CC BY
55
5. Сергеев А. В. Иммунофармакология и механизм действия неспеци-
фических противоопухолевых иммуномодуляторов: Дис.... д-ра мед. наук. — М., 1986.
6. Сергеева Т. И., Шелепова В. М., Привалова Э. Г. и др. //Вопр. мед.
химии. - 1992. - Т. 38, № 6. - С. 16-19.
7. Хабибулина В. М. Антимутагенные свойства бета-каротин-содержа-
щих препаратов: Дис.... канд. биол. наук. — Казань, 1996.
8. Шеренешева Н. Н., Филько В. Е. //Вопр. мед. химии. — 1992. — Т. 38,
№ 6. - С. 19-21.
© Коллектив авторов, 2001 УДК 616-006-018:616-092.9
Г. И. Дейчман, Л. М. Кашкина, В. А. Матвеева, Н. А. Дьякова,
Э. Я. Уварова
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ ТРАНСФОРМИРОВАННЫМИ IN VITRO И ОПУХОЛЕВЫМИ КЛЕТКАМИ: РАННИЕ СТАДИИ ЕСТЕСТВЕННОГО ОТБОРА IN VIVO
НИИ канцерогенеза
Роль иммунной системы в защите организма против опухолей является предметом интенсивного изучения на протяжении последних четырех десятилетий и более. Исследования в этой области, первоначально сфокусированные почти исключительно на механизмах специфического Т-клеточного противоопухолевого иммунитета, в последние 10—15 лет постепенно смещаются в область механизмов естественного (врожденного) противоопухолевого иммунитета, представленного такими эффекторными клетками, как моноциты, макрофаги (Мф), дендритные клетки (ДК) и НК-клетки, а также в область взаимодействия (и взаиморегуляции) врожденного и приобретенного противоопухолевого иммунитета.
Наши исследования в области естественного иммунитета начались около 20 лет тому назад и были направлены на изучение не столько его роли в защите организма против опухолей, сколько механизмов противостояния опухолевых клеток (ОК) этой системе, другими словами, на дискретные механизмы защиты ОК прошв цитотоксической активности (ЦТА) Мф и НК-кле-ток. Возможные механизмы такого противостояния и отбора OK in vivo по иммунорезистентности были рассмотрены нами в ряде обзоров [1,2, И]. В них подчеркивается двойственный характер участия эффекторов врожденного иммунитета хозяина в канцерогенезе и прогрессии опухоли in vivo, что проявляется как в исполнении защитных функций (повреждение и элиминация ОК), так и (в случае невозможности элиминации всех ОК) в отборе и репопуляции резистентных (и более злокачественных) вариантов ОК. В общебиологическом смысле эта ситуация аналогична любому цитотоксическому воздействию на популяцию OK in vivo (например, при химио- или лучевой терапии), также неизбежно ведущему к отбору резистентных вариантов ОК. Важным отличием и преимуществом ЦТА эффекторов врожденного иммунитета является их способность распознавать
9. Шлянкевич М. А., Дризе О. Б., Хабибулина В. М. и др. //Там же.
С. 23-25.
10. Chemoprevention in Cancer Control /Eds M. Hakama et al. //IARC Scintific Publication. — Lyon, 1996. — N 136.
11. Kelloff G. J., Boone C. W., Crowell J. A. et al. //Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. —1994. — Vol. 3. — P. 85—98.
Поступила 19.03.2001 / Submitted 19.03.2001
G.I.Deichman, L.M.Kashkina, V.A.Matveeva, N.A.Dyakova, E.N. Uvarova
PHENOTYPIC DISTINCTIONS BETWEEN IN VITRO TRANSFORMED AND NEOPLASTIC CELLS: EARLY STAGE OF NATURAL IN VIVO SELECTION
Institute of Carcinogenesis
The role of the immunity system in protection of the body from tumors has been an area of intense study over the last four decades. At first this study focussed almost exclusively on mechanisms of specific T-cell-mediated antitumor immunity, then during the last
10 to 15 years the focus shifted gradually to mechanisms of natural (hereditary) antitumor protection mediated by effector cells such as monocytes, macrophages (Mp), dendritic cells (DC) and NK-cells as well as towards interaction (and inter-regulation) of the hereditary and acquired antitumor immunity systems.
We started a study of natural immunity about 20 years ago and focussed on mechanisms of tumor cell (TC) resistance to the immunity, i.e. on discrete mechanisms of TC defense against Mp and NK cytotoxic activity (СТА), rather than on the role of the immunity in antitumor protection of the body. Possible mechanisms of the TC resistance and in vivo selection with respect to immunoresistance were described in several reviews [1,2,11]. These reviews emphasized dual character of the hereditary immunity effector contribution into in vivo initiation and progression of tumors as protection (TC damage and elimination) or (if total TC elimination is not possible) selection and repopulation of resistant and more malignant TC variants. In general biological sense this situation is similar to any cytotoxic effect on TC population in vivo (e.g. due to chemo- or radiotherapy) resulting in selection of resistant TC variants. The hereditary immunity effectors have the characteristic advantage of recognizing and eliminating transformed cells at early carcinogenesis stages, long in advance of tumor development.
The experimental background for this approach was found in published reports of several independent study groups demonstrating that (1) TC resistant to Mp and NK СТА are selected during in vivo growth [19]; (2) antioxidant activity is a mechanism of TC defense against cytotoxic products (Mp 'oxygen explosion' and H202) [21]; (3) TC-produced prostaglandins
и элиминировать трансформированные клетки на самых ранних этапах канцерогенеза, задолго до появления опухоли.
Исходной экспериментальной базой для такого подхода послужили данные литературы нескольких независимых групп авторов, показавших, что: 1) в процессе роста in vivo происходит отбор вариантов ОК, резистентных к ЦТА Мф и НК-кле-ток [19]; 2) одним из механизмов защиты ОК против цитоток-сических продуктов так называемого «кислородного взрыва» Мф и в первую очередь Н202, является их антиоксидантная ак~
} тивность [21]; 3) простагландины типа Е2 (ПГЕ2), продуцируе-j мые ОК, подавляют ЦТА НК-клеток [9,25]; 4) при искусствен-
ной диссеминации OK in vivo происходит массовая их гибель в первые 4—48 ч [ 18,22]; 5) редкие высокометастатические варианты ОК предсуществуют в исходной гетерогенной популяции ОК, обладают селективными преимуществами in vivo и отбираются при естественной диссеминации ОК [17].
Вышеприведенные данные были воспроизведены и подтверждены в наших исследованиях на ряде моделей ОК сирийского хомяка. При этом в отличие от авторов вышеприведенных работ мы считали, что наиболее ранние и, возможно, ключевые фенотипические изменения OK in vivo могут возникать на стадии, когда клетки, трансформированные in vitro (или in vivo), будут впервые подвергнуты селективному давлению in vivo. Поэтому в качестве основного исходного объекта для естественного отбора in vivo были взяты клетки, трансформированные in vitro, т. е. клетки, ранее не проходившие отбора in vivo.
