CC BY
59
Аналогичные модели для показателей редких ВМГВ таковы:
У = 0,109 + 0,004 х Ксум (лаг = 7; Р = 4,82; р < 0,05);
У = 0,077 + 0,054 х Ксум металлов (лаг = 7; Р = 5,82; р < 0,05).
Заключение
Таким образом, исследование позволило выявить связь между отдельными химическими веществами, загрязняющими атмосферный воздух, и показателями ВМГВ. В процессе корреляционного анализа установлено, что основными токсикантами атмосферного воздуха, влияющими на показатели ВМГВ у организованных детей 4—7 лет, являются 3,4-бенз(а)пирен, кадмий, хром, никель; на показатели редких ВМГВ — многокомпонентная пыль, 3,4-бенз(а)пирен, свинец. Выявлено суммарное действие на показатели ВМГВ металлов, а также летучих атмосферных загрязнений (ароматические цик-
лические и полициклические углеводороды), на показатели редких ВМГВ — металлов. Показано, что преимущественное время воздействия поллютантов — концеп-тивный период, органогенез и ранний фетогенез.
Л итература
1. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. —
М., 2003.
2. Бочков И. П., Субботина Т. И., Яковлев В. В. и др. // Гиг. и сан. - 1994. - № 3. - С. 53-55.
3. Джамбетовс П. М., Молочаева Л. Г., Махтиева А. Б., Сычева Л. П. // Экол. генетика. — 2009. — Т. 7, № 4. - С. 34-40.
4. Котышева Е. Н. // Вестн. Новосибирск, гос. ун-та. Сер.: Биол., клин. мед. — 2007. — Т. 5, вып. 2. — С. 82—87.
5. Котышева Е. Н. // Гиг. и сан. - 2007. — № 6. — С. 86-88.
6. Ревазова Ю. А., Журков В. С., Жученко Н. А. и др. // Гиг. и сан. - 2001. - № 6. - С. 11-16.
Поступила 25.04.11
Методы обеспечения генетической безопасности
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011 УДК 615.9:575.113.08
А. К. Жанатаев, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин
МЕТОД ДНК-КОМЕТ В ГЕНОТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН, Москва
Метод ДНК-комет — современный высокочувствительный метод оценки первичных повреждений ДНК и репарации. Рассмотрены принцип и процедура выполнения метода ДНК-комет, его модификации для детекции различных типов повреждений ДНК. Обсуждаются перспективы его использования в качестве индикаторного теста при проведении эпидемиологических и различного рода экспериментальных и клинических исследований. Рассмотрены вопросы значимости метода ДНК-комет для экспертной оценки генотоксичности и прогноза мутагенности и канцерогенности.
Ключевые слова: метод ДНК-комет, генотоксичиость, мутагенность, ДНК-повреждения
А. К. Zhanatayev, A. D. Durnev, S. В. Seredenin. - DNA COMET ASSAY IN GENOTOXICOLOGICAL STUDIES
The comet assay is a current highly sensitive method to evaluate primary DNA damages and repair. The paper considers the principle and procedure of the DNA comet assay and its modification for the detection of different types of DNA damages. It also discusses the prospects of its use as an indicator test during epidemiological and a variety of experimental and clinical studies. Whether the DNA comet assay is of importance for the expert evaluation of genotoxicity and for the prediction of mutagenicity and carcinogenicity is considered.
Key words: DNA comet assay, genotoxicity, mutagenicity, DNA damages
Известно более 100 методов детекции мутаций, некоторые из них нашли практическое применение в программах оценки генотоксичности химических веществ. Менее разработана проблема регистрации первичных повреждений ДНК. До недавнего времени с этой целью применялись методы, в основе которых лежит принцип оценки целостности молекулы двунитевой ДНК; метод щелочной элюции, хроматографии на гидроксилапатите и т. п. [1, 6]. Они сыграли значимую роль в генотокси-ческих исследованиях. Стремительное расширение знаний о роли повреждений ДНК не только в процессах му-
Жанатаев А. К. — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. фармакологии мутагенеза (azhanataev@yandex.ru); Дурнев А. Д. — член-кор. РАМН, д-р мед. наук, проф., зав. лаб. фармакологии мутагенеза (adurnev@aport.ru); Середенин С. Б. - акад. РАМН, проф., дир. ин-та (пир-harrn@mail.ru)
тагенеза и канцерогенеза, но и в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки и гибели, лежащих в основе патологических состояний, определили необходимость оценки поврежденносги ДНК не только in vitro, а также in vivo — более чувствительным и специфическим методом [9, 45], пригодным для полиорганной оценки генотоксических эффектов, в том числе в приложении к изучению действия факторов, модифицирующих эффекты генотоксикантов[2].
