CC BY
81
Сидорская В.А.1, Опарина С.А.2, Кончина Т.А.3 ©
1Доцент, к.б.н., кафедра биологии, географии и химии; 2доцент, к.п.н., кафедра биологии,
географии и химии,
3
доцент, к.б.н., кафедра биологии, географии и химии.
ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Арзамасский филиал
ИНДУЦИРОВАННЫЙ СОМАТИЧЕСКИЙ МОЗАИЦИЗМ У НЕКОТОРЫХ ЛИНИЙ
DROSOPHILA MELANOGASTER
Аннотация
Рассмотрены возможности использования новых линий дрозофилы mus;mwh, ts;mwh, ts;mus;mwh в SMART - анализе для оценки мутагенов прямого и косвенного действии-этиленимина и диэтилнитрозоамина
Ключевые слова: дрозофила, SMART - анализ, большие и малые mwh -пятна, этиленимин, диэтилнитрозоамин.
Keywords: the drosophila, the SMART - analysis, mwh (multiple wing hairs), mytagenicity, ethyleneimine, dietilnitrozoamine.
Drosophila melanogaster - наиболее изученный в генетическом отношении объект среди многоклеточных организмов. Длительное использование её в генетических исследованиях объясняется наличием большого числа наследственных рас, позволяющих широко моделировать в генетических экспериментах, и метаболических систем, очень близких к млекопитающим, расшифрованным геномом. Результаты почти векового её изучения позволяют проанализировать весь спектр возможных мутаций и прогнозировать генетические ситуации, с которыми можно встретиться у других высших организмов. Полезность дрозофилы как тест - объекта является общепризнанной, она входит в батареи тестов для определения реальной и потенциальной мутагенной активности различных факторов.
Существует несколько традиционных методов оценки мутагенности химических и физических агентов, в которых тест - объектом является Drosophila melanogaster. Обнаружение и количественный учёт рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы проводится методом Мёллер-5 и CLB, локализация рецессивных леталей в аутосомах учитывается с помощью линий -анализаторов со сбалансированными леталями по второй и третьей хромосомам и инверсиям, например, CyL/Pm и D/Sb. В выявлении и определении частоты видимых мутаций и крупных делеций в X-хромосоме используется метод сцепленных X-хромосом. Для определения частоты возникновения анеуплоидных или с крупными хромосомными перестройками зигот применяется метод доминантных леталей. Мутагенность изучаемых соединений может быть оценена и по частоте потерь кольцевой X-хромосомы и ряду других тестов.
По мнению специалистов, для использования в скрининговых батареях явно предпочтительны тесты, связанные с изучением индукции соматического мозаицизма [1, 6, 7]. Спонтанная и индуцированная соматическая рекомбинация встречается не только у дрозофилы, но и у некоторых видов растений и животных. В настоящее время митотическая рекомбинация обнаружена в тканях человека. По-видимому, этот процесс распространен достаточно широко. Известно, что его протекание контролируется различными генетическими и негенетическими факторами, влияющими на степень его проявления и частоту.
© Сидорская В.А., Опарина С.А., Кончина Т.А., 2016 г.
По мнению некоторых авторов [1, 2, 3, 4], митотическая рекомбинация протекает почти с теми же закономерностями, что и мейотическая и осуществляется в ходе соматического спаривания гомологов и формирования хромоцентра в интерфазе - профазе митоза. Реципрокные обмены в митозе, возникающие без синапсиса и формирования синаптонемного комплекса, очень редки. Последовательность спаривания гомологов в митозе та же, что и в мейозе, за исключением образования связей между ними в прицентромерной области, где они в силу характера деления либо отсутствуют, либо исчезают до прикрепления нитей веретена к кинетохорам. Связь реализации митотических реципрокных обменов с конденсацией хромосом, с реорганизацией их структуры, предполагаемая по аналогии с мейотическим кроссинговером, характерна для большинства индуцированных после репликации хромосом перестроек.
Естественно предположить, что воздействие различных мутагенных факторов на соматическую ткань, гетерозиготную по рецессивным генам, вызовет появление гомозиготных (либо гемизиготных) по тому или иному гену клеток отнюдь не только из-за соматического кроссинговера, но и из-за соматических мутаций нормальных аллелей, делеций, элиминации хромосомы, несущей нормальный аллель. Морфозы также могут имитировать эффект действия мутантного аллеля, особенно для случаев изменения формы щетинок.
