотистые основания, так и сахарофосфатный остов ДНК.
К числу наиболее частых повреждений относятся деза-минирование оснований, потеря пуриновых оснований с образованием апуриновых сайтов, метилирование оснований, поперечные сшивки цепей ДНК, одно- и двунитевые разрывы, причем часто может происходить взаимопревращение повреждений. Так, модифицированные основания или апуриновые
Степченкова Е. И. — канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. генетического моделирования болезней человека СПбФИОГен РАН, ст. науч. сотр. каф. генетики и селекции СПбГУ (stepchenkova@gmail. com); Коченова О. В. — аспирантка (olga.kochenova@unmc.edu); Жук А. С. — аспирантка (ania_zh@mail.ru); Андрейчук Ю. В. — студентка (yullinnabk@yandex.ru); Инге-Вечтомов С. Г. — акад. РАН, д-р биол. наук, проф., зав. каф. генетики и селекции СПбГУ, дир. СПбФИОГен РАН (ingcvechtomov@gmail.com).
сайты могут приводить к возникновению однонитевых разрывов, которые в свою очередь вызывают двунитевые разрывы [11]. Механизмы таких взаимопревращений хорошо изучены для некоторых повреждений, например при дезаминировании цитозина. Четыре из 5 оснований, присутствующих в ДНК (цитозин, аденин, гуанин и 5-мегилцитозин), содержат экзоци-клические аминогруппы, которые могут спонтанно теряться. Частота дезаминирования оснований зависит от температуры и кислотности. В результате дезаминирования аденина образуется гипоксантин, гуанина — ксантин, цитозина — урацил, метилцитозина — тимин. Некоторые из этих продуктов дезаминирования азотистых оснований могут приводить к мутациям при репликации, поскольку потеря аминогруппы в этих случаях сопровождается изменением кодирующих свойств основания. Например, урацил, возникший в результате дезаминирования цитозина, при репликации образует пары с аде-нином, что в следующем раунде репликации приведет к замене пары ГЦ на AT (рис. 1). Появление урацила в ДНК может приводить и к другим генетическим последствиям.
У всех организмов описаны ферменты, узнающие и вырезающие урацил из ДНК, у Е. coli — это белки, кодируемые генами ung и nfi. Белок Ung — гликозилаза, которая специфически узнает урацил в ДНК, а Nfi — эндонуклеаза, которая узнает не только урацил, но и гипоксантин и некоторые другие повреждения, в том числе апуриновые сайты, образующиеся благодаря активности гликозилазы Ung. После вырезания урацила под действием гликозилазы и эндонуклеазы в ДНК образуются однонитевые бреши, которые застраиваются ДНК-полимеразой и структура ДНК восстанавливается. Однонитевые разрывы, образующиеся в ходе репарации ДНК с урацилом, также вносят вклад в дестабилизацию генома. Появление однонитевых разрывов стимулирует рекомбинацию и может приводить к возникновению двунитевых разрывов (см. рис. 1) [ 10,20]. Существуют 2 модели возникновения двойных разрывов в ДНК с урацилом. Согласно одной из них, двойные разрывы возникают, когда происходит вырезание двух остат-
ков урацила, находящихся, вблизи друг друга в комплементарных цепях ДНК (рис. 2, а). Вторая модель предполагает, что двунитсвой разрыв возникает в том случае, когда вилка репликации достигает однонитевой бреши (промежуточного продукта репарации ДНК с урацилом). ДНК-полимераза не способна подставлять нуклеотиды напротив разрыва, происходит коллапс вилки репликации, синтез ДНК прекращается и на месте однонитевого разрыва возникает двунитевой разрыв (рис. 2, б) [18]. Двунитевые разрывы в случае ошибочной репарации ДНК посредством рекомбинационной репарации или прямого воссоединения концов могут приводить к возникновению генных мутаций и перестроек хромосом.
Аналогичный путь взаимопревращения повреждений и их закрепления в виде мутаций в ходе репликации, репарации или рекомбинации можно представить для многих мутагенных факторов, которые вызывают модификации оснований, узнаваемые системами репарации. Общим является то, что первичные повреждения, возникающие в клетке спонтанно или под действием различных экзогенных и эндогенных факторов, существуют в клетке какое-то время и могут вызывать повреждения других типов. В зависимости от типа повреждения ДНК они могут быть направлены по одному из путей репарации, при этом большая часть повреждений в ходе репарации устраняется безошибочно и структура ДНК полностью восстанавливается. В случае неточной репарации ДНК могут возникать ошибки — мутационные изменения генетического материала, результаты которых передаются последующим поколениям, а у человека часто являются причиной врожденных, наследственных и онкологических заболеваний [13].