Именно такой подход позволил нам впервые установить, что в процессе естественного отбора in vivo спонтанно трансформированные in vitro клетки линии ХЭТР приобретают способность защищать себя против ЦТА Мф и НК-клеток с помощью двух различных, но коэкспрессируемых механизмов: усиления Н202-катаболизирующей активности (Н202СА) и способности к выбросу ПГЕ2 (PGEs) при контакте с НК-клет-ками и Мф [12]. Способность ОК секретировать ПГЕ2 и подавлять ЦТА НК-клеток легла в основу разработанного Т. Е. Ключаревой, В. А. Матвеевой и Н. Е. Кушлинским [20] высокочувствительного биологического метода определения нативного PGE2. В самое последнее время в работе JI. М. Каш-киной было показано, что вариантные линии ХЭТР, отобранные in vivo и экспрессирующие [Н202са + PGES] фенотип в отличие от родительских клеток ХЭТР приобрели способность немедленно выбрасывать в среду не только PGE2, но и каталазу в ответ на определенные сигналы (Н202).
При исследовании большой коллекции клеточных линий одного происхождения нами впервые было установлено, что такие свойства, как (Н202СА) и (PGES) приобретаются О К в процессе естественного отбора in vivo одновременно, по-видимому, как кластер признаков, обеспечивающий их селективными преимуществами in vivo [10,12]. Было показано, что экспрессия [Н202СА + PGES] фенотипа стабильна на популяционном и клональном уровнях и коррелирует с 10—100-кратным увеличением уровня туморогенной активности (ТГА) ОК. Высокий уровень ТГА, приобретаемый в процессе отбора OK in vivo, по-видимому, частично обусловлен их способностью защищаться против ЦТА Мф и НК-клеток. Сотрудниками лаборатории Н. А. Лавниковой, Л. Г. Бурделя, Т. Е. Ключаревой и В. А. Матвеевой было показано, что экспрессия [Н202СА + PGES] фенотипа делает ОК резистентными к ЦТА Мф и НК-клеток [5—7]. Подавление PGES в таких
Е2 (PGE2) inhibit NK СТА [9,25]; (4) ТС artificial dissemination in vivo results in their mass death within 4-48 hours [18,22]; (5) rare highly metastatic TC types pre-exist in the initial heterogeneous population, possess selective advantages in vivo and are selected during TC artificial dissemination [17].
These findings were reproduced and confirmed in our studies on several Siberian hamster TC models. Unlike authors of the above-mentioned reports we believed that the earliest and probably key phenotypic in vivo changes in TC might occur at a stage when in vitro (or in vivo) transformed cells were exposed to selective pressure in vivo for the first time. Therefore we used in vitro transformed cells (i.e. cells that did not undergo in vivo selection previously) as a main object for natural selection in vivo.
Using this approach we discovered that STHE cells having undergone spontaneous transformation in vitro acquired during in vivo natural selection the ability to protect themselves from Mp and NK СТА by two different mechanisms, i.e. by enhancement of H202 catabolizing activity (H202CA) and PGE2 secreting (PGES), in contact with NK and Mp [12]. The TC ability to secret PGE2 and to inhibit NK СТА was a basis for development of a high-sensitivity assay of native PGE2 by T.E.Kluchareva, V.A.Matveeva and N.E.Kushlinsky [20]. L.M.Kashkina has demonstrated in her recent report that unlike their parent cells, in v/vo-selected STHE variants expressing [H202CA + PGES] phenotype acquire the ability to release immediately both PGE2 and catalase in response to certain signals (H202).
When studying a large collection of cell lines of the same origin we were the first to discover that TC acquire both the (H202CA) and (PGES) abilities during in vivo natural selection en block, as a cluster of signs ensuring their selective superiority in vivo [10,12]. It was demonstrated that the expression of [H202CA + PGES] phenotype was stable at populational and clonal levels and correlated with a 10-to 100-fold increase in TC tumorigenic activity (TGA). The high TGA acquired by TC in vivo seems to be due to their ability to protect themselves from Mp and NK СТА. NALavnikova, L.G.Burdelya, T.E. Kluchereva and YAMatveeva demonstrated that expression of [H202CA + PGES] phenotype rendered TC resistant to Mp and NK СТА [5-7]. Indomethacin-induced inhibition of PGES in such cells resulted in complete recovery of their sensitivity to NK СТА.
Since most of the above-mentioned findings were made for in vitro spontaneously transformed STHE cells the question arose whether transforming genes could induce [H202CA + PGES] phenotype expression as a result of in vitro transformation of normal cells. Of most interest were Syrian hamster cells undergoing in vitro transformation due to Rous sarcoma virus (RSV) because some investigators discovered previously that v-src-induced carcinogenesis was a single step process, and rat and hamster cells undergoing in vitro transformation due to RSV acquired maximum TGA and often spontaneous metastatic activity (SMA) without in vivo selection [8,23]. We carried out a laige series of experiments on 4 hamster cell lines transformed in vitro by RSV to find that all of them expressed [H202CA + PGES] phenotype and were highly tumorigenic without in vivo selection and three of them also demonstrated SMA [4,13].
Our further joint research with A.G.Tatosyan's laboratory [24] demonstrated that inhibition of v-src expression (pp60 and tyrosine kinase activity) due to N-ras transfection of three of the cell lines studied also led to inhibition of [H202CA + PGES] phenotype. This [H202CA + PGES] phenotype inhibition was complete
клетках с помощью индометацина полностью восстанавливает их чувствительность к ЦТА НК-клеток.
Поскольку большая часть вышеприведенных данных была получена при исследовании спонтанно трансформированных in vitro клеток линии ХЭТР, возник вопрос о способности известных трансформирующих генов индуцировать экспрессию [Н202са + PGES] фенотипа при трансформации in vitro нормальных клеток. В этой связи для нас в первую очередь наибольший интерес могли представлять клетки сирийского хомяка, трансформированные in vitro вирусом саркомы Рауса (ВСР), поскольку ранее другими исследователями было установлено, что канцерогенез, индуцируемый геном v-src, носит исключительный одноступенчатый характер, а клетки крыс и хомяков, трансформированные ВСР in vitro уже исходно, т. е. без отбора in vivo, обладают максимальным уровнем TIA и нередко способностью к спонтанной метастатической активности (СМА) [8, 23]. В большой серии опытов на 4 линиях клеток хомяков, которые мы трансформировали in vitro ВСР, было впервые установлено, что клетки всех этих линий экспрессируют [Н202са + PGES] фенотип и высокотуморогенны без отбора in vivo; три из них обладали СМА [4, 13].
