CC BY
115
Жук А.С.1, Ширяева А.А.2, Коченова О.В.3, Андрейчук Ю.В.4, Степченкова Е.И.5, Инге-
Вечтомов С.Г.6 ©
1Аспирант, кафедра генетики и биотехнологии, Санкт-Петербургский государственный университет; Учреждение Российской академии наук Санкт-Петербургский филиал
института общей генетики им. Н.И. Вавилова; 2магистрант, кафедра генетики и биотехнологии, Санкт-Петербургский государственный университет;
3аспирант, Институт исследований рака им. Е Эппли Медицинского центра Университета штата Небраска, Омаха, США; 4аспирант, Университет Умео, Швеция;
5кандидат биологических наук, кафедра генетики и биотехнологии, Санкт-Петербургский государственный университет; Учреждение Российской академии наук Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Н.И. Вавилова;
6академик РАН, Доктор биологических наук, профессор, кафедра генетики и биотехнологии, Санкт-Петербургский государственный университет; Учреждение Российской академии наук Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Н.И. Вавилова
АЛЬФА-ТЕСТ - СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ФАКТОРОВ
Аннотация
Альфа-тест, основанный на «незаконном» скрещивании гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae одинокого типа спаривания альфа (а), разработан как система для выявления генетической активности факторов различной природы. Он позволяет регистрировать разнообразные наследственные изменения: генные мутации, потерю целой хромосомы, рекомбинационные события, а также первичные повреждения генетического материала, «безошибочно» устраняемые репараций. Высокая чувствительность этого метода была продемонстрирована с использованием эталонных мутагенов, таких как ультрафиолетовое излучение, аналоги оснований ДНК, алкилирующие агенты, камтотецин и др. Альфа-тест оказался эффективным подходом для изучения роли различных систем репарации в поддержании стабильности генома.
Ключевые слова: альфа-тест, генетическая токсикология, мутации, первичные повреждения ДНК, цитодукция
Keywords: alpha-test, genetic toxicology, mutations, primary DNA lesions, cytoduction
В большинстве стран мира, включая Россию, все новые лекарственные препараты, пищевые добавки, косметические и моющие средства и т.д. подлежат обязательному тестированию на мутагенность и канцерогенность. Цель такого тестирования состоит в снижении генотоксических рисков для будущих потребителей. В настоящее время в генетической токсикологии разработаны сотни тестов, но на практике чаще всего применяется не более 30 тест-систем, и только 8 из них стандартизированы и утверждены фармакологическим государственным комитетом (табл.1) [1, 50]. Для того чтобы повысить скорость и эффективность анализа большого количества потенциально опасных факторов, а также снизить затраты на проведение тестирования, разработана концепция поэтапного тестирования c использованием различных батарей тестов [2, 124]. Применяемые схемы тестирования могут варьировать в зависимости от тестируемого мутагенного или канцерогенного генетически активного фактора. Тесты первого этапа должны регистрировать генетическую активность агентов, вызывающих различные по своей природе изменения ДНК (точковые мутации, хромосомные аберрации, конверсию, реципрокную рекомбинацию и т.д.), поскольку на этом этапе тестирования важно в короткие сроки
© Жук А.С., Ширяева А.А., Коченова О.В., Андрейчук Ю.В., Степченкова Е.И., Инге-Вечтомов С.Г., 2013 г.