В мировой практике используется несколько тестовых систем, позволяющих изучать мутагенез в различных тканях сомы дрозофилы: тела - y/sn, глаз - w/w+ , w-z, w/wco , w/w1 и крыла - mwh/flr. Последняя получила широкое распространение в связи с её экономичностью и быстротой. Детальная разработка этого теста, получившего впоследствии название SMART (Somatic Mutation and Recombination Test) - анализа, принадлежит U. Graf и F. Wurgler [6]. В этом анализе используются крыловые маркеры: mwh (multiple wing hairs; 3-0,0) - рецессивная мутация, приводящая в гомозиготном состоянии к множественным трихомам на клетку вместо нормы - единичной трихомы; flr (flare; 3-39,0) - зиготическая рецессивная леталь, но гомозиготные (и возможно, гемизиготные) по этой аллели клетки в имагиальных дисках крыльев выживают и имеют уродливые короткие и утолщённые трихомы.
В настоящее время идёт поиск не принципиально новых тестовых систем, а усовершенствование уже имеющихся, позволяющих сочетать в себе объективную оценку возможной мутагенности вещества с укороченными сроками проведения анализа. U. Graf и F.E. Wurgler предприняли попытки повысить разрешающую способность своего метода с помощью конструирования на основе линий mwh и flr новых линий, содержащих в своём геноме или мейотическую мутацию mei-9L1, или замещённые 1 и 2 хромосомы из ДДТ -резистентной линии Oregon R. Результаты проведённых экспериментов были обнадёживающими и показывали повышенную чувствительность новых линий как к промутагенам, так и к мутагенам прямого действия [6].
Однако очевидно, что этих попыток в поиске оптимальных тест-систем явно недостаточно. Поэтому мы решили продолжить работу по конструированию новых тестсистем дрозофилы, стремясь решить следующие задачи:
1) повысить разрешающую способность SMART-анализа, как для прямых, так и для косвенных мутагенов;
2) упростить анализ и идентификацию пятен.
Поэтому для конструирования тестерных линий были выбраны мутагенчувствительный мутант - mus(2)201G1 и (или) температурочувствительный мутант l(1)ts403, которые заранее оказались более восприимчивы к отдельным факторам, и крыловой маркер mwh.
Классическая система SMART основывается на анализе одиночных пятен mwh и flr, а также двойных пятен mwh/flr у трансгетерозигот mwh+/+flr. Однако во всех многочисленных исследованиях с использованием этих линий мутагенный фактор статистически достоверно увеличивает частоту лишь одиночных пятен mwh, очень редко двойных пятен flr и
практически никогда одиночных пятен flr . Поэтому считаем, что недопроявление на организменном уровне мутации flr связано либо с ее повышенной летальностью, либо с ее слабой экспрессивностью в гомозиготных по этому аллелю клетках, и без цитологического анализа невозможно точно определить вклад генетических событий делеционно -мутационной или кроссинговерной природы в становлении одиночных пятен mwh и flr. Двойные пятна mwh/flr имеют кроссинговерное происхождение, но наблюдаемая частота ниже действительно происходящей все из-за того же недопроявления в клетках крыла маркера flr.
Исходя из вышеуказанных фактов о неоднозначности действия аллели flr и в связи со сложностью в интерпретации генетической природы пятен mwh и flr, нами решено маркер flr в своих тест-системах не использовать, оставить лишь мутацию mwh, имеющую нормальную жизнеспособность и чёткое фенотипическое проявление в виде множественности трихом в клетках крыла. Освободившись, с нашей точки зрения, от генетически малоинформативных flr-пятен и не всегда показательных mwh/flr, мы значительно упростили сам SMART-анализ. Таким образом, модифицированный SMART-анализ заключался в подсчёте только mwh пятен, которые ранжировались на малые (1-2 клетки) и большие (более 2 клеток).
Мутации mwh могли появляться у новых тестерных линий в результате делеций в дикой аллели локуса mwh, точковых мутаций, анеуплоидной потери хромосом или же быть следствиями кроссинговера.
