CC BY
67
© Коллектив авторов, 1992 УДК 576.535.5:576.311.37
О.Д. Алексеевская, М.Л. Анфимова, Ф.Х. Джураева, О.В. Сомова, A.A. Ставровская, Т.П. Стромская,
А.А. Штиль, T.JI. Эрайзер
Изменение экспрессии эмбриоспецифических белков при развитии множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток
НИИ канцерогенеза
Данная работа посвящена изучению изменений диф-ференцировки опухолевых клеток при возникновении и развитии множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Становление фенотипа МЛУ in vivo и in vitro — результат селекции лекарственным препаратом вариантов клеток, обладающих наряду с устойчивостью к широкому кругу препаратов рядом других признаков [12]. Установлено, в частности, что некоторые клеточные линии, культивировавшиеся в присутствии колхицина и обладающие МЛУ, являются более дифференцированными, чем родительские (чувствительные) клетки [3, 5]. Показано, что более дифференцированные варианты клеток могут накапливаться уже на первых этапах селекции на МЛУ (5 ]. Поскольку свойства опухолевых клеток в значительной степени обусловлены степенью их дифференцировки, представляется важным расширение исследований изменений дифференцировки опухолевых клеток при возникновении и развитии МЛУ. Ряд вопросов, имеющих отношение к этой проблеме, остается неясным. Полученные нами и имеющиеся в литературе данные показывают взаимосвязь МЛУ с каким-либо одним маркером дифференцировки [3, 5, 17]. Этого недостаточно, так как клеточная дифференцировка является многостадийным ступенчатым процессом, обусловленным разновременной экспрессией элементов генома и, следовательно, характеризуется комплексом параметров.
Цель настоящей работы выяснить: может ли при развитии МЛУ наблюдаться одновременное изменение нескольких дифференцировочных параметров; всегда ли при развитии МЛУ эти изменения однонаправленны и отражают гиперэкспрессию тех или иных белков дифференцировки или наряду с позитивной регуляцией может иметь место и подавление экспрессии белков, свойственных менее дифференцированному состоянию клеток (главным образом, эмбриоспецифических белков). Для ответа на эти вопросы в клетках дикого типа и в их производных, обладающих МЛУ, мы сравнили экспрессию раково-эмбриональных белков — у-глутамилтранспепти-дазы (ГГТ) и а-фетопротеина (АФП). ГГТ — маркер дифференцировки эпителиальных клеток, связанный с клеточной мембраной гликопротеин, один из ключевых ферментов метаболизма глутатиона. Изменения активности фермента наблюдаются как в онтогенезе, так и при малигнизации. Так, для эмбриональной печени крыс характерен высокий уровень ГГТ, в 30 и более раз превышающий активность фермента у новорожденных
O.D.Alekseevskaya, M.L. Anfimova, F.H.Djuraeva, O.V.Somova, A.A.Stavrovskaya, T.P.Stromskaya, A.A.Shtil, T.L.Eraizer
Alterations of Embryo-Specific Protein Expression in Multidrug Resistant Tumor Cells
Research Institute of Carcinogenesis
. This work deals with study of alterations in tumor cell differentiation at multidrug resistance (MDR). MDR occurs in vivo and in vitro as a result of selection by a drug of cell variants that together with resistance to a wide range of agents possess a number of other traits [12 ]. It is found that some cell liftes aquiring MDR after cultivation with colchicine are differentiated to a greated degree than their parental (sensitive) cells [3, 5 ]. It is also shown that the cell variants of higher grade of differentiation appear already at the first stages of selection for MDR [5 ]. As properties of tumor cells may depend upon the grade of differentiation it is important to study changes in differentiation of tumor cells during establishment of MDR. There are some questions related to this problem that remain unsolved so far. Our findings and the data reported in the literature associate MDR with discrete differentiation markers [3, 5, 17]. However these observations are not sufficient as the cell differentiation is a multistage process determined by expression of