В последующих наших совместных работах с лабораторией А. Г. Татосяна [24] было показано, что подавление экспрессии гена v-src (его ррбО и тирозин-киназной активности), возникающее при трансфекции клеток трех таких линий геном N-ras, одновременно приводило к подавлению экспрессии [Н202са + PGES] фенотипа. В зависимости от линии ВСР-трансфор-манта это подавление экспрессии [Н202са + PGES] фенотипа было либо полным, либо частичным; в последнем случае во всех исследованных клонах утрачивался только один признак
— PGES при сохранении (Н202са) [15, 24]. Таким образом, единственная ситуация, при которой имела место диссоциация признаков, входящих в [Н202СА + PGES] фенотип, была индуцирована трансфекцией гена ras в клетки v-src-трансфор-мантов и все события, связанные с подавлением [Н202СА + PGES] фенотипа и с диссоциацией признаков, входящих в этот фенотип, очевидно, происходили на путях передачи и пересечения сигнального пути, общего для генов v-src и ras. Такой диссоциации признаков [Н202СА + PGES] фенотипа не обнаружено ни в одном случае естественного отбора OK in vivo.
Далее в нашей совместной работе с М. А. Никифоровым и А. В. Гудковым (Иллинойский университет в Чикаго) клетки сирийского хомяка, клетки, трансформированные или транс-дуцированные рядом других генов (LTSV40, Ela;b, На-ras, myc, р53175 и bcl-2), были исследованы на экспрессию [Н202СА + PGES] фенотипа, ТГА и СМА; испытания были проведены до и в процессе естественного отбора вышеперечисленных трансформантов и трансдуцентов in vivo [16]. Всего в этой серии опытов было исследовано более 150 вариантных линий ОК различного генеза. Суммарные результаты этих исследований, представленные на рис. 1 (куда также включены данные, полученные ранее с клетками, трансформированными in vitro геном v-src или спонтанно), показали следующее:
1) трансформация (или трансдукция) клеток вышеперечисленными генами, так же, как и спонтанная трансформация in vitro, не приводит ни к экспрессии [Н202СА + PGES] фенотипа, ни к усилению ТГА; единственным исключением явились клетки v-src-трансформантов;
or partial depending upon RSV transformant lineage; in the latter case only one sign was lost (PGES) while (H202CA) was preserved [15,4,24]. Thus, the only situation with dissociation of [H202CA + PGES] phenotype signs was induced by ras transfection into v-src transformants, and all events related to [H202CA + PGES] phenotype inhibition occurred on intersection of the v-src and ras signal routs. This dissociation of [H202CA + PGES] phenotype was not found in any case of TC natural in vivo selection.
Further we performed a joint research with M. ANikiforov and A.V.Gudkov (University of Illinois, Chicago) to study Syrian hamster cells, cells transformed or transfected with some other genes (LTSV40, Ela,b, Ha-ras, myc, p53175 and bcl-2) for [H202CA + PGES] phenotype expression, TGA and SMA. The tests were carried out before and during natural selection of the above-mentioned transformants and transducents in vivo [16]. There were a total of 150 variant lines of different TC studied in this series. Fig.l summarizes results of this study (as well as previous findings made with cells undergoing in vitro v-src-transfor-mation. We discovered that (1) cell transformation (or transduction) by the above-mentioned genes as well as spontaneous transformation in vitro did not lead to either [H202CA + PGES] phenotype expression or TGA enhancement, the only exclusion being v-src transformant cells; (2) all the above-mentioned transformants and transducents (except v-src-transformants) acquired [H202CA + PGES] phenotype expression during in vivo selection at the stage of local (s.c.) growth with a 10- to 10-rise in TGA, with or without SMA. During in vivo growth the v-src-transfor-mants preserved the same levels of TGA and [H202CA + PGES] phenotype expression as before inoculation to animals; [H202CA + PGES] phenotype inhibition using non-toxic BCNU doses and indomethacin resulted in a next to 100-fold inhibition of the cells' TGA; (3) time needed by most transformants and transducents for in vivo selection of lines expressing [H202CA + PGES] phenotype was similar (i.e. did not depend upon transforming gene type) and reached 100-120 days. Polar exceptions were v-src-transformed cells that acquired [H202CA + PGES] phenotype expression during in vitro transformation and bcl-2-transduced cells whose in vivo selection was delayed significantly [3,16].
Basing on the above-mentioned experimental findings (1989-1998) the assumption was made that the [H202CA + PGES] phenotype expression acquired by TC during in vivo selection was a marker of a certain rather early (premetastatic) stage of tumor progression in vivo. This assumption opened new prospects to study early stages of cancer development and to answer the questions whether the TC selection in vivo at the stages of local growth and dissemination proceeded at different rates, and what effect bcl-2 expression produced on the TC in vivo selection pace and apoptosis inhibition.
To answer these questions we performed a study on parent cell lines STHE and STHE-bcl-2 as well as on 63 of their variant lines isolated both from locally (s.c.) growing tumors and from lungs of animals receiving intravenous inoculation of these cells (2-106 per hamster) (artificial dissemination model). A part of the STHE variant lines was derived from s.c. tumor-bearing animals (natural dissemination model).
As seen in table 1 none of 7 variant lines isolated from s.c. tumors within 55 to 70 days of growth from the STHE parent line expressed [H202CA + PGES] phenotype. While at 103 to 132
2) все перечисленные вше трансформанты и трансдуценты (кроме v-src-трансформантов) приобрели экспрессию [Н202СА +
PGES] фенотипа в процессе естественного отбора in vivo (в условиях локального, подкожного (п/к) роста); отмечено 10—100-кратное усиление их ТГА, сопровождаемое или не сопровождаемое СМА. Уровень ТГА и экспрессия [Н202СА + PGES] фенотипа v-src-трансформантов сохранялись при росте этих клеток in vivo на таком же высоком уровне, как до прививки клеток животным; подавление [Н202СА + PGES] фенотипа с помощью нетоксичных
I доз BCNU и индометацина приводило к существенному (почти í 100-кратному) подавлению ТГА этих клеток;
3) для большинства исследуемых трансформантов и трансду-центов время, необходимое для отбора in vivo вариантных линий,
! экспрессирующих [H202CA+PGEs] фенотип, было примерно одинаковым (т. е. не зависело от типа трансформирующего гена) и составило 100—120 дней. Полярные исключения составили клетки, трансформированные геном v-src, приобретающие экспрессию [Н202СА + PGES] фенотипа в процессе трансформации in vitro, и клетки, трансдуцированные геном bcl-2, отбор которых in vivo был существенно задержан [3,16].
Совокупность всех перечисленных экспериментальных данных (1989—1998) позволила рассматривать приобретенную ОК при отборе in vivo экспрессию [Н202са + PGES] фенотипа в качестве маркера определенной, сравнительно ранней (пред-метастатической) стадии опухолевой прогрессии in vivo. Есте-
I ственно, это открывает новые возможности для изучения ранних стадий процесса канцерогенеза и, в частности, таких вопросов, как: имеются ли различия в скорости отбора OK in vivo при их локальном росте и диссеминации? Какое влияние на скорость отбора OK in vivo оказывают экспрессия гена bcl-2 и соответственно подавление апоптоза?