В 1984 г. Остлингом и Йохансоном проведена оценка индуцированных радиацией повреждений ДНК в клетках млекопитающих методом электрофореза ДНК отдельных клеток в агарозном геле [36]. Они использовали подход, основанный на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в ага-розный гель. В основу метода лег принцип оценки целостности молекулы ДНК. Позднее Singh и соавт. предложили версию метода с щелочным гель-электрофорезом,
Получение стекол с подложкой из агарозы
Заключение клеток в гель и нанесение на стекла
Лизис ^
у, -ч-чг V Щелочная *
денатурация (рН>13,0) Электрофорез (pH 7,5)
Л
ш
пп
Электрофорез (pH >13,0)
Нейтрализация/фиксация
Окраска, микроскопирование,анализ
Рис. I. Принцип и процедура проведения метода ДНК-комет.
получившую впоследствии наибольшее применение! 14, 40).
Высокая чувствительность, применимость к любым клеткам, содержащим ДНК, оценка повреждений ДНК на уровне отдельных клеток, небольшое количество материала, необходимое для исследования, а также различные модификации, расширяющие возможности метода, обусловили перспективы применения этого метода, получившего название "метод ДНК-комет", в различных сферах генотоксикологических исследований.
Цель работы — рассмотрение принципа и процедуры выполнения метода ДНК-комет и его модификаций для регистрации различных типов первичных повреждений ДНК, а также его значимости для экспертной оценки ге-нотоксичности и прогноза мутагенности и канпероген-ности.
Принцип и процедура проведения метода ДНК-комет
Общая процедура выполнения метода включает получение гель-слайдов с подложкой из агарозы, внесение исследуемых клеток в агарозный гель и нанесение на гель-слайды, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, фиксацию/нейтрализацию, окрашивание и микроскопический анализ |5] (рис. I). В процессе лизиса под действием высоких концентраций солей и детергентов происходит диссоциация клеточных структур, депротеи-низированная ДНК заполняет образованную клеткой полость в агарозе. В нейтральной версии метода микропрепараты подвергают после лизиса электрофорезу в нейтральном буфере, в процессе которого ДНК в виде
нитей и петель двунитевой ДНК мигрирует в порах агарозы к аноду, формируя электрофоретический хвост (рис. 2). В щелочной версии метода дополнительный этап щелочной денатурации и электрофорез проводят в щелочных условиях (pH > 13,0). Во время щелочной денатурации ДНК переходит в однонитевую форму, ще-лочно-лабильные сайты реализуются воднонитевые разрывы. Во время электрофореза в том же буфере образовавшиеся однонитевая ДНК и фрагменты ДНК мигрируют к аноду, образуя хвост комет, в котором после нейтрализации/фиксации случайным образом ренатурируют в двунитевую ДНК. Таким образом, ДНК в хвосте комет при нейтральной версии представлена в виде нитей двунитевой ДНК, в щелочной версии — в виде петель и фрагментов двунитевой ДНК |8| (см. рис. 2). Микропрепараты окрашивают специфичными к ДНК флуоресцирующими красителями: этидиума бромидом, 4,6-диами-дино-2-дифенилиндолом (DAPI), SYBR Green I, YOYO-I и т. д.) — и микроскопируют с помощью флуоресцентного микроскопа.