different genes at different periods and therefore is characterized by a complex of parameters The purpose of this investigation is to find out whether several differentiation parameters can change simultaneously during MDR establishment; whether these alterations are a result of hyperexpression of various differentiation proteins, or suppression of some protein expression (mainly of embryo-specific proteins) may take place. In order to answer these questions we compared expression of carcinoembryonic proteins y-glutamyl transpeptidase (GGT) and a-fetoprotein (AFP) in wide-type cells and their MDR derivatives. GGT is a marker of epithelial cell differentiation, a glycoprotein bound to cellular membranes and a key enzyme of glutatione metabolism. The enzyme activity varies both in ontogenesis and in carcinogenesis. For example in the embryonic rat liver the GGT level is 30-fold higher than in the liver of a new-born rat [14, 21 ]. In hepatocancerogenesis the GGT activity rises substantially already in preneoplastic nodules [14, 21 ]. We studied GGT expression in liver and kidney cells. AFP is a blood serum protein that is expressed in the embryo, down-regulated in the adult liver and reexpressed in hepatocellular cancer and preneoplastic liver nodules [7 ]. To study expression of this protein we used hepatomas. Materials and Methods. Cells. We cultured cells of canine kidneys MDCK [16], human hepatoma Hep G2 [15] and rat hepatoma McA RH 7777 [11] in RPMI-1640 medium with 10% fetal calf serum (Flow or NF.Gamaleya Institute of Microbiology and Epidemiology of the RAMS). The cells were subcultured every three days. Colchicine at selective doses was added to the culture medium
животных [14, 21 ]. В гепатоканцерогенезе уже на стадии пренеопластических узелков отмечается значительное повышение содержания ГГТ, что рассматривается как реверсия гепатоцитов к эмбриональному фенотипу — ранний признак дедифференцировки [14, 21 ]. Мы исследовали экспрессию ГГТ в клетках печеночного и почечного происхождения. АФП — белок сыворотки крови, экспрессируется также у эмбрионов, отсутствует в гепатоцитах взрослой печени и реэкспрес-сируется в опухолях, например, в гепатоцеллюлярных раках и пренеопластических узелках печени [7 ]. Для изучения экспрессии этого белка мы выбрали традиционную для него модель — гепатомы.
Материалы и методы. Клетки. Клетки почки собак MDCK [16], гепатомы человека Hep G2 [15] и гепатомы крысы McA RH 7777 [11] культивировали в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (фирма "Flow" или производство Института микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи
РАМН), пересевая их через каждые 3 дня. При пересевах к культурам устойчивых к колхицину сублиний добавляли колхицин в концентрации, соответствующей селективной для данной линии дозе.
Получение сублиний клеток, гепатом, устойчивых к колхицину, проводили, как описано ранее [5]. Получение сублиний MDCK с МЛУ описано ранее [5].
О чувствительности клеток к колхицину судили по дозе препарата, которая подавляла размножение 50% клеток (LD50). LD50 определяли по методике, описанной ранее [5].
Окраску культур родамином-123 проводили по методике [4]. Клетки рассевали на сколы покровных стекол. Через 2 сут их помещали на 10 мин в культуральную среду с родамином-123 (5
мкг/мл) при 37°С, затем краску отмывали и клетки инкубировали 30 мин в чистой среде. В варианте окраски с верапамилом (10 мкг/мл) его добавляли в среду с родамином-123 и в среду для отмывки красителя. В флюоресцентном микроскопе оценивали, выбрасывают ли клетки краситель за 30 мин.
Активность ГГТ определяли после экстракции клеток 1 % раствором тритона Х-100 в 5 мМ натрий-фосфатном буфере pH 7,2 по методу, описанному [20]. Активность фермента определяли параллельно в 2 пробах на спектрофотометре при длине волны 405 нм. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [2]. Для определения активности ГГТ объединяли солюбили-заты клеток с 2 культуральных флаконов.