Исследование этих вопросов было проведено нами на клетках родительских линий ХЭТР и ХЭТР-Ьс1-2, а также 63 их вариантных линий, изолированных как из локально (п/к) растущих
Таблица1 Table 1
Динамика отбора опухолевых клеток линий ХЭТР и ХЭТР-Ьс1-2 in vivo по [H202CA+PGEs] фенотипу при локальном росте и естественной и искусственной диссеминации
Rate of in vivo selection of STHE and STHE-bcl-2 cells by [H202CA+PGEs] phenotype during local growth and artificial dissemination
Способ получения линии in vivo ХЭТР X3TP-bcl-2
сроки отбора in vivo, дни экспрессия [H2OaCA+PGEs] фенотипа сроки отбора in vivo, дни экспрессия [Hz02CA+PGEs] фенотипа
Локальный рост (подкожный) Local (subcutaneous) growth Естественная диссеминация Natural dissemination Искусственная диссеминация Artificial dissemination 55—70 103—132 51—70 6 15 0/7 7/7 4/7 1/5 2/3 5/6 57 96-142 179—219 н. Д. 5 9 15-20 0/4 0/5 6/7 н. д. 0/4 0/3 0/4
Method of in vivo cell line days of in vivo selection [Hz02CA+PGEs] phenotype expression days of in vivo selection [H202CA+PGEs] phenotype expression
generation STHE STHE-bcl-2
Примечание. В числителе — число вариантов линий опухолевых клеток, экспрессирующих [H202CA+PGEs] фенотип, в знаменателе — число исследованных вариантов, н. д. — недостоверно.
Note. Numerals in the numerator are the numbers of tumor cell lines expressing [H202CA+PGEs] phenotype, numerals in the denominator are the numbers of variants studied; n.s., not significant.
(60) (120) (180) (240) (300)
Рис. 1. Трансформирующие гены (слева) и прогрессия опухоли in vivo.
Темные столбики — экспрессия [H202ca+PGEs] фенотипа; со штриховкой —ТГА (*50—100); звездочка — СМА. I, II, III, IV, V — циклы отбора, в скобках — время отбора, дни.
Fig. 1. Transforming genes (left) and tumor progression in vivo. Dark bars show [H202CA + PGES] phenotype expression; dashed bars showTGA (-50-100); *, SMA. I, II, III, IV, V, selection cycles, numbers in parentheses are days of selection.
days after s.c. inoculation of these cells (i.e. after two selection cycles) all the 7 STHE variant lines expressed [H202ca + PGES] phenotype. This means that time of selection by [H202CA + PGES] phenotype for cells from s.c. growing tumors is more than 70 days and is about 100 days (or a little longer).
The selection of STHE variants was much faster during natural dissemination from s.c. tumors with a time of growth 55 to 70 days. As seen in table 1,4 of 7 variant lines acquired [H202CA + PGES] phenotype expression. Differences in rates of [H202CA + PGES] phenotype acquisition between s.c. growing STHE cells and their variants disseminated into lungs were significant.
опухолей, так и из легочной ткани животных, инокулированных внутривенно (в/в) исследуемыми клетками (2 • 10б клеток на хомяка) (модель искусственной диссеминации). Часть вариантных линий ХЭТР была получена из легочной ткани животных-носи-телей п/к опухолей (модель естественной диссеминации).
Как видно из данных табл. 1, при локальном п/к росте клеток родительской линии ХЭТР в течение 55—70 дней ни одна из 7 вариантных линий, изолированных из п/к опухолевых узлов в этот период не экспрессировала [H202CA+PGEs] фенотип. Через 103—132 дня после п/к прививки этих клеток (т.е. после 2 циклов отбора) все 7 вариантных линий ХЭТР экспрессировали [H202ca+PGEs] фенотип. Очевидно, что для клеток п/к растущих опухолей этой линии сроки отбора по [H202ca+PGEs] фенотипу составляли больше 70 дней и были близки к 100 (или немного более) дням.
Значительное ускорение отбора вариантов ХЭТР отмечено при их естественной диссеминации из тех же опухолей, растущих п/к в течение 55—70 дней. В этот период 4 из 7 вариантных линий приобрели экспрессию [H202ca+PGEs] фенотипа (см. табл.1). Различия в скорости приобретения [H202ca+PGEs] фенотипа клетками п/к растущих опухолей ХЭТР и их естественно диссеминированных в легочную ткань вариантов являются значимыми.
Еще более поразительное ускорение в приобретении [H202ca+PGEs] фенотипа зарегистрировано нами в условиях искусственной диссеминации клеток линии ХЭТР, когда через 5 дней после их в/в введения отдельные варианты (1/5) этих линий уже экспрессировали [H202CA+PGEs] фенотип; суммарно через 10 и 15 дней пребывания in vivo 7 из 9 вариантных линий экспрессировали [H202ca+PGEs] фенотип.
Совершенно иные результаты (см. табл. 1) получены при отборе опухолевых клеток в п/к растущих опухолях линии ХЭТР-bcl-2, а также при искусственной диссеминации этих клеток. В первой серии опытов было показано, что отбор вариантов, экспрессирующих [H202ca+PGEs] фенотип весьма существенно замедлен при локальном росте этих клеток [16]. В отличие от других исследованных нами линий трансформированных клеток варианты ХЭТР-Ьс1-2, экспрессирующие [H202ca+PGEs] фенотип, были обнаружены в 6 из 7 исследованных вариантных линий лишь после 4 циклов отбора, т. е. через 179—219 дней их п/к роста in vivo (см. табл. 1). В отличие от вариантов штамма ХЭТР, изолированных при искусственной их диссеминации, ни один из 11 вариантов линии ХЭТР-Ьс1-2, извлеченных из легочной ткани в период 5—20 дней после в/в введения, не экспрессировал [H202CA+PGEs] фенотип [3].
Замедление скорости отбора in vivo клеток линии ХЭТР-bcl-2 (по сравнению со скоростью отбора in vivo клеток линии ХЭТР и других трансформантов), продемонстрированное в условиях как локального роста, так и их диссеминации, представляется парадоксальным. Общепринятое представление о том, какие свойства ОК могут определять их селективные преимущества in vivo, в частности при диссеминации и метастази-ровании опухоли, основано на допущении, что прежде всего они обусловлены лучшим выживанием in vivo отдельных редких вариантов ОК при преодолении ими множества естественных преград [ 18]. В этом случае экспрессия гена bcl-2 в ОК, обеспечивающая защиту от апоптоза и способствующая выживанию in vivo большего числа ОК, казалось бы, могла таким образом способствовать ускорению опухолевой прогрессии. Однако, по
We discovered a still more pronounced acceleration in [H202ca + PGES] phenotype acquisition in experiments with natural dissemination of STHE cells: some variants ( 1 /5) of these lines expressed [H202ca + PGES] phenotype already at 5 days after i.v. inoculation; 7 of 9 variants expressed [H202CA + PGES] phenotype after 10 and 15 days of in vivo existence.
Experiments with STHE-bcl-2 cells gave quite different results (see table 1). The first experimental series demonstrated a rather slow selection of [H202ca + PGES] phenotype expressing variants during local growth of tumors [16]. Unlike other transformed cell lines, [H202ca + PGES]+ STHE-bcl-2 cells were found in 6 of 7 variants after 4 selection cycles only, i.e. after 179-219 days of their s.c. growth in vivo (see table 1). While none of 11 STHE-bcl-
2 variants isolated from lungs at 5 to 20 days after i.v. administration expressed the [H202ca + PGES] phenotype [3].