В простейшем варианте непосредственно под микроскопом измеряют длину комет, диаметр головы и длину хвоста комет. Программно-аппаратный комплекс для анализа ДНК-комет включает совмещенную с микроскопом высокочувствительную CCD-камеру и специализированное программное обеспечение, что позволяет проводить цифровую регистрацию и обработку параметров ДНК-комет. В качестве показателя поврежденности ДНК используют длину хвоста, процентное содержание ДНК в хвосте (%ДНК в хвосте) или их произведение — момент хвоста (tail moment). Принимая во внимание, что показатель длины хвоста ДНК-комет в значительной степени зависит от экспериментальных условий (плотность агарозы, напряженность электрического поля, температура электрофорезного буфера и т. д.), для повышения воспроизводимости результатов, а также возможности сопоставления данных различных экспериментаторов, рекомендуется при оценке повреждений ДНК использовать показатель "%ДНК в хвосте" [14, 25].
Таким образом, в нейтральной версии метод ДНК-комет позволяет оценивать двунитевые разрывы ДНК, в щелочной версии одно- и двунитевые разрывы ДНК и щелочно-лабильные сайты. Вместе с тем возможности метода не ограничиваются оценкой разрывов ДНК как интегрального показателя поврежденности ДНК. При соответствующей модификации метод позволяет специ-
J»
Рис. 2. ДНК-кометы клеток костного мозга мышей.
а — нейтральная версия: 6 — щелочная версия. Окраска SYBR Green I; х200.
фично оценивать различные типы повреждений ДНК, значительно расширяя его применимость.
Модификации метода ДНК-комет
Модификация метода ДНК-комет для оценки поврежденных оснований в ДНК носит название Comet FLARE (Fragment Length Analysis using Repair Enzymes). Суть метода заключается в обработке ДНК лизирован-ных клеток на микропрепаратах специфическими ферментами репарации, которые вносят разрывы в ДНК в местах локализации поврежденных оснований [12|. Далее микропрепараты подвергают стандартной процедуре со щелочной денатурацией и электрофорезом и по разнице показателей для клеток, обработанных ферментом и только буфером для фермента, определяют относительный уровень поврежденных оснований.
С помощью фермента формамидопиримидин-ДНК-гликозилазы (Fpg) оценивают уровень окисленного гуанина (8-oxoGua, FapyGua), формамидопиримидинов — пиримидиновых оснований с разомкнутым кольцом, а также ряда алкилированных оснований (13, 15]. Применение гликозилазы hOGGl позволяет специфично определять 8-oxoG |41]. Разработаны протоколы для оценки в ДНК пиримидиновых димеров с помощью пиримидин-димер-гликозилаз (T4-PDG или cv-PDG) [16], 6,4-фото-продуктов с применением S. pombe UVDE и ошибочно спаренного урацила с использованием урацил-ДНК-гли-козилазы (UDG)|18|.
Разработан способ оценки методом ДНК-комет уровней метилирования ДНК. В этом случае используют чувствительную к метилированию внутреннего цитозина в последовательности CCGG рестриктазу Hpall и нечувствительную к этому типу метилирования рестриктазу Mspl |47|. После обработки ДНК лизированных клеток соответствующей рестриктазой определяют процент метилирования СрС-островков по формуле:
100 - (Hpall/Mspl) • 100),
где Hpall/Mspl — показатель "%ДНК в хвосте".
Проведенные эксперименты показали высокую сходимость результатов с данными, полученными традиционным методом оценки метилирования по включению меченого цитозина [47].
При соответствующей модификации метод ДНК-ко-мет позволяет определять повреждения ДНК типа сшивок ДНК-ДНК и ДНК-белок. В случае сшивок ДНК-белок ДНК лизированных клеток обрабатывают протеина-зой К, что увеличивает элсктрофоретическую подвижность ДНК в геле. По соотношению показателей с обработкой ферментом и без обработки определяют процентное содержание сшивок в ДНК |32|. Если надо оценить сшивки ДНК-ДНК, микропрепараты подвергают действию радиации или высоких концентраций перекиси водорода [23, 42|. Такая обработка увеличивает исходную поврежденность ДНК, при этом ДНК, содержащая сшивки ДНК-ДН К, в процессе электрофореза мигрирует в меньшей степени. По соотношению изменения подвижности контрольной и исследуемой ДНК после обработки вычисляют процент сшивок ДНК-ДНК [42[.