АФП определяли иммунопероксидазным методом с применением ПАП-комплекса [22]. Для этих опытов клетки рассевали на чашки Петри диаметром 50 мм так, чтобы они образовывали при размножении отдельные колонии. В качестве окрашивающего субстрата использовали 0,05% раствор диаминобензидил тетрахлорида (ДАБ) ("Sigma", США). Клетки фиксировали 4% формальдегидом на фосфатном буфере в течение 45 мин при комнатной температуре, затем 70% этанолом в течение 30 мин. После этого клетки обрабатывали моноклональными антителами к крысиному АФП и инкубировали с кроличьими антителами к мышиным глобулинам в течение 30 мин. Затем проводилась обработка ПАП-комплексом в течение 30 мин с последующим проявлением реакции в 0,05% растворе ДАБ. Колонии клеток, позитивно окрашенные, неокрашенные и смешанные (содержащие как окрашенные, так и неокрашенные клетки) подсчитывали под микроскопом. На точку учитывали не менее 200 колоний.
Изучение экспрессии гена mdrl проводили по методу [19]. Клетки снимали холодным раствором версена и суспендировали в 4M гуанидинизотиоционате ("Sigma"), pH 7,0. Тотальную РНК экстрагировали фенолом и хлороформом. Степень деградации РНК в процессе экстракции определяли электрофоретически; для дальнейшей работы использовали образцы с четкой идентификацией 28S- и 18S-PHK. Ревертирование РНК проводили с помощью
for colchicine-resistant sublines.
The colchicine-resistant hepatoma cell sublines were isolated as described previously [5] The isolation of MDCK sublines with MDR was described elsewhere [5].
The cell sensitivity to colchicine was estimated by a drug dose that suppressed proliferation of 50% of the cells (LD50) [5]. Rhodamine-123 staining of the cultures was performed as in [4]. The cells were plated on glass coverslips. After two-day propagation the cells were transfferred to the culture medium with Rhodamine-123 and incubated at 37°C for 10 min. Then the dye was washed off and the cells were incubated for 30 min in a dye-free medium at 37°C. For verapamil treatment we added the drug (lOyUg/ml) to both the Rhodamine-123-containing medium and the medium for washing the cells. The Rhodamine staining was assessed by fluorescence microscopy.
The GGT activity was evaluated after cell extraction with 1 % triton X-100 solution in 5 mM sodium phosphate buffer of pH 7.2 as described elsewhere [20]. The enzyme activity was assessed simultaneously in 2 samples by spectrophotometry at 405 nm. The protein concentration was estimated by the modified Lowry method [2]. AFP expression was measured by the immunoperoxidase technique using the PAP-complex [22].
In these experiments the cells were plated onto the medium in 50-mm Petri dishes to propagate as individual colonies 0.05% solution of diaminobenzidyl tetrachloride (DAB) (Sigma, USA) was used as a staining substrate. The cells were fixed with 4% formaldehyde in phosphate buffer for 45 min at room temperature and with 70% ethanol for 30 min. The cells were then treated with monoclonal antibodies to rat AFP and incubated with rabbit anti-mouse antibodies for 30 min. Further the cells underwent a 30-min treatment with the PAP-complex followed by reaction development in 0.05% DAB solution. The cell colonies with positive, negative and mixed (containing both stained and unstained cells) phenotype were counted. We counted 200 colonies per point.
Expression of the mdr 1 gene was studied by the method described in [19]. The cells were detached with cold versene solution and suspended in 4M guanidine isothyonate (Sigma, USA), pH 7.0. The total RNA was extracted with phenol and chloroform. The degree of RNA degradation was assessed by electrophoresis; the samples with clear identification of 28S- and 18S-RNA were used for further study. cDNAs were synthesized on RNA templates using a cDNA Synthesis System kit (Amersham). Amplification of regions of /92-microglobulin and mdr I genes was performed in polymerase chain reaction (PCR) with specific primers to flank sequences of 112 and 167 b.p. of the corresponding genes. The PCR products were separated by electrophoresis in 3% agarose gel and stained with ethidium bromide.