This slow-down in selection in vivo of STHE-bcl-2 cells (against in vivo selection of STHE and other transformants) both during local growth and dissemination is paradoxical. The common concept of TC properties determining their selective superiority in vivo, in particular during tumor dissemination and metastasizing, is based on the assumption that this superiority is due to higher in vivo survival capacity of some rare TC variants that have to overcome many natural obstacles [18]. If so, bcl-2 expression by TC that provides protection from apoptosis and survival of a larger number of TC in vivo should accelerate tumor progression. However, our experiments demonstrated that the better survival of STHE-bcl-2 cells hampered in vivo generation and/or selection of rare STHE-bcl-2 variants expressing [H202CA + PGES] phenotype. It seems that the latter have a different type of in vivo selective superiority and cannot compete with STHE-bcl-2 cells dominating in the population. Theoretically, selective advantages of the STHE-bcl-2-[H202CA + PGES]+ cells may be effected in vivo only if one of the following conditions is satisfied: (1) in vivo selective advantages of STHE-bcl-2-[H202CA + PGES]+ cells are significantly greater than those of STHE-bcl-2, or (2) bcl-2 expression and related selective advantages are lost or decreased during in vivo tumor progression. We cannot say now which of these opportunities is effected during tumor progression from STHE-bcl-2 cells. It is possible that the same mechanism, i.e. high survival capacity and competitiveness of bcl-2 expressing TC, underlies the deceleration of in vivo selection of STHE-bcl-2 cells by [H202CA + PGES] phenotype and TGA in our experiments and in low-grade, slowly progressing human follicular lymphoma that is also associated with bcl-2 expression.
Basing on the above-mentioned findings the supposition was made that TC in vivo selection by [H202CA + PGES] phenotype was an artifact related to the use of in vitro transformed cell lines. Therefore we had to find out whether TC selection by [H202CA + PGES] phenotype occurred during primary carcinogenesis. Using the model of primary carcinogenesis induced by SV40 and SA7(C8) viruses in newborn hamsters we discovered that (1) development of SV40- and SA7(C8)-induced tumors always involved TC selection by [H202CA + PGES] phenotype, (2) TC generation and selection by [H202CA + PGES] phenotype started during latency and might end before development of first tumor nodes, (3) time of TC selection by [H202CA + PGES] phenotype during development of primary SV40- and SA7(C8)-induced tumors was 100-130 days, i.e. similar to that in s.c. growth and in vivo selection of cells having undergone in vitro transformation [16].
данньш наших опытов, видно, что лучшее выживание in vivo OK линии ХЭТР-Ьс1-2, наоборот, препятствует возникновению и/или отбору in vivo редких вариантов ОК ХЭТР-Ьс1-2, экспрессирующих [Н202СА +PGEs] фенотип. По-видимому, последние, имеющие иной тип селективного преимущества in vivo, оказываются неконкурентоспособными по сравнению с полностью доминирующими в популяции клетками ХЭТР-Ъс1-2. Теоретически селективные преимущества клеток ХЭТР-Ьс1-2-[Н,02са +PGEs]+ могут быть реализованы in vivo лишь при одном из двух условий: если селективные преимущества in vivo клеток ХЭТР-Ьс1-2-[Н202СА +PGES]+ будут существенно выше, чем у клеток ХЭТР-Ьс1-2, или если экспрессия гена bcl-2 и связанные с ним селективные преимущества будут при прогрессии опухоли in vivo утрачены или снижены. Мы пока не располагаем данными о том, какая из этих возможностей действительно реализуется при опухолевой прогрессии клеток линии ХЭТР-Ьс1-2. Возможно, что так же, как при фолликулярной лимфоме человека, связанной с экспрессией гена bcl-2 и относящейся к низкозлокачественным и медленно прогрессирующим новообразованиям человека, продемонстрированное в наших опытах торможение отбора in vivo клеток ХЭТР-Ьс1-2 по [Н202са +PGEs] фенотипу и ТГА обусловлено одним и тем же механизмом — высокой выживаемостью и, таким образом, конкурентоспособностью in vivo ОК, экспрессирующих bcl-2.
На основании приведенных данных было высказано предположение о возможно искусственном характере отбора OK in vivo по [H202ca+PGEs] фенотипу, связанном с использованием для этих опытов лишь трансформированных in vitro линий клеток. Поэтому возникла необходимость проверить, происходит ли отбор OK по [Н202са +PGEs] фенотипу при первичном канцерогенезе. На моделях первичного канцерогенеза, индуцируемого на новорожденных хомяках вирусами SV40 и SA7(C8), было впервые установлено, что: 1) процесс возникновения первичных опухолей SV40 и SA7(C8) обязательно включает отбор ОК по [Н202са +PGEs] фенотипу; 2) процесс возникновения и отбора OK по [Н202са +PGEs] фенотипу начинается во время латентного периода и может быть завершен еще до появления первичных опухолевых узлов; 3) скорость отбора ОК по [Н202СА +PGES] фенотипу при возникновении первичных опухолей SV40 и SA7(C8) составила 100—130 дней, т. е. была примерно такой же, как и при п/к росте и отборе in vivo клеток, трансформированных различными агентами in vitro [16].
Совпадение сроков отбора OK in vivo по [Н202СА +PGES] фенотипу при первичном канцерогенезе in vivo и при п/к трансплантации клеток, трансформированных in vitro, может означать, что последние на старте отбора in vivo были так же свободны от вариантов, экспрессирующих [Н202СА +PGES] фенотип, как клетки, трансформированные вирусами in vivo. Другими словами, варианты ОК, экспрессирующие [Н202СА +PGES] фенотип, по-видимому, не предсуществуют в исходной популяции трансформированных клеток, но возникают в процессе их роста in vivo и, обладая селективными преимуществами in vivo, постепенно замещают исходную популяцию ОК.
Определение [Н202са +PGEs] фенотипа в качестве маркера ранней стадии опухолевой прогрессии, а также приведенные данные об ускорении естественного отбора ОК в условиях их естественной и искусственной диссеминации позволили нам подойти к исследованию следующих вопросов: 1) какова степень
The similarity of times for in vivo selection by [H202CA + PGES] phenotype in primary in vivo carcinogenesis and after s.c. transplantation of in vitro transformed cells may mean that the latter were as free from [H202ca + PGES]+ variants at the in vivo selection start as cells undergoing in vivo virus-induced transformation. In other words, [H202ca+PGEs]+ TC variants are generated during in vivo growth rather than exist in initial population of transformed cells to gradually replace this initial TC population owing to their selective advantages in vivo.
Basing on the use of [H202ca + PGES] phenotype as a marker of early stage of tumor progression and the above-men-tioned findings of faster natural selection of TC during natural and artificial dissemination we tried to answer the following questions: (1) how great the in vivo selection pressure was as exerted on transformed cell population during s.c. tumor growth and dissemination, and (2) what happened with in vitro (or possibly in vivo) transformed cells during the first hours and days of their in vivo existence.