Таким образом, генетические последствия первичных повреждений ДНК хорошо известны, роль мутаций (генных, хромосомных и геномных) в изменении фенотипических признаков точно доказана и не вызывает сомнений. Гораздо мень-
. Г. "U"
. г. 'У"
Репликация
Г_
Репликация Ц
У\\. Репликация' д
Мутация
ung, nfi
Репарация
_ Г.
.Г.
Ц"
Репарация' Репарация
-М-
N
Мутация
_Г_
Ц
Репарация'
_М_
N
Мутация
Рис. 1. Взаимопревращение повреждений, индуцированных при дезаминировании цитозина, и последствия их неточной репарации. А — адснин, Т — тимин, Г — гуанин, Ц — цитозин, У — урацил, М — любое азотистое основание, кроме гуанина, N — любое азотистое основание кроме цитозина. Слева — последовательные превращения первичного повреждения: модификация основания —► однонитевой разрыв —» двунитевой разрыв. * — пути ошибочной репарации, приводящие к мутациям и хромосомным перестройкам (на схеме не показаны).
ше известно о влиянии первичных повреждений на фенотип. Связь между конкретным повреждением определенного гена с изменением конкретного признака слабо изучена, хотя представляется очевидным, что наличие двунитевого разрыва или другого повреждения в струюурной или регуляторной части какого-либо гена должно препятствовать экспрессии этого гена и естественным образом отражаться на фенотипе. Особенно часто такая ситуация может иметь место в неделящихся дифференцированных клетках, в которых повреждения могут существовать длительное время, поскольку в неделящейся клетке не происходит репликация (синтез ДНК осуществляется только в ходе репарации), поэтому фиксация повреждений в виде мутаций в покоящихся клетках происходит гораздо реже, чем в делящихся клетках. В делящихся клетках повреждения генетического материала, особенно те, которые наиболее сильно нарушают матричные процессы, не могут существовать длительное время. Тем не менее возможны ситуации, когда повреждения могут экспрессироваться и в быстроделя-щихся клетках. На значение первичных повреждений в генах, экспрессируемых в "критические" периоды дифференцировки тканей в ходе эмбрионального развития, указывает высокая частота образования морфозов у D. melanogaster, индуцированных на определенных стадиях развития [5, 8].
В литературе есть данные, указывающие на возможность 45 фенотипического проявления повреждений [15], широко обсуждается роль повреждений в развитии рака и старении. Существует мнение, что одной из причин старения является накопление повреждений ДНК в различных клетках, например в нейронах [16, 25]. В связи с этим изучение данного вопроса представляет, фундаментальный и практический интерес. Недостаток надежных сведений о влиянии первичных повреждений на фенотип может быть вызван (помимо прочего) тем, что системы, позволяющие фиксировать фенотип первичных повреждений, слабо разработаны. В генетической токсикологии существуют сотни систем позволяющих фиксировать возникновение различных мутаций по их фенотипу (изменению окраски колоний микроорганизмов, тела или глаз дрозофилы, появлению устойчивости к какому-либо антибиотику, появлению реверсий, ауксотрофности или другим проявлениям). На практике для выявления мутационных изменений используют не более 20 тестов. Первичные повреждения ДНК также можно выявлять, но в основном физическими методами, которые не позволяют связать конкретное повреждение в определенном участке генома с изменением конкретного признака. Например, метод ДНК-комет (DNA-comet assay) — очень эффективный и удобный метод, который позволяет выявлять разрывы ДНК и определять их число в отдельных клет-
Коллапс первичной вилки репликации на однонитевом разрыве
Инициация вторичной вилки репликации на однонитевом разрыве
Образование структуры Холлидея
Разрешение структуры Холлидея
Рис. 2. Механизмы возникновения двунитевых разрывов при репарации ДНК с урацилом. Образование двунитевого разрыва при вырезании урацила в противоположных цепях ДНК (а). Образование двунитевых разрывов при репликации ДНК с однонитевой брешью — промежуточным продуктом вырезания урацила [18] (б).