Results. Characteristics of Wild-Type Cells. Table 1 summarizes characteristics of cell lines studied. Two cell lines of human (Hep G2) and rat (McA RH 7777) hepatomas and one line of transformed cells of canine kidney (MDCK) were used as parental for further selection by colchicine.
Cells of all the three parental lines expressed GGT, the hepatoma lines also expressed AFP (tables 2 and 3). As is seen in table 2 the GGT activity showed a considerable (2—4-fold) deviation in different experiments. The variability of the enzyme activity is also reported by other authors [2 ]. This may be due to physiological status of the cells, culture conditions, etc. We compared the GGT activity in MDR cells and the corresponding wild-type cells simultaneously within the same experiment after plating the cells in the same medium at the same density.
Таблица 1
Характеристика линий клеток
Т a b I е 1
Characteristics of cell lines
Происхождение клеток Линия клеток LD50 колхицина, мкг/мл Уровень устойчивости
Гепатома человека Hep G2 0,003 1
Human hepatoma Hep-0,01 0,008 3,1
Hep-004 0,049 19,5
Hep-0,1 0,073 29
Гепатома крысы McA RH 7777 0,023 1
Rat hepatoma 7777-0,04 0,065 2,9
7777-0,4 0,37 17,2
T расформированный MDCK 0,02 1
эпителий почки собаки Клоны 39, 40, 41, линии А, Б / Clones 39, 0,07—0,15 СО сл I сл о
Transformed 40, 41 lines A, В 2,9 145
canine kidney epithelium MDCK-2,0 8,3 416
MDCK-5,0 MDCK-10,0 10,3 500
Cell origin Cell line Colchicine LD50,/«j/ml Resistance level
Примечание. Уровень устойчивости: отношение LD50 колхицина для клеток, устойчивых к колхицину, к LD50 для клеток дикого типа. В работе использованы 3 клона (39, 40, 41) и 2 неклонированные линии (всего 5), селективная доза колхицина для которых составила 0,05—
0,075 мкг/мл. Селективная доза колхицина для остальных линий указана в названии линии.
Note. Reistance level: the ratio of LD50 for colchicine-resistant cells to the LD50O for wild-type cells. The study was performed on 3 clones (39, 40 and 41) and 2 non-cloned lines (total 5), the colchicine selective dose for them was 0.05—0.075 fig/ml. The selective colchicine dose for the rest of the lines is indicated in the line name.
Tабл и ца 2
Активность ГГТ (в нмоль р-нитроанилина на 1 мг белка) в клетках линии MDCK и МсА RH 7777
Table 2
GGT activity (nmol of r-introaniline per mg of protein) in MDCK and McA RH 7777 cells
Линия клеток № опыта Активность ГГТ
по отдельным опытам средняя
MDCK 1 160
2 190 285,0 ±70,8
3 470
4 320
МсА RH 7777 5 11 275,0 ±96,7
6 440
Cell line No of experiment in individual experiments mean
GGT activity
Примечание. В каждом опыте представлено среднее значение активности ГГТ по данным двух параллельных проб.
Note. The GGT activity value is averaged over data of two parallel assays in each of the experiments.
Таблица 3
Результаты исследования синтеза АФП в клетках гепатомы человека Hep G2 и гепатомы крысы МсА RH 7777
Table 3
Study of AFP synthesis in human Hep G2 and rat McA RH 7777 hepatomas
Линия клеток Число опытов Число чашек Число колоний Фенотип колонии
АФП+, % АФП± % АФП-, %
Hep 3 4 717 24,5±9,9 43,3±12,0 32,2 ±3,1
7777 2 7 906 24,0±3,6 37,1 ±1,6 38,9 ±3,6
Cell line No of No of plates No of colonies AFP+,% AFP±% AFP-,%
experiments Colony phenotype
Примечание. Фенотип колоний: АФП+ колонии, все клетки которых окрасились при окраске с помощью иммунопероксидазного метода с использованием антител к АФП; АФП- все клетки колонии не окрашены при окраске тем же способом; АФП + в колонии имеются как окрашенные, так и неокрашенные клетки. В таблице даны средние значения по результатами нескольких опытов и ошибки средних. Там, где был поставлен один опыт, ошибки средних по нескольким чашкам в опьгге не вычисляли.