Survival in vivo of cells having undergone in vitro transformation and no in vivo selection during s.c. growth and dissemination should apparently depend upon degree of selective pressure: the higher the pressure the less percentage of surviving cells. According to our findings about 10% of transplanted cells can survive and build a s.c. node. If the same in vitro transformed cells are administered by i.v. route (artificial dissemination model, 125IUDR-labeled cells), only 0.1% (i.e. 100-fold less) of TC survive the first 48-72 hours. The same data for different models are reported by other authors [10,18,22]. Thus, in vivo selective pressure on in vitro transformed cells during their dissemination is much greater than during local growth. Comparison of these data with the rate of TC in vivo selection by [H202ca + PGES] marker phenotype for STHE cells (table 2) demonstrates that the 100-fold (or greater) increase in selective pressure on- the transformed cell population during dissemination as compared to local growth in vivo results in a 10-fold or greater acceleration in TC generation and/or selection.
It was interesting to find out whether there were differences between TC lines with high and low metastatic potentials in the ability to disseminate from s.c. tumors. In a separate series we determined the number of tumorigenic TC accumulated in lungs of animals bearing 6 lines of s.c. growing tumors with high and low metastatic capacity. We discovered no considerable differences between the lines compared: TC with both high and low metastatic potentials disseminated actively and were accumulated in lungs of tumor bearing animals at comparable amounts varying in individual animals from 1.0 to more than 100 TrD50 (50% of TC transplanted dose) during the period preceding appearance of macroscopic metastases (5-30 days after appearance of palpable masses) [14]. Thus, we discovered that there was no difference between TC with high and low metastatic potentials at the stage of dissemination from s.c. tumors in contrast to further growth in lung tissue when the difference became quite pronounced.
The significantly faster in vivo selection of TC during artificial dissemination and the possibility to isolate TC from lungs at any (including earliest) stage after i.v. administration of transformed cells allow the investigators to find out what happens with these cells during first hours and days of their in vivo existence.
To answer this question, STHE cell suspension (5.0*106/1.0 ml) was administered by i.v. route to a large group (>150) of normal
селективного давления in vivo на популяцию трансформированных клеток при их п/к росте и диссеминации ? 2) что происходит с клетками, трансформированными in vitro (и возможно, in vivó) в первые часы и дни их пребывания in vivol
Очевидно, что для клеток, трансформированных in vitro и ранее не проходивших отбор in vivo, их выживаемость in vivo при п/к росте и в условиях диссеминации будет определяться степенью селективного давления: чем оно выше, тем меньше будет процент выживших клеток. По нашим данным, основанным на результатах количественных трансплантационных тестов, при локальном росте ОК может выжить и построить п/к опухолевый узел примерно 10% из числа трансплантированных клеток. При в/в введении тех же трансформированных ш vitro клеток (модель искусственной диссеминации ОК, меченных 125IUDR) количество ОК, выживших в первые 48—72 ч, как правило, не превышает 0,1% (т. е. в 100 раз меньше), что совпадает также и с данными других авторов, полученными на других моделях [10, 18, 22]. Таким образом, очевидно, что степень селективного давления in vivo на популяцию трансформированных in vitro клеток при их диссеминации существенно выше, чем в условиях их локального роста. Сопоставление всех этих данных со скоростью отбора OK in vivo по маркерному [Н202са +PGEs] фенотипу на примере клеток линии ХЭТР (табл. 2) свидетельствует о том, что усиление в 100 раз (или более) селективного давления на популяцию трансформированных клеток при их диссеминации по сравнению с условиями их локального роста in vivo приводит к ускорению возникновения и/или отбора ОК соответственно в 10 раз (или более).
Представлялось интересным выяснить имеются ли различия между высоко- и низкометастатическими линиями ОК в способности естественно диссеминировать из п/к растущей опухоли. В отдельной серии наших опытов мы определили количество туморогенных ОК, накапливающихся в ткани легких животных-носителей 6 линий высоко- и низкометастатических п/к растущих опухолей. Показано, что существенных различий между сравниваемыми линиями нет: высоко- и низкометастатические ОК в период, предшествующий появлению макроскопически видимых метастазов (5—30 дней после появления
Syrian hamsters. At different intervals (day 1 to 20) after inoculation TC were isolated from macroscopically normal lung tissue, freed from normal cells (percoll gradient) and inoculated into tissue culture. Most (>60%) isolated TC were dead or dying in static state in vitro. About 30% of the cells started to divide and to form a monolayer after a cytostasis period of various duration. Time to death and minimal time of cytostasis were determined visually (double-blind approach) for every TC line isolated from lung tissue. After a monolayer tissue culture (3-5 in vitro passages) was produced, the variant cell lines were studied for [H202CA + PGES] phenotype expression, TGA and experimental metastatic activity (EMA) (fig.2).
Minimal time of cytostasis in vitro was 3 to 20 days and lasted the longer the shorter was the period of STHE cell in vivo existence after i.v. administration (till isolation from lung tissue in vitro). The time till proliferation recovery in vitro for the cells isolated from lung tissue at 1 to 20 days after inoculation is apparently related to time till cell proliferative recovery in vivo. Mean time till TC proliferation recovery in vitro was reducing gradually from 10 days if isolated within 2 days of in vivo existence to 4 days for cells existing in vivo for 14-20 days. Macroscopic TC colonies (experimental métastasés) were found in animal lungs on day 24-27 after i.v. inoculation of 5 • 106 STHE cells.
In a separate experimental series STHE cells were isolated from animal lungs at 1 h and 24 h after i.v. inoculation to be transferred to tissue culture and studied for 3H-TdR uptake. Thymidine uptake in cells isolated at 1 h after inoculation was reduced to 3% of that in intact control and could not be traced in cells isolated at 24 h after inoculation. Our findings concerning rate of proliferation recovery for STHE cells after different periods of in vivo existence (see fig.2) suggest that: (1) the few cells (<0.1 %) surviving first hours after i.v. inoculation enter deep and long-lasting cytostasis, (2) lethal and cytostatic effects of in vivo dissemination conditions on individual cells within first hours of their in vivo existence are single-shock events, (3) rates of repair and proliferation recovery for TC isolated from animal lungs are different in individual cells and seem to be related to degree of cell damage.
Table 2
Таблица 2
Степень селективного давления на клеточную популяцию in vivo в условиях локального роста и диссеминации (пример с клетками линии ХЭТР)
Degree of in vivo selective pressure on cell population during local growth and dissemination (STHE cells)
Условия отбора in vivo Количество введенных клеток Потери, %* Степень селективного давления** Скорость отбора, дни
Локальный рост Local growth 2,0-104 ~90 1,0 100—120
Диссеминация Dissemination 2,0-106 -99,9 100,0 <5—10
In vivo selection conditions No. of inoculated cells Percentage of loss* Degree of selective pressure** Days of selection
* Потери (в процентах по отношению к количеству введенных клеток) определяли по данным количественного трансплантационного теста для условий локального роста и по снижению количества 1251ШЯ-меченных клеток в ткани легких при диссеминации.