ках [21], однако, используя этот метод, невозможно говорить ни о фенотипическом проявлении разрывов ДНК, ни о судьбе первичных повреждений. Мы предлагаем подход, который может способствовать решению этой проблемы.
Альфа-тест. Весьма перспективным методом для изучения механизмов возникновения, взаимопревращения и репарации первичных повреждений является альфа-тест у дрожжей ЗассЬаготусев сегеу151ас, который позволяет определять соотношение и абсолютные частоты возникновения первичных повреждений, генных мутаций, генной конверсии, ре-ципрокной рекомбинации, потерь плеча и целой хромосомы по фенотипическому проявлению этих нарушений в живых клетках [1, 6]. События, учитываемые в альфа-тесте, перекрывают практически весь спектр возможных генетических нарушений, которые происходят спонтанно и при воздействии генотоксических факторов. Таким образом, анализируя результаты альфа-теста, можно оценить эффективность и точность систем репарации, а используя эталонные мутагены на фоне дефектов различных систем репарации, можно изучить влияние специфических повреждений на фенотип. Систем, подобных альфа-тесту, которые позволили бы выявлять различные наследуемые изменения и первичные повреждения генетического материала, не существует.
В основе альфа-теста лежат особенности генетического контроля типа спаривания дрожжевых клеток. Гаплоидные штаммы дрожжей имеют один из двух типов спаривания — альфа или а. Клетки противоположных типов спаривания альфа и а могут образовывать гибриды — диплоидные клетки, не способные к дальнейшему скрещиванию, а нсскрещивающиеся диплоидные штаммы могут вступать в мейоз с образованием 4 гаплоидных спор: 2 спор альфа-типа спаривания и 2 — а-типа спаривания (рис. 3). В альфа-тесте о генетической активности изучаемого фактора судят по частоте переключения типа спаривания гаплоидных клеток гстсроталличных штаммов дрожжей БассИаготусез сегеу1з1ае альфа —»а. Для того чтобы оценить частоту переключения типа спаривания в альфа-тесте, 2 штамма одинакового типа спаривания (альфа) высевают на селективную среду, на которой могут расти только гибриды родительских штаммов, но не исходные штаммы. Через 2 дня совместной инкубации на селективной среде вырастают колонии — "незаконные" гибриды, частоту которых можно определить, отнеся число возникших гибридов к числу выживших клеток в тех же условиях. В норме возможна гибридизация клеток только противоположных типов спаривания. "Незаконное" спаривание или образование гибридов штаммов исходно одинакового типа спаривания альфа происходит с частотой 10"5—10*, которая возрастает при воздействии генотоксических факторов [12]. Такое "незаконное" спаривание происходит, если одна из спари-
Рис. 3. Жизненный цикл гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
а — альфа-тип спаривания.
вающихся клеток временно или необратимо переключает тип спаривания с альфа на а. Чем выше частота переключений типа спаривания альфа —» а, тем больше первичных повреждений возникает в этих условиях. Значительная часть повреждений ДНК устраняется системами репарации безошибочно — происходит восстановление структуры ДНК. При репарации повреждений могут происходить ошибки, что приводит к возникновению генных мутаций, перестройкам и потерям хромосом (см. рис. 1). Все эти события можно различить в альфа-тесте.
Есть веские основания считать, что к переключению типа спаривания приводят разнообразные нарушения, затрагивающие 3-ю хромосому, которая несет локус МАТ, определяющий тип спаривания дрожжей. В локусе МАТ могут находиться один из двух аллельных вариантов МАТ а или МАТа, которые и определяют а- и альфа-типы спаривания гаплоидных клеток соответственно. В локусе МАТа обнаружены две открытые рамки считывания (два гена): MATal и МАТа2. Гены МАТа1 и МАТа2 находятся под контролем общего двустороннего промотора. Продукт гена MATal индуцирует транскрипцию альфа-специфичных генов, определяющих альфа-тип спаривания, а продукт гена МАТа2 является негативным регулятором а-специфичных генов, определяющих а-тип спаривания. А-спсцифичные гены в клетках а-типа спаривания экспрессируются конститутивно, поскольку в них отсутствует активатор альфа-специфичных генов и ре-прессор а-специфичных генов. Поэтому при нарушении экспрессии МАТа по каким-либо причинам, приводящим к отсутствию продуктов обоих генов MATal и MATal, клетка приобретает фенотип а и способность скрещиваться с клетками альфа-типа спаривания [22, 23].