Note. Colony phenotype: AFP+, colonies in which every cell shows positive reaction to immunoperoxidase staining with antibodies to AFP; AFP-, every cell shows no reaction to the staining; AFP+ , there are cells with both positive and negative reaction to the staining. The table gives mean values for several experiments and limits of value deviations.
набора реактивов для синтеза кДНК ("Amersham"). Амплификацию участков генов (/3-микроглобулина и mdrl) осуществляли в полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами, ланкирующими последовательности 112 и 167 пар нуклеотидов соответствующих генов. Продукты ПЦР- амплификации разделяли электрофоретически в 3% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием.
Результаты. Характеристика клеток дикого типа, использованных в работе. В табл. 1 перечислены линии клеток, полученные и использованные в данной работе. Исходными для дальнейшей селекции послужили 2 линии клеток гепатом: человека (Hep G2) и крысы (МсА RH 7777) и 1 линия трансформированных клеток почки собаки (MDCK).
Клетки всех этих трех линий экспрессировали ГГТ и линии гепатом АФТ (табл. 2 и 3). Из табл. 2 видно, что активность ГГТ значительно (в 2—3 раза) различалась от опыта к опыту для одних и тех же клеток. Такие колебания активности фермента в разных опытах наблюдали и другие авторы [2 ]. Разброс значений активности ГГТ может быть связан с физиологическим состоянием клеток, с недостаточно контролируемыми условиями культивирования и пр. В связи с этим мы сравнивали активность ГГТ в клетках с МЛУ и соответствующих клетках дикого типа всегда одновременно, в одном опыте, рассевая их на одной и той же среде с одинаковой плотностью.
Исследование экспрессии АФП клетками исходных линий показало, что значительное число колоний в популяции клеток гепатом экспрессирует этот белок: около 60% колоний МсА RH 7777 и Hep G2 окрашивались на АФП либо целиком, либо частично. Таким образом, степень экспрессии ГГТ и АФП в популяциях выбранных нами для работы линий позволяла обнаруживать как снижение, так и усиление ее в этих клетках.
Получение сублиний клеток гепатомы человека Hep G2 и гепатомы крысы МсА RH 7777, устойчивых к колхицину. Получение сублиний MDCK с МЛУ описано ранее [5 ]. В настоящей работе были вновь получены лекарственно-устойчивые линии гепатом. Сублинии клеток гепатомы человека и крысы, устойчивые к колхицину, получали путем ступенчатой селекции, постепенно повышая концентрацию колхицина в культуральной среде. Получая устойчивые к колхицину сублинии клеток, мы периодически окрашивали их родамином-123, так как показано, что клетки, обладающие МЛУ, выбрасывают флюоресцентные красители и поэтому отличаются по окраске ими от клеток дикого типа [4 ]. Мы нашли, что все полученные нами устойчивые к колхицину клетки выбрасывают родамин-123 за то время, пока чувствительные клетки оставались яркоок-рашенными. Обработка резистентных культур верапа-милом, снимающим, как известно, МЛУ [12], делала их окрашиваемыми. Исключение составили клетки Нер-0,01, которые в отличие от клеток дикого типа росли в среде с 0,01 мкг/мл колхицина, но по окраске родамином-123 не отличались от исходных клеток Hep G2.
AFP was expressed by a majority of colonies in the hepatoma cell populations, i.e. 60% of McA RH 7777 and Hep G2 cells showed staining of all the cells or a part of them.