выявить генотоксичность агента как таковую, а не конкретную природу вызываемых им изменений в структуре генетического материала. Чаще всего, на первом этапе, используют тест Эймса, получивший наиболее широкое применение и ставший «золотым стандартом» генетической токсикологии. Мутагены, обнаруженные на первом этапе анализа в тестах с использованием микроорганизмов, подвергают всестороннему исследованию в тест-системах, позволяющих учитывать индукцию генетических нарушений в клетках млекопитающих in vitro и in vivo. На этом этапе применяют в основном цитогенетические методы для учета хромосомных аберраций и микроядер в соматических клетках млекопитающих, а также тесты для учета рецессивных мутаций, сцепленных с полом, летальных мутаций и соматической рекомбинации у дрозофилы. На заключительном этапе тестирования используют методы, регистрирующие генетическую активность тестируемого фактора в половых клетках млекопитающих, например, учет доминатных леталей у мышей. Большинство применяемых тест-систем способны выявлять генетическую активность не у любого генотоксического агента. Например, тест Эймса позволяет выявлять только те генетически активные факторы, которые индуцируют генные мутации, такие как, два типа транзиций (С^-Т и Т^-С) и мутации сдвига рамки считывания. Большинство генетических нарушений, выявляемых в генетических тест-системах, вторичны по своей природе и представляют собой результат «ошибочной» репарации ДНК, несущей первичные повреждения, такие как модификации и потери оснований ДНК, неспаренности нуклеотидов, циклобутановые димеры, одно- и двунитевые разрывы ДНК, поперечные сшивки двух цепей ДНК. В каждой клетке в физиологических условиях ежедневно возникают тысячи первичных повреждений ДНК. При воздействии генотоксических факторов их число возрастает на порядки. Для изучения последствий действия различных факторов, повреждающих ДНК,- и эффективности систем репарации необходимо обладать методами, выявляющими широкий спектр нарушений и позволяющими регистрировать как первичные повреждения ДНК, так и конечные результаты ее репарации - различные типы мутаций или события безошибочной репарации ДНК. К сожалению, универсальных методов, способных регистрировать все возможные классы изменений генетического материала, не существует. Поэтому при проведении подобных исследований можно использовать несколько различных тест-систем: те, которые регистрируют разнообразные наследуемые изменения
генетического материала, а также системы для учета первичные повреждения. К последним можно отнести метод ДНК-комет, который позволяет оценить количество двунитевых разрывов ДНК в отдельных клетках [2, 126]. Использование одновременно нескольких тестов значительно повышает стоимость проведения исследования. Кроме того, не всегда возможно сравнивать результаты, полученные в различных системах. С этой точки зрения может быть весьма перспективно использование метода, разработанного на кафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета, и получившего название альфа-тест [3, 2625]. Альфа-тест позволяет регистрировать широкий спектр генотоксических событий, таких как, генные мутации, хромосомные аберрации, рекомбинационные события, что делает его тест-системой «широкого» профиля. Уникальной особенностью альфа-теста является то, что с его использованием можно учитывать не только наследуемые изменения генетического материала, но также и первичные повреждения ДНК, устраняемые системами репарации «безошибочно». Эта особенность альфа-теста делает его удобным инструментом, позволяющим прослеживать судьбу первичных повреждений после репарации.
Генетическая система, лежащая в основе альфа-теста
При разработке альфа-теста были использованы особенности генетического контроля типа спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Гаплоидные штаммы гетероталличных дрожжей-сахарамицетов имеют один из двух типов спаривания а или а. В норме только клетки противоположных типов спаривания а и а могут скрещиваться, в результате чего образуются диплоидные клетки, не способные к дальнейшему скрещиванию [4, 34]. В редких случаях, с частотой 10-6 возможно скрещивание клеток исходно одинакового типа
спаривания, которая возрастает при воздействии генотоксических факторов. Это увеличение частоты «незаконного» скрещивания а х а является показателем генотоксической активности тестируемого фактора [5,129].