Суммируя данные о механизмах определения типа спаривания у S. cerevisiae, можно заключить, что тип спаривания дрожжевой клетки может меняться с альфа на а в случае следующих событий: при нарушении экспрессии обоих генов в МАТа в результате мутации или временной инактивации в случае повреждения структуры ДНК в МАТ, при утрате всей 3-й хромосомы или ее правого плеча вместе с локусом МАТа, в результате направленной конверсии МАТа из "молчащей" кассеты HMRa (локализован у правой центромеры 3-й хромосомы в МАТа при рекомбинации HMRa и МАТа. События, приведшие к смене типа спаривания альфа —► а, могут быть идентифицированы, если 3-я хромосома используемых штаммов маркирована несслсктивными маркерами, такими как H1S4 и LEU2 в левом плече и THR4 — в правом. Отмстим, что подобные исследования невозможны при "незаконной" гибридизации а * а, поскольку а-спсцифичные гены экспрессируются конститутивно. Поэтому при нарушении экспрессии МАТа переключение типа спаривания а —► а не происходит. Такое переключение возможно только в результате конверсии из HMLa —►МАТа или рекомбинации между HMLa —*МАТа [ 17].
Альфа-тест состоит из двух взаимодополняющих систем/ л"незаконной" цитодукции и "незаконной" гибридизации. Каждая система позволяет регистрировать только часть событий, приводящих к "незаконной" копуляции клеток. Цито-дуктанты — гаплоидные клетки, образовавшиеся в результате слияния цитоплазмы обоих штаммов, но сохранившие ядро штамма-реципиента, можно отобрать в селективных условиях, когда отбор ведется по ядерным и митохондриаль-ным маркерам [26, 27]. В системе "незаконной" цитодукции один из штаммов несет мутацию Aar/-/, блокирующую слияния ядер [9]. Наличие мутации karl-l увеличивает частоту "незаконной" цитодукции, но снижает частоту "незаконной" гибридизации. Поэтому для проведения альфа-теста в обоих вариантах необходимо использовать два штамма: в тесте на "незаконную" цитодукцию необходимо использовать штамм, несущий мутацию karl-l, а в тесте на "незаконную" гибридизацию - изогенный штамм дикого типа по ген)' KAR1. Анализируя фенотип "незаконных" цитодуктантов, можно различать генные мутации в локусе МАТи первичные повреждения, без-
HIS4 LEU2
HIS4 LEU2
ошибочно устраненные системами репарации, но успевшие проявиться фснотипически до спаривания. Такие цитодуктан-ты проявляют исходный тип спаривания — альфа.
В системе "незаконной" гибридизации можно учитывать события, сопровождающиеся потерей обширных участков хромосомы, их невозможно учитывать в системе "незаконной" цитодукции, поскольку цитодуктанты гаплоидны и такие изменения в гаплоидных клетках детальны. Единственное событие, которое можно выявлять в обеих системах — в цитодукции, и в гибридизации, — конверсия HMRa —* МАТа, приводящая к изменению типа спаривания. На рис. 4 перечислены события, учитываемые в альфа-тесте, а также фенотипы соответствующих "незаконных" цито-дуктантов и гибридов для случая, когда используют штаммы, несущие маркеры THR4 в правом и HIS4 в левом плече. Таким образом, параллельное проведение двух взаимодополняющих тестов на "незаконную" гибридизацию и "незаконную" цитодукцию позволяет учитывать широкий спектр генетических изменений.
Перспективы и ограничения альфа-теста. Эффективность альфа-теста для анализа генетической активности различных генотоксических факторов была продемонстрирована ранее. Испытания альфа-теста как системы для выявления мутагенов проводили в рамках международной программы International Programme on Chemical Safety. Было показано, что при определении генетической активности 10 известных канцерогенов, мутагенность которых не была установлена, тест на индукцию "незаконной" гибридизации оказался наиболее чувствительным (36% положительных ответов) по сравнению с классическими тестами на конверсию, реверсии и митотическую рекомбинацию (17—0% положительных ответов) [14]. Мы также показали, что "незаконную" гибридизацию и цитодукцию индуцируют ультрафиолетовое излучение, этилметансульфонат (ЭМС), этилнитрозомочевина, эндогенный 8-ок-согуанин [ 1 ]. Альфа-тест оказался эффективным при изучении дефектов системы обхода повреждений, осуществляемого специфическими ДНК-полимеразами [2]. Тем не менее до сих пор не проводили комплексное исследование генетической активности какого-либо мутагена в тестах на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию с полным анализом соотношения и частот возникающих генетических нарушений на изогенных штаммах. Подобные эксперименты необходимы как для дальнейшего совершенствования альфа-теста, так и для получения наиболее полной информации о механизмах действия изучаемых мутагенных факторов. Мы получили изогенные штаммы, которые позволяют параллельно проводить тесты на "незаконную" цитодукцию и "незаконную" гибридизацию [7].