Все больший интерес вызывает модификация метода, совмещающая метод ДНК-комет и флуоресцентную гибридизацию in situ (Comet-FISH) [44|. Метод позволяет оценивать на уровне отдельных клеток способность ге-нотоксикантов специфично повреждать определенные участки ДНК. Так, в клетках миелоидного лейкоза мел-фалан вызывает преимущественно повреждения участка 5q31 хромосомы 5, тогда как этопозид вызывает и повреждения участка 5q3l и транслокации в участке 1 lq23 хромосомы 11 |20]. Эпителиальные клетки больных назофа-рингеальной карциномой показали повышенную чувствительность к индукции повреждений в хромосомах 3, 5
Рис. 3. ДНК-кометы апоптотических (а, обозначены *), цитотоксических (б, обозначены *) и некротических (в, указаны стрелкой) клеток. Окраска SYBR Green 1; х200.
и 8 бенз[а]пирен-диолэпоксидом по сравнению с клетками здоровых доноров |22]. Очевидны перспективы метода Comet-FISH как в фундаментальных генотоксико-логических исследованиях, так и в клинической практике для оптимизации противоопухолевой терапии |44|.
Оценка клеточной гибели
На микропрепаратах ДНК-комет часто выявляются атипичные ДНК-кометы с отсутствующей или практически отсутствующей головой и широким диффузным хвостом, получившие название "ghost cells", "clouds" или "hedgehogs" [34]. Такие ДНК-кометы выделяют в отдельную категорию и исключают из обшего анализа. ДНК в хвосте таких комет представлена в виде коротких дискретных фрагментов (рис. 3, а). Предполагают, что эти ДНК-кометы могут формировать апоптотические клетки, находящиеся на стадии фрагментации хроматина [34], что было подтверждено экспериментально |28, 49].
ДНК-кометы сходной морфологии выявляются при анализе клеток, подвергшихся действию цитотоксических агентов, например перекиси водорода (рис. 3, б). Механизм их возникновения неясен. Предполагают, что фрагментация ДНК возникает вследствие "дыхательного взрыва" и атаки ДНК активными формами кислорода [35]. Выявление таких ДНК-комет на фоне низкого общего уровня поврежденности ДНК свидетельствует о ци-тотоксическом эффекте [24]. ДНК-кометы некротических клеток имеют иную морфологию. Это широкие, часто неправильной формы ДНК-кометы, с трудно дифференцируемыми головой и хвостом (рис. 3, в).
Таким образом, одновременно с оценкой повреждений ДНК метод ДНК-комет позволяет оценить апопто-генную и цитотоксическую активность исследуемых агентов. Это имеет важное значение для решения проблемы исключения возможных ложноотрицательных результатов вследствие цитотоксического действия при оценке генотоксичности в цитогенетических тестах и тестах на индукцию генных мутаций [11, 21].
Оценка генотоксичности и прогноз мутагенности и канцерогенности
С разработкой метода ДНК-комет исследователи получили важнейший инструмент оценки генотоксичности in vivo и in vitro для прогноза мутагенности и канцерогенности. Многочисленными исследованиями показана высокая чувствительность метода ДНК-комет для оценки генотоксичности различных факторов [14, 43]. Наиболее показательно в этом плане исследование Sasaki и соавт. [38], в котором проанализированы результаты экспериментов по оценке методом ДНК-комет 208 химических соединений. Методом ДНК-комет у 110 из 117 известных канцерогенов-генотоксикантов выявлена гено-токсическая активность. Из 43 канцерогенов, которые не продемонстрировали мутагенную активность в тесте Эймса, у 21 в тесте ДНК-комет получен позитивный результат. Кроме того, из 54 канцерогенов, мутагенный эффект для которых не выявлялся в тесте на индукцию микроядер, 49 показали генотоксическую активность в методе ДНК-комет. Важно отметить, что методом ДНК-комет для ряда этих соединений генотоксическая активность была определена по индукции повреждений ДНК во "вторичных тканях", тогда как в костном мозге — традиционной ткани-мишени для цитогенетического анализа — эти соединения активности не проявляли.