«Незаконное» скрещивание клеток а типа спаривания происходит только в том случае, когда одна из них сменила тип спаривания с а ^ а. К переключению типа спаривания у гетероталличных дрожжей приводят разнообразные нарушения, затрагивающие хромосому III. Поскольку именно хромосома III несет локус МАТ, контролирующий тип спаривания [4, 37]. В локусе МАТ находится один из двух альтернативных идиоморфов МАТа или МАТа, которые определяют тип спаривания дрожжевой клетки а или а, соответственно [4, 34]. МАТа кодирует два транскрипта МАТа1 и МАТа2, регуляция транскрипции которых осуществляется общим центральным двусторонним промотором. В клетках а типа спаривания, несущих идиоморф МАТа, продукт гена МАТа1 индуцирует транскрипцию а-специфичных генов, а МАТа2 репрессирует экспрессию а-специфичных генов. МАТа также кодирует два транскрипта МАТа1 и МАТа2, однако в регуляции типа спаривания у гаплоидов они не участвуют [4, 35]. В клетках а типа спаривания а-специфичные гены экспрессируются конститутивно. [4, 35]. Поэтому при нарушении экспрессии МАТа по каким-либо причинам, приводящим к отсутствию продуктов обоих генов МАТа1 и МАТа2 клетки, исходно имевшие тип спаривания а, приобретают фенотип рецессивный а (АИ^-фенотип) и способность скрещиваться с клетками а типа спаривания. Помимо локуса МАТ в хромосоме III расположены еще два локуса HMRa и HMLа, содержащих неэкспрессируемую генетическую информацию о типе спаривания а и а соответственно [4, 37]. Показано, что переключение типа спаривания с а ^ а, может происходить в результате однонаправленной конверсии кассеты HMRa в локус МАТа, реципрокной рекомбинации между кассетой HMRа и локусом МАТа, в результате потери целой хромосомы III или потери ее правого плеча вместе с локусом MA Та, а также делеций, точковых мутации или временных повреждении локусаMATа [3, 2626; 6, 425].
Согласно принятой модели альфа-теста первичные повреждения ДНК в локусе MATа нарушают его экспрессию, что приводит к временному переключению типа спаривания. Благодаря этому становится возможным скрещивание с клетками а типа спаривания. После гибридизации первичные повреждения ДНК в локусе МАТа могут быть устранены системами репарации безошибочно, либо закрепляться в виде наследуемых изменений генетического материала: генных мутаций или хромосомных аберраций (потери хромосомы III или ее правого плеча), первичные повреждения способны также инициировать конверсию и рекомбинацию [5, 130; 6 425].
Генетические события, учитываемые в альфа-тесте
Альфа-тест состоит из двух взаимодополняющих тестов: на «незаконную»
гибридизацию и «незаконную» цитодукцию. Параллельное проведение альфа-теста в обоих вариантах позволяет регистрировать все классы генетических событий, приводящих к скрещиванию клеток одинакового типа спаривания а, по фенотипу образовавшихся гибридов и цитодуктантов если оба плеча хромосомы III родительских штаммов маркированы (табл.2). В системе «незаконной» гибридизации можно выявить события, сопровождающиеся потерей обширных участков III хромосомы, такие как потерю хромосомы III или правого плеча хромосомы III вместе с локусом МАТа. Рекомбинация между кассетой HMRa и локусом МАТа приводит к образованию ацентрического фрагмента правого плеча III хромосомы, включающего в себя участок хромосомы между этими локусами, а также к переключению типа спаривания а ^ а в исходной клетке за счет транспозиции генетической информации из HMRa в локус МАТа. Гибриды, образовавшиеся в результате этого события теряют способность к дальнейшему спариванию, так как содержат оба варианта локуса МАТ - МАТа и МАТа. Система «незаконной» гибридизации позволяет также учесть конверсию генетического материала из кассеты HMRа в локус МАТа. Кроме того, в системе «незаконной» гибридизации можно учитывать суммарную частоту событий: генных мутаций, произошедших в двухстороннем промотере локуса МАТа или одновременно в
МАТаї и МАТа2, одиночных мутаций в МАТаї или МАТа2, и первичных повреждений, которые «точно» устранила репарация и которые не привели к возникновению наследуемых изменений генетического материала. Гибриды, образовавшиеся в результате этих генетических событий, имеют одинаковый фенотип (см. табл.2), поэтому различить генные мутации и первичные повреждения в системе «незаконной» гибридизации невозможно (табл.2).
Для того чтобы выявить и определить долю первичных повреждений, устраненных системами репарации безошибочно, а также закрепившихся в виде генных мутаций необходимо проводить альфа-тест в варианте «незаконной» цитодукции. Анализируя фенотип цитодуктантов можно разделить первичные повреждения, которые «безошибочно» устранились системой репарации, и мутации локуса МАТа (табл.2). В то же время, потерю хромосомы III, ее правого плеча и рекомбинацию нельзя учесть в тесте на «незаконную» цитодукцию, поскольку они летальны у гаплоидов, которыми являются цитодуктанты (табл. 2).