При исследовании генетической активности различных мутагенов в систе-
ме "незаконной" цитодукции было показано, что доля первичных повреждений, безошибочно устраняемых системами репарации, варьирует от 60 до 90% для разных штаммов (см. таблицу), исключая хромосомные перестройки, которые при цитодукции не учитывают, поскольку они детальны в гаплоидных штаммах (см. рис. 4). До того как первичные
События, учитываемые в альфа-тесте
Первичные повреждения в МАЦ 1)
HMLa МАТа HMRa
THR4
Мутации в МАТа1 и M AT,,2 (1)
HML„ МАТа HMRa
HIS4 LEU2 4 Р THR4
Мутации в МАТа1 и МАТа2 или в двустороннем промоторе (1)
HMLa МАТа HMRa
THR4
Утрата 3-й хромосомы (2)
Утрата правого плеча 3-й хромосомы вместе с локусом МАТа (2)
HMLa
-m-i—i-o-
HIS4 LEU2
Рекомбинация между HMRa в МАТа (2)
HMLa
HIS4 LEU2
HMLa HMRa
—№11 I o-jgjgfl-
HIS4 LEU2
THR4
THR4
МАТа
Конверсия HMRa в МАТа (3) f-1
HMLa МАТа HMRa
—Ü04—»чНМ^ЬН*®-
HIS4 LEU2 Р THR4
Фенотип «незаконных» гибридов
a His+ Leu+ Thr+
а His+ Leu+ Thr+
а His+ Leu+ Thr+
a His- Leu- Thr-
а His+ Leu+ Thr-
a His+ Leu+ Thr-
a His+ Leu+ Thr+
Фенотип «незаконных» цитодуктантов
n/m
Alf
Леталь
Леталь
Леталь
Рис. 4. События, учитываемые в альфа-тсстс, и фенотипы "незаконных" гибридов и "незаконных" цитодуктантов.
Фенотипы цитодуктантов и гибридов приведены для случая скрещивания двух штаммов одинакового типа спаривания (альфа): тестерного штамма-реципиента цитоплазмы (МАТа Я/54.1Е112, ТНЧ4) и штамма- донора цитоплазмы (МАТа Ыз4, 1еи2, (Иг4). Маркеры Ыэ4 и 1еи2 находятся в левом, а маркер !Иг4 в правом плечах 3-й хромосомы. Классы (1) и (3) учитывают как в опыте по цитодукции, так и в опыте по гибридизации. При этом цитодуктанты класса (1) учитывают раздельно, поскольку их фенотипы различаются, а при гибридизации класс (1) учитывают суммарно, поскольку в этом случае фенотипы не различаются. Результаты событий, отмеченных (2), учитывают только при гибридизации, поскольку при цитодукции они летальны.
повреждения были устранены репарационными системами, они привели к переключению типа спаривания дрожжевой клетки на противоположный, т. е. произошло изменение фенотипа клетки, благодаря которому она смогла вступить в гибридизацию с клеткой альфа-типа спаривания.
Наши предварительные данные по изучению активности различных мутагенов в альфа-тесте позволяют сделазъ некоторые предположения о природе повреждений, выявляемых в этом тесте. При изучении в альфа-тесте двух аналогов оснований 6-гидроксил-аминопурина (ГАП) и 8-оксогуаннна (8-ОГ), которые вызывают мутации по сходному механизму в ходе репликации, нам удалось получить результаты, указывающие на существование различий в механизме действия этих мутагенов в альфа-тесте. ГАП и 8-ОГ — аналоги пуриновых оснований, которые могут участвовать в репликации наряду с природными нуклеотидами, индуцируя при этом замены оснований благо даря своей способности к амбивалентному спариванию [19,24].