Аналогичный аначиз приведен в работе Anderson и соавт. [10]. Авторы показали, что положительный результат в методе ДНК-комет выявляется для 74 из 84 канцерогенных факторов.
Особую важность при оценке генотоксичности и потенциальной канцерогенности представляет специфичность используемого теста в плане возможных ложнопо-ложительных результатов. Данный аспект особенно актуален при проведении исследований в системе in vitro [27]. По данным литературы, специфичность традиционных тестов на клетках млекопитающих не превышает 45% [28]. Сегодня экспериментальные данные позволяют оценивать специфичность метода ДНК-комет в пределах 60-80% [10, 38].
Эпидемиологические и клинические аспекты применения метода
На современном этапе все больше сведений указывают на самостоятельную патогенетическую роль первичных повреждений ДНК [45]. Их значимость отмечается не только в механизмах мутагенеза и канцерогенеза, но и в нарушениях пролиферации, дифференцировки и гибели клеток, т. е. процессов, лежащих в основе развития патологии любого генеза. Это определяет перспектив-
ность использования повреждений ДНК в качестве биологического индикатора при проведении эпидемиологических, генотоксикологических и санитарно-гигиенических исследований, при профилактике, диагностике и мониторинге терапии ряда заболеваний. Метод ДНК-комет находит все более широкое применение при проведении мониторинговых генотоксикологических исследований [17, 46]. Методом ДНК-комет получены экспериментальные данные, свидетельствующие о повышенном уровне повреждений ДНК при аутоиммунных, нейроде-генеративных, злокачественных и ряде других заболеваний [3, 26, 33]. Известны позитивные результаты по применению метода для оценки целостности ДНК в сперматозоидах в экспериментальных и клинических исследованиях [39]. Использование метода ДНК-комет позволяет дифференцированно оценивать одно- и двунитевые разрывы для каждого отдельного сперматозоида, что значительно повышает чувствительность и специфичность анализа по сравнению с традиционными методами оценки целостности ДНК [29]. Так, с помощью метода установлена связь уровня повреждений ДНК спермиев с фертильностью, аномалиями морфологии спермиев, невынашиванием беременности [30]. Перспективно применение метода ДНК в клинике для предикции индивидуальной чувствительности к противоопухолевой радио-и химиотерапии [31].
Закл ючен ие
Применение метода ДНК-комет в комплексе методов исследования генотоксичности значительно повысит чувствительность и специфичность оценки и позволит минимизировать вероятность получения ложноположи-тельных или ложноотрицательных результатов. Метод позволяет решить актуальную задачу оценки потенциальной генотоксичности in vivo — органо- и тканеспеци-фичность действия и дает возможность более детально исследовать патогенетическое значение повреждений ДНК.
Специалистами в области генотоксикологии выработано единое мнение о необходимости включения метода ДНК-комет в качестве индикаторного теста в систему экспертной оценки генотоксичности in vitro и in vivo [9, 19, 37, 48]. В России метод ДНК комет вошел в состав ряда методических рекомендаций и указаний [4, 7]. Методические аспекты выполнения метода подробно изложены в специальных методических рекомендациях [5].
Дополнительно следует указать, что область применения метода ДНК-комет не исчерпывается областью генотоксикологии. Имеются очевидные перспективы его использования в качестве индикаторного теста при проведении эпидемиологических и различного рода экспериментальных и клинических исследований.
Л итература
1. Абилев С. К., Порошенко Г. Г. // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер.: Токсикология. Т.14. — М., 1986.
2. Дурнев А. Д., Середенин С. Б. Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. — М., 1998.
3. Жанатаев А. К., Лисицына Т. А., Дурнев А. Д. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2009. - Т. 147, № 10. - С. 404 -408.
4. Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro: Метод, рекомендации. — М., 2010.
5. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Метод, рекомендации. — М., 2006.
6. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ // Гигиенические критерии окружающей среды, № 51. — Женева, 1989.
7. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности нанома-териалов: Метод, указания. — М., 2009.
8. A/anasieva K., Zazhyiska M., Sivolob A. // Electrophoresis. — 2010. - Vol. 31. N 3. - P. 512-519.
9. Albertini R. J., Anderson D., Douglas G. R. et al. // Mutât. Res.
- 2000. - Vol. 463. - P. 111-172.
10. Anderson D., Yu T. W., McGregor D. B. // Mutagenesis. — 1998.
- Vol. 13, N 6. - P. 539-555.
11. Blakely D., Galloway S., Kirkland D., MacGregor J. // Mutat. Res. - 2008. - Vol. 657. - P. 84-90.
12. Collins A. R., Duihie S. J., Dobson V. L. // Carcinogenesis. — 1993. - Vol. 14. - P. 1733-1735.
13. Collins A. R., Dusinska M., Horska A. // Acta Biochim. Polon.
- 2001. - Vol. 48. - P. 611-614.
14. Collins A. R., OscozA. A., Brunborg G. et al. // Mutagenesis. — 2008. - Vol. 23. N 3. - P. 143-151.
15. David-Cordonnier M. H., Laval J., O'Neill P. // Biochemistry.
- 2001. - Vol. 40. - P. 5738-5746.
16. Dusinska M., Collins A. // Altern. Lab. Anim. - 1996. — Vol. 24. - P. 405-411.
17. Dusinska M„ Collins A. R. // Mutagenesis. — 2008. — Vol. 23, N 3. - P. 191-205.
18. Duihie S. J., McMillan P. // Carcinogenesis. - 1997. - Vol. 18.
- P. 1709-1714.
19. Eastmond D. A., Hartwig A., Anderson D. et al. // Mutagenesis.
- 2009. - Vol. 24, N 4. - P. 341-349.
20. Escobar P. A., Smith M. T., Vasishta A. et al. // Mutagenesis.
- 2007. - Vol. 22. - P. 321-327.
21. Fellows M., O 'Donovan M., Lorge E., Kirkland D. // Mutat. Res.
- 2008. - Vol. 655. - P. 4-21.
22. Harréus U. A., Kleinsasser N. H., Zieger S. et al. // Mutat. Res.
- 2004. - Vol. 563, N 2. - P. 131-138.
23. Hartley J. M., Spanswick V. J., Gander M. et al. // Clin. Cancer Res. - 1999. - Vol. 5. - P. 507-512.
24. Hartmann A., Kiskinis E., Fjallman A., Suter W. // Mutat. Res.
- 2001. - Vol. 497. - P. 199-212.
25. Hartmann A., Agurell E., Beevers C. et al. // Mutagenesis. — 2003. - Vol. 18, N 1. - P. 45-51.
26. Hwang E. S., Kim G. H. // Toxicology. - 2007. - Vol. 229, N 1-2. - P. 1-10.
27. Kirkland D., Aardema M., Henderson L., Muller L. // Mutat. Res. - 2005. - Vol. 584. - P. 1-256.
28. Kirkland D., Pfuhler S., Tweats D. et al. // Mutat. Res. — 2007.
- Vol. 628. - P. 31-55.
29. Lewis S. E., Agbaje I. M. // Mutagenesis. - 2008. — Vol. 23, N 3. - P. 163-170.
30. Lewis S. E., Simon L. // Hum. Fertil. (Camb.). - 2010. — Vol. 13, N 4. - P. 201-207.
31. McKenna D. J., McKeown S. R„ McKelvey-Martin V. J. // Mutagenesis. - 2008. - Vol. 23, N 3. - P. 183-190.
32. Merk O., Speit G. // Environ. Mol. Mutagen. — 1999. — Vol. 33, N 2. - P. 167-172.
33. Migliore L., Fontana I., Colognato R. et al. // Neurobiol. Aging.
- 2005. - Vol. 26, N 5. - P. 587-595.