Таким образом, использование комбинации систем «незаконной» цитодукции и «незаконной» гибридизации позволяет различать частоту первичных повреждений ДНК, устраняемых «безошибочно» системами репарации (цитодуктанты класса а), и наследуемых изменений генетического материала, возникающих из-за «неточной» репарации первичных повреждений ДНК (все остальные классы гибридов и цитодуктантов) (табл.2).
Процедура проведения альфа-теста
В тестах на «незаконную» гибридизацию и цитодукцию используют два штамма одинакового а типа спаривания, несущих комплементарные селективные маркеры, позволяющие отбирать гибридов и цитодуктантов, а также маркеры в правом и левом плечах хромосомы III вблизи центромеры. Один из штаммов - тестерный штамм обрабатывают изучаемым мутагеном, а второй штамм служит партнером для скрещивания. Для того чтобы ограничить учитываемые события только теми, которые происходят в геноме тестерного штамма, в качестве партнера для скрещивания используют автодиплоидный штамм поскольку дополнительная копия локуса МАТа снижает частоту «незаконного» скрещивания [3, 2625]. Для параллельного проведения тестов на «незаконную» гибридизацию и цитодукцию используют штаммы с выровненным генотипическим фоном, обладающие рядом особенностей (табл.3). В отличие от штамма для «незаконной» гибридизации, тестерный штамм для цитодукции имеет дыхательную некомпетентность, рецессивную мутацию устойчивости к какому-либо антибиотику и мутацию kar1-1, нарушающую кариогамию. Благодаря этому в тесте на «незаконную» цитодукцию появляется возможность клонировать непосредственно ядро тестерного штамма, которое подверглось изучаемому воздействию и несло временное или мутационное изменение в локусе МАТа. Для определения молекулярной природы генетических событий, приведших к образованию «незаконного» гибрида или цитодутанта (табл.2), партнер для скрещивания маркирован мутациями ауксотрофности в обоих плечах хромосомы III, например, по генам: НШ4, расположенным в левом плече, и THR4, картированным в правом плече на участке между HMRа и МАТ. Тестерный штамм для «незаконной» гибридизации и цитодукции является прототрофным по гистидину и треонину. Примеры штаммов, применяемых в альфа-тесте, представлены в таблице 3. Характеристики применяемых в альфа-тесте штаммов и селективная система цитодукции подробно описаны нами ранее [3, 2625; 5, 131].
В тесте на «незаконную» гибридизацию родительские штаммы выращивают в жидкой среде YEPD при температуре 30°С в течение 16 часов и высевают совместно на селективную среду для отбора гибридов. В тесте на «незаконную» цитодукцию ночные культуры родительских штаммов концентрируют в 10 раз, а затем высевают совместно на твердую среду YEPD, инкубируют 48 часов, после чего перепечатывают на селективную среду для отбора цитодуктантов. В обоих тестах параллельно для оценки выживаемости высевают культуру тестерного штамма в соответствующем разведении на твердую среду YEPD. «Незаконные» гибриды вырастают на селективной среде на 2-3 сутки, а цитодуктанты на 7-
10. Для оценки частоты «незаконной» гибридизации и цитодукции в опытном и контрольном (без воздействия) вариантах подсчитывают количество гибридов, цитодуктантов, и выживаемость [5, 132]. «Незаконные» гибриды и цитодуктанты распределяют по классам по результатам проверки их фенотипа (см. табл.2), на наличие ауксотрофностей, а также проверки типа спаривания. Обработку мутагеном осуществляют разными способами в зависимости от применяемого мутагена. Например, при воздействии УФ-излучением, сначала проводят облучение тестерного штамма на твердой селективной среде для отбора гибридов, а потом подсевают штамм партнер для скрещивания. Химическими мутагенами клетки обрабатывают либо в жидкой среде на протяжении всего времени роста культур, либо кратковременно в фосфатном буфере непосредственно перед высевом на селективную среду.