Оказалось, что у мутантов по гену 0(7(7/, у которых происходит накопление эндогенного 8-ОГ в ДНК, наблюдается троекратное возрастание частоты "незаконной" цитодукции, что приблизительно соответствует возрастанию частоты мутирования у мутантов в тесте на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину. ГАП, который является сильным мутагеном для дрожжей, приводит лишь к небольшому, не более чем в 2 раза повышению частоты "незаконной" цитодукции. В этой же концентрации (50 мг/л) ГАП повышает частоту прямых мутаций устойчивости к канаванину более чем на порядок.
Обнаруженные различия можно объяснить следующим образом. Можно предположить, что ГАП в отличие от 8-ОГ не препятствует репликации и транскрипции в той же мере, что 8-ОГ. В этом смысле он не является первичным повреждением. Кроме того, известно, что ГАП у дрожжей не узнается ни одной из известных систем репарации, т. е. он не может индуцировать повреждения других типов — апуриновых сайтов, одно- и двунитевых разрывов. В отличие от ГАП 8-ОГ узнается системой репарации неспаренных оснований, при этом в ДНК происходит генерация однонитевых брешей и разрывов.
Таким образом, на основании наших данных можно предположить, что в альфа-тесте не выявляются такие первичные повреждения, как модификации оснований, по крайней мере ГАП, но, вероятно, мы можем наблюдать фенотипическое проявление однонитевых разрывов. Это не исключает возможность проявления других модификаций оснований, особенно таких, которые наиболее сильно блокируют репликацию и транскрипцию. Для проверки этого предположения необходимы дополнительные эксперименты по изучению генетической активности большего числа агентов, модифицирующих основания ДНК. С этим согласуются наши данные о высокой эффективности индукции "незаконной" гибридизации альфа
Соотношение наследственных и ненаследственных изменений типа спаривания
Изменения типа спаривания
Штамм Воздейетвие наследственные (а, а* и n/m), % ненаследственные (а), %
1-Д903 Без воздействия 16,7+0,8 83,3 ± 3,2
УФ 21 ±2,7 79 ± 5,3
ЭМС 7,0 ± 0,3 93,0 ± 3,0
ГАП 21,4 ±2,2 78,6 ± 4,3
oggl 29,4 ± 1,8 70,6 ±3,5
26Б-Д924 Без воздействия 33,2 66,8
УФ 44,1 55,9
Примечание. Жирным шрифтом выделены значения доли клас-
сов, которые достоверно отличаются от аналогичных значений для того же штамма, не подвергавшегося воздействию генотоксических факторов.
• альфа под действием УФ, ЭМС [1, 7], ингибитора геликазы камптомицина (неопубликованные данные). Из приведенного примера следует, что использование эталонных мутагенов может стать эффективным подходом для выявления природы первичных повреждений, способных проявляться фенотипически.
Согласно нашим теоретическим предположениям, ключевые события, учитываемые в альфа-тесте, затрагивают локус МАТ, контролирующий тип спаривания дрожжевой клетки, поскольку "незаконная" цитодукция и "незаконная" гибридизация почти полностью подавлены, когда в одном из копулирующих штаммов присутствуют две копии МАТа. В системе "незаконной" цитодукции с низкой частотой возникают стерильные цитодуктанты (n/m), подобно диплоидным гетерозиготам по локусу МАТ, не имеющие типа спаривания. Согласно литературным данным, у таких цитодуктантов нарушена экспрессия не обоих генов MATal и МАТа2, а только одного из них MATal или МАТа2. Показано, что мутанты matai не способны к спариванию, так как у них не экспрессируются ни asg, ни asg. Мутанты matai также стерильны, но в результате одновременной экспрессии asg и asg, как и в диплоидных клетках а/а. При этом экспрессия asg приводит к появлению некоторых признаков, характерных для клеток а-типа спаривания, например синтеза а-феромона и Ваг-фактора, разрушающего феромон а-фактор. Двойные мутанты matai mall проявляют рецессивный а-тип спаривания, как и мутанты по двустороннему промотору, расположенному между al и а2. Они также имеют Alf-фенотип (от a-like faker). Они ведут себя как клетки а-типа спаривания только в гаплоидном состоянии. В диплоидах они не кодоминантны аллелю МАТа, а рецессивны по отношению к нему. Поэтому такие диплоиды имеют тип спаривания а и не спорулируют [23].