34. Olive P. L„ Banath J. P. // Exp. Cell Res. - 1995. - Vol. 221, N 1. - P. 19-26.
35. Olive P. L., Durand R. E. // Cytometry A. - 2005. — Vol. 66, N 1. - P. 1-8.
36. Ostling O., Johanson K. J. // Biochem. Biophys. Res. Commun.
- 1984. - Vol. 123, N 1. - P. 291-298.
37. Pfuhler S., Albertini S„ Fautz R. et al. // Toxicol. Sei. - 2007.
- Vol. 97, N 2. - P. 237-240.
38. Sasaki Y. F., Sekihashi K, Izumiyama F. et al. // Crit. Rev. Toxicol. - 2000. - Vol. 30, N 6. - P. 629-799.
39. Shamsi M. B., Venkatesh S., Tanwar M. et al. // Indian Jour. Med. Res. - 2010. - Vol. 131. - P. 675-681.
40. Singh N. P., McCoy M. T., Tice R. R., Schneider E. L. // Exp. Cell Res. - 1988. - Vol. 175. - P. 184-191.
41. Smith C. C., O'Donovan M. R., Martin E. A. // Mutagenesis. — 2006. - Vol. 21. - P. 185-190.
42. Spanswick V J., Hartley J. M., Hartley J. A. // Meth. Mol. Biol.
- 2010. - Vol. 613. - P. 267-282.
43. Speit G„ Hartmann A. // Meth. Mol Biol. - 2005. - Vol. 291.
- P. 85-95.
44. Spivak G. // Meth. Mol. Biol. - 2010. - Vol. 659. - P. 129-145.
45. Su T. T. U Annu. Rev. Genet. - 2006. - Vol. 40. - P. 187— 208.
46. Valverde M., Rojas E. // Mutat. Res. - 2009. - Vol. 681, N 1.
- P. 93-109.
47. Wentzel J. F., Gouws C., Huysamen C. et al. // Anal. Biochem.
- 2010. - Vol. 400, N 2. - P. 190-194.
48. IVine I.. Plappert U„ de Wall H„ Hartmann A. // Toxicol. Sei.
- 2007. - Vol. 97, N 1. - P. 21-26.
49. Yasuhara S., Zhu Y., Matsui T. et al. // J. Histochem. Cyto-chem. - 2003. - Vol. 51, N 7. - P. 873-885.
[Iocry 1111:1:1 25.02.11
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2011 УДК 614.7:575.224.4.086
И. Ю. Юров'-2, С. Г. ВорсановаИ. В. Соловьев', Ю. Б. Юров'-2-3
ОРИГИНАЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ОПРЕДЕЛЕНИЮ СПОНТАННЫХ ХРОМОСОМНЫХ МУТАЦИЙ В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ ДЛЯ ОЦЕНКИ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
'Учреждение РАМН Научный центр психического здоровья РАМН; 'ФГУ МНИИ педиатрии и детской хирургии Минадравсоцразвития, Москва; ^Московский психолого-педагогический университет
В настоящее время дм ансыиза хромосомных аномалий в соматических метках человека с целью оценки мутагенной активности факторов окружающей среды используют стандартные цитогенетические методы. Их применение связано с невозможностью анализа некультивируемых клеток. В связи с этим имеется острая необходимость разработки и внедрения методов исследования числа и структуры интерфазных хромосом. В работе представлен молекулярно-цитогенетический подход к определению спонтанных хромосомных мутаций в интерфазных клетках для оценки мутагенной активности факторов окружающей среды, основанный на оригинальных методах интерфазной флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) и многоцветового окрашивания хромосом, а также количественной FISH и иммуно- FISH. Тестирование предлагаемого комплекса методов проводили с помощью исследования 400 ООО, 200 ООО, 1 600 ООО клеток эмбриональных, экстраэмбриональных и постнатальных тканей соответственно. Получены данные относительно спорадических хромосомных мутаций, а также показано, что предлагаемый комплекс методов может быть с успехом использован djW оценки мутагенной активности факторов окружающей среды, приводящих к спорадическим хромосомным мутациям.
Ключевые слова: молекулярная цитогенетика; хромосомные аномалии, флюоресцентная гибридизация in situ, многоцветовое окрашивание хромосом, факторы окружающей среды