Необходимые материалы
Жидкая среда YEPD содержит: 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза, в твердую среду YEPD добавляют 2% агар [7, 260]. Селективную среду для отбора гибридов готовят на основе минимальной среды MD (минимальная дрожжевая среда по рецепту Y east Nitrogen Base, 2% глюкоза, 2% агар) с добавлением аминокислот и азотистых оснований, необходимых для их роста [7, 263]. Среду для отбора цитодуктантов готовят на основе среды MD без глюкозы с добавлением этилового спирта - 20 мл/л, антибиотика циклогексимида - 5 мг/л, аминокислот и азотистых оснований, необходимых для роста штамма-реципиента цитоплазмы. Аминокислоты и азотистые основания добавляют в среду в следующих концентрациях: L-гистидин - 20 мг/л, L-лизин - 30 мг/л, аденин - 20 мг/л, урацил - 20 мг/л, L-треонин - 150 мг/л, L-лейцин - 60 мг/л, L-метионин - 20 мг/л. Для приготовления твердых сред используют агар фирм «Sigma» или «Difco» в концентрации 20 г/л.
Оценка эффективности альфа-теста
В альфа-тесте была протестирирована генетическая активность 10 известных канцерогенов, мутагенность которых не была показана ранее [8, 253]. Альфа-тест оказался более чувствительным (36% положительных ответов) по сравнению с классическими тестами на конверсию, реверсии и митотическую рекомбинацию у дрожжей (17 - 0 % положительных ответов) и обратные мутации (20% положительных ответов) [8, 254]. Было также показано, что эталонные мутагены 1,2,7,8-диэпоксиоктан, Р-пропиолактон, N-метил-№-нитро-М-нитрозогуанидин, 2-аминофлуорен, циклофосфамид, диэтилгексилфтолат, акрилонитрил и диэтилстильбестрол индуцируют «незаконную» гибридизацию [8, 246]. В тестах на «незаконную» гибридизацию и цитодукцию была продемонстрирована генетическая активность ультрафиолетового излучения (УФ), этилметансульфоната (ЭМС), эндогенного 8-оксогуанина (ОГ), 6-Ы-гидроксиламинопурина (ГАП), камптотецина, метилметансульфоната [5, 132; 9, 96; 10, 67]. УФ-излучение (20 Джм2) повышает частоту «незаконной» гибридизации и цитодукции у штамма дикого типа в 8 и 4 раза соответственно, при этом возрастают частоты всех классов генетических событий: потери хромосомы III, ее правого плеча, конверсии, рекомбинации, мутации и временные повреждения. Соотношение наследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала, индуцированных УФ, не отличаются от спектра спонтанных нарушений, учитываемых в альфа-тесте [10, 68; 11, 71]. Эти данные позволили предположить, что этот тип излучения пропорционально индуцирует временные и наследуемые изменения ДНК [9, 94]. Другие мутагены, такие как, ОГ, ГАП и ЭМС не только повышают частоту «незаконной» цитодукции, но и изменяют соотношение первичных повреждений, устраненных безошибочно системами репарации, и мутационных изменений, являющихся результатом неточной репарации первичных повреждений. Так, ЭМС снижает долю наследуемых изменений в локусе МАТа и увеличивает долю временных повреждений [9, 94], а ОГ и ГАП снижают долю временных повреждений и увеличивают долю наследуемых изменений за счет повышения частоты класса точечных мутаций. Приведенные примеры показывают, что альфа-тест является чувствительной тест-системой для выявления самых разнообразных изменений ДНК, как временных, так и наследуемых (точковые мутации, хромосомные аберрации и рекомбинационные события), индуцированных мутагенами с
разным механизмом действия. Кроме того, в альфа-тесте возможно изучение фенотипического проявления первичных повреждений ДНК, имеющих различную молекулярную природу: модификации нуклеотидов, разрывы ДНК, тиминовые димеры и др.