** Относительный показатель при сравниваемых условиях отбора опухолевых клеток in vivo, пропорциональный потерям.
*, Percentage of loss In relation to the number of inoculated cells was calculated basing on transplantation test findings for local growth conditions and by decrease in 125IUDR-labeled cells in lung tissue during dissemination.
**, a relative parameter proportional to the in vivo loss for the compared selection conditions.
пальпируемых опухолевых узлов), весьма эффективно диссеминируют и накапливаются в легочной ткани носителей опухолей в сопоставимых дозах, варьирующих у индивидуальных животных от 1,0 до более 100 TrD50 (50% трансплантируемых доз ОК) [14]. Таким образом, различия между высоко- и низкометастатическими линиями ОК не выявляются на стадии их диссеминации из п/к опухолевого узла, но становятся очевидными в процессе последующего роста высокометастатических ОК в легочной ткани.
Существенное сокращение сроков отбора OK in vivo при их искусственной диссеминации и возможности изоляции О К из ткани легких на любых, в том числе самых ранних, сроках после в/в введения животным трансформированных клеток открывает возможности для выяснения того, что происходит с введенными клетками в первые часы и дни их пребывания in vivo.
Для исследования этого вопроса большой группе (более 150) нормальных сирийских хомяков была в/в введена одноклеточная суспензия клеток линии ХЭТР (5,0 • 106 /1,0 мл на хомяка). В различные сроки после введения (1—20-й день) из макроскопически нормальной легочной ткани инокулированных животных ОК были извлечены, очищены от нормальных клеток (в градиенте перколла) и посажены в культуру ткани. В подавляющем большинстве случаев (более 60%) извлеченные ОК были либо мертвы, либо погибали in vitro, не выходя из состояния цитоста-зиса. Примерно в 30% случаев изолированные из ткани легких ОК после варьирующего в продолжительности периода цитоста-зиса начинали делиться, постепенно образуя монослой. Сроки гибели и минимальные сроки выхода из цитостазиса для каждой линии ОК, изолированной из легочной ткани, были зафиксированы визуальным (двойным слепым) методом. После сформирования однослойной культуры ткани (на 3—5-м пассаже in vitro) полученные таким образом вариантные линии были исследованы на экспрессию [Н202СА +PGES] фенотипа, ТГА и экспериментальной метастатической активности (ЭМА) (рис. 2).
Как видно из представленных данных, минимальные сроки выхода из цитостазиса in vitro линий ОК варьировали от 3 до 20 дней и были тем продолжительнее, чем короче был период пребывания клеток ХЭТР in vivo после в/в введения (до изоляции из ткани легких in vitro). Очевидно, что динамика восстановления пролиферации клеток исследуемых линий in vitro, изолированных в период с 1-го по 20-й день после введения, в определенной степени отражает динамику восстановления их пролиферативной активности in vivo в тот же период. Средние сроки восстановления пролиферации OK in vitro постепенно сокращались от 10 дней (в среднем) при изоляции в первые
2 дня пребывания in vivo до примерно 4 дней через 14—20 дней in vivo. Для клеток линии ХЭТР показано, что к 24—27-му дню после в/в введения 5 • 106 клеток в легочной ткани животных появляются макроскопически видимые колонии опухолевых клеток (экспериментальные метастазы).
В отдельной серии опытов клетки линии ХЭТР были изолированы из легочной ткани животных через 1 и 24 ч после в/в введения, помещены в условия культуры ткани и исследованы на включение ЗН-TdR. Показано, что включение тимидина в клетки, изолированные через 1 ч после введения, снижается до 3% от интакгного контроля и совсем не определяется в образцах этих клеток, изолированных через 24 ч после введения.
Данные по динамике восстановления пролиферации клеток линии ХЭТР после различных сроков их пребывания in vivo
1/10**
2/12
4/6
2/3
4/6
4/6
Рис. 2. Продолжительность периода цитостазиса клеток линии ХЭТР после отбора in vivo в течение 1—20 дней (экспрессия [H202CA+PGEs] фенотипа).
* время (в днях) после в/в введения клеток линии ХЭТР до их извлечения из легочной ткани индивидуальных животных и переноса в условия роста in vitro; ** в числителе — число вариантных линий опухолевых клеток, экспрессирующих [H202ca+PGEs] фенотип, в знаменателе — число исследованных линий.
Fig.2. Duration of STHE cell cytostasis after a 1 - to 20-day in vivo selection ([H202ca+PGEs] phenotype expression).
*, days from i.v. STHE cell Inoculation till isolation from lung tissue of individual animals and transfer to in vitro growth conditions; **, numerals in the numerator are the numbers of tumor cell lines expressing [H202ca+PGEs] phenotype, numerals in the denominator are the numbers of variants studied.
Of most surprise in this experimental series was discovery of [H202ca + PGES] phenotype expression on STHE cells isolated from lung tissue already at very early stage of in vivo existence. Of 22 TC lines isolated within the first 2 days following i.v. inoculation and studied in vitro after proliferation recovery, 3 already expressed [H202CA + PGES] phenotype. As to lines isolated from day 5-6 to 20, most of them were [H202CA + PGES] positive. TGA, EMA and SMA study of these lines immediately after proliferation recovery demonstrated that acquisition of [H202CA + PGES] phenotype was accompanied by a 5-50-fold increase in their TGA and EMA. 3 of 8 [H202CA + PGES]+ lines isolated on days 14-16 and 20 after i.v. inoculation were able of spontaneous metastasizing.
Conclusions. 1. The [H202CA + PGES] phenotype discovered by the authors seem to be an earliest (premetastatic) sign of natural selection of transformed cells in vivo including primary tumor latency. TC in vivo selective advantages associated with the [H202CA + PGES] phenotype expression manifest themselves as the ability to overcome СТА of host's natural immunity effectors.
2. Key events leading to enhancement of genetic instability and phenotype alteration of the transformed cells during natural selection in vivo are (a) sublethal damage of individual cells in the form of single-shock events, and (b) long-lasting cytostasis and proliferation recovery periods.
3. Only few of the damaged cells express [H202CA + PGES] phenotype after proliferation recovery, however they rapidly press out [H202CA + PGES] negative TC.
4. Rate of in vivo selection of cell variants by [H202CA + PGES] phenotype is directly related to degree of selective pressure
(см. рис. 2) свидетельствуют в пользу того, что: 1) уже в первые часы после в/в введения трансформированных клеток на фоне их массовой гибели немногие оставшиеся живыми (менее 0,1%) переходят в состояние глубокого и длительного цитоста-зиса; 2) летальное и цитостатическое действие на отдельные клетки условий диссеминации in vivo носит характер одноударного события, происходящего в первые часы пребывания клеток in vivo; 3) динамика репаративных процессов и восстановления пролиферативной активности ОК, изолированных из легочных тканей животных, носит индивидуальный характер, возможно, отражая степень их повреждения.