Мы предполагаем, что стерильные цитодуктанты появляются в случае возникновения одновременно двух первичных повреждений в MATal и МАТа2, которые приводят к нарушению экспрессии обоих генов, и клетка приобретает тип спаривания а. После копуляции с клеткой типа спаривания альфа одно из повреждений устраняется, а второе фиксируется в виде мутации, и такая клетка становится стерильной. Для проверки этой гипотезы мы определили последовательность локуса МАТ у нескольких цитодуктантов, не способных к скрещиванию. У двух отобранных цитодуктантов n/m мы действительно обнаружили точковые замены, у одного из них в гене МАТа! и у второго в гене MATal. Это полностью соответствует опубликованным экспериментальным данным и сделанным на их основе теоретическим предположениям.
В то же время при секвенировании локуса МАТ у 8 других стерильных цитодуктантов мы не обнаружили никаких изменений в последовательности нуклеотидов МАТ. Тем не менее у этих цитодукгантов признак стерильности проявляется стабильно и наследуется в ряду клеточных делений. Очевидно, что первичные повреждения происходят по всему геному, в то время как мы учитываем изменения, в первую очередь инактивирующие МАТа. У дрожжей известно 15 генов, мутации в которых подавляют способность клеток к спариванию (10 генов STE, гены S1R3, SIR4, KSS1, FUS3 к ARG82) (http: www.yeastgenome.org). Не способные к спариванию цитодуктанты могут появляться, если первичные повреждения затрагивают одновременно МАТа и какой-либо из 15 генов, инактивация которых приводит к стерильности, с последующей репарацией МАТ и фиксацией мутации в гене STE. Для их идентификации не обязательно секвснировать локус МАТ. Достаточно трансформировать такие цитодуктанты дополнительной копией МАТа. Стерильные мутанты, возникшие в результате изменений иных генов, нежели МАТ, в этом случае должны остаться некопулирующими, в то время как мутанты matai и matai должны восстановить копуляционную активность. Действительно, при трансформации плазмидой с дополнительной копией МАТа тех цитодуктантов, для которых секвенированнем было доказано наличие нонсенс -мутации в одном из двух генов МАТа, оказалось, что трансформанты
приобретают тип спаривания альфа. При трансформации стерильных цитодуктантов, не несущих мутации в локусе МАТа, плазмидой с МАТа, трансформанты оставались стерильными. Таким образом, применение альфа-теста в варианте "незаконной" цитодукции открывает дополнительные возможности (по сравнению с "незаконной" гибридизацией) для анализа одновременных изменений в локусе МАТ и других генах. Изложение этих данных — предмет отдельного сообщения.
Таким образом, первичные повреждения генетического материала, учитываемые в альфа-тесте по фенотипическому проявлению, имеют различную природу. Наши данные указывают, что альфа-тест позволяет выявлять одно- и двуни-тевые разрывы ДНК, а также некоторые модификации оснований, например 8-ОГ. Мы показали, что с использованием альфа-теста можно учитывать различные события, происходящие не только в локусе МАТ, но и за его пределами. Полученные данные могут быть использованы для оценки числа повреждений, возникающих в геноме дрожжей за определенные промежутки времени, измеряемые в часах или клеточных делениях, а также оценивать равномерность распределения первичных повреждений в геноме.
Литература
1. Коченова О. В., Борхсениус А. С., Степченкова Е. И., Инге-Вечтамов С. Г. II Труды Биол. науч.-исслед. ин-та СПбГУ "Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в "Наукограде"". — 2008. — № 54. — С. 89—100.
2. Коченова О. В., Сошкина Ю. В., Степченкова Е. И. и др. // Биохимия. — 2011. — Т. 76, № 1. — С. 62—75.
3. Лобашев М. Е. О природе действия внешних условий на динамику мутационного процесса: Тезисы дис. д-ра биол. наук.— Л., 1946.
4. Лобашев М. Е. // Вестн. Ленингр. ун-та. — 1947. — № 8. — С. 10—29.
5. Рапопорт И. А. II Бюл. экспер. биол. — 1939. — № 7. — С. 415—417.
6. Репневская М. В. Наследуемые и ненаследуемые изменения типа спаривания у дрожжей ЗассЬаготусев сегеуЫае: Дис.... канд. биол. наук. —Л., 1989.
7. Степченкова Е. И., Коченова О. В., Инге-Вечтамов С. Г. // Веста. С-Петербург. ун-та. Сер. 3. — 2009. — Вып. 4. — С. 129—140.