Помимо анализа генетической активности экзогенных мутагенов и канцерогенов альфа-тест показал высокую эффективность при изучении дефектов системы обхода повреждений, осуществляемого специфическими ДНК-полимеразами [11, 51]. С
использованием альфа-теста изучали индуцированный мутагенез при инактивации ДНК-полимераз PolZ, Pol п и Rev1, осуществляющих синтез ДНК в обход повреждений. Синтез в обход повреждений - мутагенный путь преодоления повреждений ДНК. ДНК-полимеразы Pol Z, Pol п и Rev1 менее точные по сравнению с репликативными ДНК-полимеразами, и основная их функция состоит в обеспечении выживания клеток при репликации на поврежденной матрице ДНК, при этом повреждение ДНК сохраняется. В альфа-тесте при инактивации PolZ, Pol п и Rev1 на фоне УФ облучения происходит снижение доли наследуемых изменений генетического материала и увеличение доли безошибочно устраненных первичных повреждений ДНК [11, 71]. Эти данные свидетельствуют о том, что на фоне отсутствия синтеза ДНК в обход повреждений происходит накопление первичных повреждений ДНК, а время их существования в клетках увеличивается [11, 72]. Повышение частоты потери хромосомы III и ее правого плеча при инактивации PolZ, Pol п указывает на то, что синтез в обход повреждения вовлечен в контроль поддержания стабильности хромосом [11,70]. При отсутствии синтеза в обход повреждения репарация поврежденной ДНК осуществляется по пути гомологичной рекомбинации, в результате чего снижается частота точковых мутаций (замен и вставок/выпадений единичных нуклеотидов), при этом возрастает частота потери хромосом. Мутации гена REV1 у различных организмов приводят к подавлению индуцированного мутагенеза. В альфа-тесте при инактивация гена REV1 происходит снижение частот как спонтанной, так и индуцированной УФизлучением «незаконной» гибридизации и цитодукции по сравнению со штаммом дикого типа [11, 73]. Это эффект может объясняться тем, что Rev1 помимо участия в синтезе обхода повреждений обладает дополнительными функциями [11, 62]. Известно, что Rev1 продуцируется в фазе G2 клеточного цикла и его инактивация приводит к изменению клеточного цикла, что влияет на способность клеток вступать в гибридизацию и, таким образом, приводить к снижению частоты «незаконной» гибридизации и цитодукции в альфа-тесте [10, 73]. Антимутаторный эффект Rev1, возможно, может быть использован для лечения некоторых видов рака, в основе которых лежит точковый мутагенез.
Таким образом, альфа-тест может быть использован для поиска и выявления широкого спектра генетически опасных факторов, вызывающих как мутационные и рекобиногенные, так и ненаследуемые изменения генетического материала. Альфа-тест также может быть применен для изучения фундаментальных механизмов становления мутаций. Применение в альфа-тесте эталонных мутагенов или блоков путей репарации, приводящих к накоплению первичные повреждения ДНК определенного типа, открывает возможность для изучения роли первичных повреждений ДНК в формировании наследуемых изменений генетического материала, а также точности систем репарации и механизмов поддержания стабильности генома. Альфа-тест также может быть использован для поиска химических веществ, обладающих антимутагенным и антиоксидантным эффектами.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 14.132.21.1325 и гранта РФФИ № 12-04-32104 мол_а.
Литература
1. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. 2000. М.: МЗ РФ. С. 47-61.
2. Dearfield K.L.,et.all - Genotoxicity risk assessment: a proposed classification strategy // Mutation Research - 2002. - № 521. - P. 121-135.
3. Инге-Вечтомов С.Г., Репневская М.В., Карпова Т.С. - Изучение скрещивания клеток
одинакового типа спаривания у дрожжей-сахаромицетов // Генетика - 1986. - Т 22 - №11. - С. 2625-2636.
4. Haber J.E. - Mating-type genes and MAT switching in Saccharomyces cerevisiae // Genetics - 2012. -V 191. - №1. - P 33-64.
5. Степченкова Е.И., Коченова О.В., Инге-Вечтомов С. Г. - «Незаконная» гибридизация и «незаконная» цитодукция у гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae как система для анализа генетической активности экзогенных и эндогенных факторов в «альфа-тесте» // Вестн. С.-Петерб. ун-та. - 2009. - Сер. 3. - Вып. 4. - С. 129-140.
6. Репневская М.В., Кашкин П.К., Инге-Вечтомов С.Г. - Модификационные изменения
генетического материала у дрожжей сахаромицетов // Генетика - 1989. - Т 25. - №3. - С. 425-
436.
7. Johnston J. R. Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. Oxford University Press, USA; 1-st edition. 1994. 312 p.