С целью сделать вывод о чувствительности к разным мутагенным факторам новых систем, мы протестировали с их помощью два классических мутагена, различающихся по способу действия в клетке. Один из них - прямой мутаген - этиленимин, не требовал активации в клетке, другой - косвенный мутаген - диэтилнитрозоамин нуждался в биотрансформации. Мутагенность этиленимина в тестах на крыловой соматический мозаицизм изучалась в трёх концентрациях - 1%, 0,5% и 0,25% водного раствора, а диэтилнитрозоамина в двух - 5мМ, 2,5мМ водного раствора. Гетерозиготных мух на стадии личинки подвергали или острой обработке этиленимином, или хроническому воздействию диэтилнитрозоамином. Различие в обработке объясняется разным механизмом действия мутагенов в клетке. Так, этиленимин непосредственно сам воздействует на ДНК, этилируя атомы азота азотистых оснований нуклеиновых кислот, либо вызывая аберрационные изменения хромосом. Длительная экспозиция этого мутагена приводит к различным необратимым нарушениям клеточных процессов, например, препятствует кодирующей способности поли-А, поли-У, поли-Ц, подавляет синтез полипептида на рибосомах, ингибирует ферменты, участвующие в синтезе белка и др., что в конечном итоге вызывает гибель клеток. Эффективность же ксенобиотика диэтилнитрозоамина зависит от накопленных в клетке его активных (мутагенных) метаболитов, что, в свою очередь, связано и с активностью ферментов микросомального окисления, и с длительностью его экспозиции. В качестве фактора, модифицирующего первичный эффект мутагенов, использовался тепловой шок (t=+37oC) в течение 1 ч.
Используя критерий оценки чувствительности репаративных мутантов, предложенный F.E. Wurgler и др. [7], было проведено сравнение чувствительности новых тестерных линий со стандартной линией mwh/+, которое показало, что в индукции малых и общего числа пятен новые линии значительно превосходят традиционно используемую линию. По общей чувствительности к этиленимину и диэтилнитрозоамину в SMART-анализе тестируемые линии расположились следующим образом: ts; mus; mwh/+ > mus; mwh/+ > ts; mwh/+ > mwh/+.
Наиболее мутагенчувствительной оказалась линия, содержащая в своём геноме 2 мутации - l(1)ts403 и mus(2)201G1, она при одних и тех же дозах на 1,5 порядка увеличивала выход малых пятен по сравнению с контрольной линией. Такого огромного количества пятен не было зарегистрировано ни в одном из исследований, посвящённых вопросам соматического мозаицизма у дрозофилы. Причём отметим, что значительный рост
одиночных пятен mwh наблюдался при низких дозах мутагена - 0,25% концентрации
этиленимина и 2,5мМ концентрации диэтилнитрозоамина.
Анализируя эти результаты, можно предположить, что существует два типа клонов
клеток с разной пролиферативной активностью соответственно: эуплоидные, с нормальной
способностью к пролиферации, приводящие к возникновению больших одиночных пятен,
где основным генетическим событием является соматический кроссинговер, и
анеуплоидные, с низкой способностью к пролиферации, возникающие вследствие потери
части или целой хромосомы, и приводящие к появлению малых пятен. Оценивая с этих
позиций мутаген прямого действия - этиленимин и косвенного действия -
диэтилнитрозоамин, можно констатировать, что мутаген прямого действия приводит к более
серьёзным нарушениям генома, нежели ксенобиотик, причём интенсивность его
повреждающего действия в большей степени зависит от присутствия в генотипе мутации G1
mus(2)201
Метод соматического мозаицизма в качестве методологического приёма даёт возможность решать вопросы не только частного характера, а предполагает реальные подходы к исследованию важных проблем генетики и экологии.
Литература
1. Гурьев А.М., Белоусов М.В., Ахмеджанов Р.Р. и др. - Исследование мутагенных свойств водорастворимых полисахаридов аира болотного// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - № 8. - С. 43-45.
2. Суходолец Б.В. Функции кроссинговера // Генетика. - 1986. - № 4. - С. 2551-2560.
3. Чадов Б.Ф. Модель регуляции кроссинговера // Генетика. - 1997. - № 7. - С. 883-890.
4. Чубыкин В. А. Структура хромоцентра в ооцитах, инициация спаривания гомологов и регуляция формирования кроссоверных обменов у дрозофилы// Цитология. - 1995. - № 5-6. - С. 481-490.
5. Шварцман П.Я., Сандре З.А. Индуцированный соматический мозаицизм у дрозофилы как тест для оценки генетической активности факторов окружающей среды // Генетика. - 1975. - № 8. -С. 171-173.
6. Wurgler F.E., Graf U. Mutagenicity testing with Drosophila melanogaster // Basic and applied mutagenesis. - 1985. - V. 5. - P. 343-377.
7. Wurgler F.E., Frei H., Graf U. Mutagen-Sensitive Mutants and Chemical Mutagenesis in Drosophila // Chemical Mutagens/ Ed. De Serres F. J. - N. Y.: Plenum Press, 1986. - V. 10. - P. 381-416.