8. <t>pu3en T. 11 Ehoji. »ypH. — 1935. — T. 4, № 4. — C. 687— 704.
9. Conde J., Fink G. R. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. — 1976. — Vol. 73, № 10. — P. 3651—3655.
10. Cow Y. W. II Free Radie. Biol. Med. — 2002. — Vol. 33, № 7. — P. 886—893.
11. Friedberg E. C., Walker G. C„ Siede W. et al. DNA repair and mutagenesis. — 2-nd ed. — Washington, 2006.
12. Hicks J. B„ Herskowitz I. II Genetics. — 1977. — Vol. 85, № 3. — P. 373—393.
13. Hoeijmakers J. H. II N. Engl. J. Med. — 2009. — Vol. 361, № 15. —P. 1475—1485.
14. Inge-VechtomovS. G. Pavlov Y. I., Noskov M. V. et al. // Progress in mutation research. — Amsterdam, 1985. — Vol. 5. — P. 243— 255.
15. Inge-Vechtomov S. G., Repnevskaya M. V. II Genome.— 1989.— Vol. 31, №2, — P. 497—502.
16. Johnson F. B„ Sinclair D. A., Guarente L. II Cell. — 1999. — Vol. 96, № 2. — P. 291—302.
17. Kassir Y., Simchen G. II Genetics. — 1976. — Vol. 82. — P. 187—202.
18. Kouzminova E. A. Kuzminov A. V. II J. Mol. Biol. — 2006. — Vol. 355. — P. 20—33.
19. Kozmin S. G., Schaaper R. M., Shcherbakova P. V. et al. Il Mutât. Res. — 1998. — Vol. 402, № 1—2. — P. 41—50.
20. Krokan H. E.. Drablos F., Slupphaug G. // Oncogene. — 2002. — Vol. 21, № 58. — P. 8935—8948.
21. Olive P. L.. Durand R. E.IIJ. Natl. Cancer Inst. — 1992. — Vol. 84,№9. —P. 707—711.
22. Siliciano P. G.. Tatchell K. // Cell. — 1984. — Vo!. 37. — P. 969—978.
23. StrathernJ.. Hicks J.. Herskowitz I. Hi. Mol. Biol. — 1981. — Vol. 147, —P. 357—372.
24. Thomas D„ Scot A. D. Barbey R. et al. II Mol. Gen. Genet. — 1997, —Vol. 254, №2, —P. 171—178.
25. von Zglinicki T.. Burkle A. Kirkwood T. B. II Exp. Gerontol. — 2001, —Vol.36. —P. 1049—1062.
26. Wright R. E„ Lederberg J. II Genetics. — 1957. — Vol. 43. — P. 919—923.
27. Zakharov I. A.. Yarovoy B. P. II Mol. Cell. Biochem. — 1977. — Vol. 14— P. 15—18.
nociymuia 12.04.11
© e. h. котышева, m. ю. бо.потская, 2011 удк 614.7:616-091-053.1-053.2-07
E. H. Котышева, M. Ю. Болотская
АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДЕТЕЙ С РАЗНЫМ ЧИСЛОМ ВРОЖДЕННЫХ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ
ГОУ ВПО Магнитогорский государственный университет
Изучали адаптационные возможности практически здоровых детей 6—7 лет в зависимости от числа врожденных морфогенетических вариантов. Наиболее выраженное снижение адаптационных возможностей выявлено у лиц с 5 В МТБ и более.
Ключевые слова: адаптационные возможности, врожденные морфогенетические варианты, вегетативная нервная система
Е. N. Kotysheva, М. Yu. Bolotskava — ADAPTIVE CAPACITIES OF CHILDREN WITH DIFFERENT NUMBER OF CONGENITAL MORPHOGENËTIC VARIANTS
Adaptive capacities were studied in 6-7-year-ol apparently healthy children in relation to the number of congenital morphogenetic variants (CMVs). The most markedly reduced adaptive capacities were revealed in children with 5 CMVs or more.
Key words: adaptive capacities, congenital morphogenetic variants, autonomic nervous system
Пренатальный морфогенез представляет собой основную "творческую" фазу индивидуального развития человека, реализацию генетической программы в трехмерном пространстве
и во времени под влиянием факторов окружающей среды [3]. Его нарушения являются базисом для отклонений в различных показателях здоровья, сниженной устойчивости к небла-