Наиболее удивительным результатом этой серии опытов оказалось обнаружение экспрессии [Н202СА +PGES] фенотипа клетками ХЭТР, изолированных из легочной ткани уже на самых ранних сроках пребывания in vivo. Из 22 линий ОК, изолированных в первые 2 дня после в/в ведения и исследованых in vitro после восстановления их пролиферативной активности, 3 линии уже экспрессировали [Н202СА +PGES] фенотип. В последующие сроки, начиная с 5—6-го и до 20-го дня, большинство изолированных линий экспрессировали [Н202СА +PGEs] фенотип. Исследование TIA, ЭМА и СМА этих линий сразу после восстановления их пролиферативной активности показало, что приобретение экспрессии [Н202са +PGEs] фенотипа в тех линиях, где это произошло, сопровождается 5—50-кратным усилением их ТГА и ЭМА. 3 из 8 линий, экспрессирующих [Н202са +PGEs] фенотип, изолированные на 14—16 и 20-й дни после в/в введения, оказались способными к спонтанному метастазированию.
Выводы. 1. Впервые описанный нами [Н202СА +PGES] фенотип, по-видимому, является одним из самых ранних (предметас-татических) проявлений естественного отбора трансформированных клеток in vivo, в том числе во время латентного периода развития первичных опухолей. Селективные преимущества ОК in vivo, связанные с экспрессией [Н202СА +PGES] фенотипа, определяются их способностью противостоять ЦТА эффекторов естественного иммунитета хозяина. 2. Ключевыми событиями, ведущими к усилению генетической нестабильности и изменению фенотипа трансформированных клеток в условиях естественного отбора in vivo, являются их сублетальное повреждение, по-видимому, носящее характер одноударного события на уровне индивидуальных клеток; длительный период цитостазиса и восстановления пролиферативной активности. 3. После восстановления пролиферативной активности лишь немногие из ранее поврежденных клеток экспрессируют [Н202СА +PGEs] фенотип, но в условиях продолжающегося отбора in vivo они быстро вытесняют варианты ОК, не экспрессирующие [Н202СА +PGES] фенотип. 4. Скорость отбора in vivo клеточных вариантов по [Н202са +PGEs] фенотипу находится в прямой зависимости от степени селективного давления на популяцию ОК; в условиях диссеминации скорость отбора ОК, как и масштабы их гибели, существенно больше, чем в условиях их локального роста. 5. Среди различных типов трансформирующих генов (v-src; LTSV40: Ela, Ъ; Ha-ras; р53175; myc; bcl-2) только v-src обладал способностью индуцировать экспрессию [Н202са +PGEs] фенотипа в процессе трансформации клеток in vitro. Это позволяет рассматривать экспрессию [Н202СА +PGES] фенотипа, приобретаемую при отборе in vivo другими типами трансформированных in vitro клеток, как вторичное, src-подобное изменение, возможно, обусловленное активацией гена c-src.
on TC population; TC selection proceeds faster and more cells die during dissemination than during local growth.
5. Among different types of transforming genes (v-src, LT-SV40: Ela, b; Ha-ras; p53175; myc; bcl-2) v-src alone is able to induce [H202CA + PGES] phenotype expression during in vitro cell transformation. This finding suggests that the [H202CA + PGES]+ phenotype acquired during in vivo selection by other cell types having undergone in vitro transformation is a secondary scr-like modification which seems to be associated with activation of c-src gene.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Дейчмст Г. И. // ВИНИТИ. Сер. Онкология. - 1984. - Т. 13. -
С. 46-97.
2. Дейчман Г. И. Ц Биохимия. — 2000. — Т. 65, №1. — С. 92—111.
3. Дьякова Н. А., Кашкина Л. М., Матвеева В. А. и др. // Докл. АН.
- 2001. - Т. 378, №2. — С. 1-4.
4. Кашлева Е. А., Матвеева В. А., Уварова Э. Н., Ключарева Т. Е. //
Экспер. онкол. — 1990. — Т. 12, №5. — С. 32—34.
5. Ключарева Т. Е., Матвеева В. А., Уварова Э. Н. // Бюл. экспер.
биол. М. - 1990. — №9. — С. 308—310.
6. Лавникова Н. А., Бурделя Л. Г. // Там же. — №7. — С. 83—85.
7. Матвеева В. А. //Тамже. — 2001. — Т. 131, №2. — С. 191—194.
8. АЫгот С. G. // Nat. Cancer Inst. Monograph. — 1964. — Vol. 17. -
P. 299-317.
9. Brunda M. J., Herberman R. B., Holden H. T. I IJ. Immunol. —
1980. - Vol. 124. - P. 2682-2687.
10. Deichman G. I., Vendrov E. L. // Int. J. Cancer. — 1986. — Vol. 37.
- P. 401-409.
11. Deichman G. I. // Cancer Surveus. — 1988. — Vol. 7, N 4. — P. 675-690.
12. Deichman G. I. // Seminars of Cancer Biology. Academic Press. — 2001. — (принята в печать).
13. Deichman G. I., Kluchareva Т. E., Matveeva V. A. et al. // Int. J. Cancer. - 1989a. - Vol. 44. - P. 904-907.
14. Deichman G. I., Kashleva H. A, Kluchareva Т. E., Matveeva V. A.
II Ibid. - 1989b. - Vol. 44. - P. 908-910.
15. Deichman G. I., Gurova К V., Dyakova N. A. // Ibid. — 1994. — Vol. 59. - P. 530-537.
16. Deichman G. I., Kashkina L. М., Mezenina O. A. et al. Ц Ibid. —
1996. - Vol. 66. - P. 747-752.
17. Deichman G. I., Matveeva V. A., Kashkina L. M. et al. // Ibid. — 1998. - Vol. 75. - P. 277-283.
18. Fidlerl. J., Kripke M. L. 11 Science. - 1977. - Vol. 197. - P. 893-895.
19. Fidlerl. J. Ц Cancer Res. - 1978. - Vol. 38. - P. 2651-2680.
20. Gorelik E., Feldman М., Segal S. // Cancer Immunol. Imrmmother.
- 1982. - Vol. 12. - P. 105-109.
21. Kluchareva Т. E., Matveeva V. A., Kushlinsky N. E. /,/ Immunol. Lett. - 1992. - Vol. 33. - P. 239-246.
22. Nathan C. F., Arrick B. A., Murray H. W. et al. // J. exp. Med. —
1981. - Vol. 153. - P. 766-782.
23. Price J. E., Aukerman S. L., Fidler I. J. I I Cancer Res. — 1986. — Vol. 46. - P. 5172-5178.
24. Svoboda J. 11 Nat. Cancer Inst. Monogr. — 1964. — Vol. 17. — P. 277-296.
25. Topol L. Z., Kisseljova N. P., Gutteries M. L., Deichman G. I. etal.
II Mol. Carcinogenesis. — 1993. — Vol. 8. — P. 167—176.
26. Young M. R., Knies S. // J. nat. Cancer Inst. — 1984. — \fol. 72. —
P. 919-922.
Поступила 23.04.2001/ Submitted 23.04.2001