8. Inge-Vechtomov S.G., et.all - Tests for genetic activity in the yeast Saccharomyces cerevisiae: study of forward and reverse mutation, mitotic recombination and illegitimate mating induction. //In: Progress in mutation research - 1985. - V 5. - P 243-255.
9. Коченова О.В., Борхсениус А.С., Степченкова Е.И., Инге-Вечтомов С.Г. - Генетический
контроль типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae как основа разработки тест-системы (а-тест) для оценки генетической активности эндогенных и экзогенных факторов// Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в “Наукограде”.Сборник Трудов Биологического института - 2008. - № 54. - С. 89-100.
10. Степченкова Е.И., Коченова О.В,. Жук А.С., Андрейчук Ю.В,. Инге-Вечтомов С.Г. Фенотипическое проявление и взаимопревращение первичных повреждений генетического материала. учитываемых в альфа-тесте. у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Гигиена и санитария - 2011. - № 6. - С. 64- 69.
11. Коченова О.В., Сошкина Ю.В., Степченкова Е.И., Инге-Вечтомов С.Г.. Щербакова П.В. Участие ДНК -полимераз репликативного обхода повреждений в поддержании целостности хромосом у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Биохимия - 2011. - Т 76. - № 1. - С. 62-75.
Таблица 1
Тесты для выявления генетической активности химических веществ, утвержденные фармакологическим государственным комитетом
№ Тест-система Выявляемые изменения генетического материала
1. Тест Эймса Точковые мутации (транзиции и сдвиг рамки считывания)
2. SOS-хромотест на индукцию репарации у Escherichia coli Повреждения ДНК
3. Рецессивные, сцепленные с полом (в Х-хромосоме), летальные мутации у Drosophila melanogaster Генные мутации
4. Митотическая рекомбинация у Drosophila melanogaster Рекомбинация
5. Доминантные летали у мышей Генные мутации
6. Хромосомные аберрации в костном мозге млекопитающих Хромосомные аберрации
7. Образование микроядер в клетках млекопитающих Повреждения ДНК
8. Хромосомные аберрации в клетках периферической крови больных, подвергнутых действию препарата Хромосомные аберрации
Таблица 2
События, учитываемые в альфа-тесте, и фенотипы «незаконных» гибридов и «незаконных»
цитодуктантов
Генетическое событие Фенотип «незаконного» гибрида Фенотип «незаконного» цитодуктанта
Конверсия кассеты HMRa в локус МАТа n/m His+Thr+ а
Реципроктная рекомбинация между локусом МАТа и кассетой HMRa n/m His+Thr- леталь
Потеря правого плеча хромосомы III а His +Thr-
Потеря хромосомы III а His-Thr-
Мутация в локусе МАТа (в МАТа1 или МАТа2) а His+Thr+ п/т нескрещивающийся
Мутации в МАТа (одновременно в МАТа1 и МАТа2 или в двустороннем промоторе, делеции МАТа) а* рецессивный а
Временные (первичные) повреждения в локусе МАТа (одновременно в МАТа1 и МАТа2,или в двустороннем промоторе), устраняемые репарацией безошибочно после скрещивания а (альфа)
Примечание. Фенотипы цитодуктантов и гибридов приведены для случая скрещивания двух штаммов одинакового типа спаривания (альфа): тестерного штамма (МАТа ИІБ4 ТНЯ4) и партнера для скрещивания (МАТа his4 Лг4). Маркер his4 находится в левом, а маркер Лг4 в правом плечах хромосомы III.
Таблица 3
Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, применяемые в альфа-тесте
Штамм Генотип Применение
K5-35B-D924 MATa ura3A leu2A metl5A lys5::KanMX cyhr Тестерный штамм в системе «незаконной» гибридизации
K5-35B-D924 karl-1 MATa ura3A leu2A metl5A lys5::KanMX cyhr karl-l[rho~] Тестерный штамм в системе «незаконной» цитодукции
D926 MATa//MATa іє^Л/Лє^Л fys2Л//fys2Л ura3Л//ura3Л his4A// his4Л thr4A// thг4Л CYHs [rho+ ] Партнер дляскрещивания