Colchicine - Resistant Cell Sublines of Human H e p G 2 and rat McA RH 7777 Hepatomas. The isolation of resistant MDCK sublines was described elsewhere [5 ]. In this investigation we isolated new drug-resistant hepatoma sublines. Colchicine-resistant sublines of human and rat hepatomas were isolated by stepwise selection with increasing colchicine concentration in the culture medium. The colchicine-resistant sublines were stained with Rhodamine-123 because the MDR cells demonstrated elevated efflux of fluorescent dyes [4 ]. We found that all the colchicine-resistant cells excluded Rhodamine-123 while the sensitive cells remained bright. The cell exposure to verapamil known to reverse MDR [12 ] resulted in intracellular retention of the dye The Hep-0.01 cells made an exception: these cells propagated in the medium with 0.01 ¿ug/ml of colchicine, but nevertheless showed no difference in staining by Rhodamine-123 as compared to the parental Hep G2 cells.
Fig. 1 demonstrates mdr 1 gene expression. The 167 b.p. products of the mdr 1 gene region (lanes 2—4) were visualized in all the sublines at the first selection stage, ie Hep-0.01. The amount of cDNA of the mdr 1 gene fragment in the parental subline Hep G2 (lane 5) was smaller than in the resistant cells, though the cDNA amount loaded on each lane was standardized by expression of the /32-microglobulin gene fragment (112 b.p. product). These findings show that Hep G2 cells demonstrate weak expression of the mdr I gene to be further increased in colchicine-resistant sublines.
As is seen in table 1 we used both the cells at the first stage of selection for MDR (3—5-fold higher resistance to colchicine) and the cells at later stages of the selection. The Hep-0.04 cells were worthy of note among the cells of the first selection stage (colchicine selective doses from 0.01 to 0.075 /¿g/ml) for their 20-fold resistance to colchicine. The comparatively high level of drug resistance was due to a marked sensitivity to colchicine of wild-type Hep G2 cells (see Table 1).
As a rule the difference in Rhodamine-123 staining was first observed in cells that could proliferate in a medium with 0.04—0.05 /¿g/ml of colchicine irrespective of sensitivity to the drug of the parental cells. We considered these cells to be products of the first stage of selection for MDR. The variation in Rhodamine staining probably reflected the change in function or amount of P-glycoprotein (MDR protein) sufficient for the resistance at the first selection stage. Our data sbout Hep G2 cells in PCR showed that hyperexpression of the mdr 1 gene could be detected prior to alteration in cell staining with a fluorescent dye.
Determination of GGT Activity in MDR Cell Sublines of Rat Hepatoma M c A R H 7777 and Can ine Kidne y MDCK. We found out that establishment of a
4 5
— 167 п.н.
Рис. 1. Экспрессия гена mdrl. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Условия реакции: денатурация при 94°С — 1 мин; отжиг праймеров при 60°С — 2 мин, элонгация при 72°С — 2 мин. 35 циклов ПЦР. кДНК (матрицы) в треках 2 — 5: 2 — Нер-0,01, 3 — Нер-0,04, 4 — Нер-0,1,
5 — Hep G2. В треке I матрица отсутствует (отрицательный контроль).
На рис. 1 представлены результаты исследования экспрессии гена mdrl в клетках с помощью ПЦР. Продукты амплификации участка гена mdrl длиной 167 п.н. (треки
2—4) присутствуют во всех резистентных сублиниях, начиная с клеток первого шага отбора — Нер-0,01. В исходной сублинии Hep G2 (трек 5) количество кДНК фрагмента гена mdrl значительно меньше, чем в резистентных клетках, хотя количество кДНК в каждой пробе (треке) стандартизовано по экспрессии в ПЦР фрагмента гена /?2-микроглобулина (продукт длиной 112 п.н.). Эти данные показывают, что в клетках Hep G2 отмечается слабая экспрессия гена mdrl, возрастающая в резистентных к колхицину сублиниях.
Из табл. 1 видно, что в работе исследованы как клетки первого этапа селекции на МЛУ (отличавшиеся по чувствительности к колхицину от клеток дикого типа в
3—5 раз), так и клетки последующих ступеней отбора. Среди клеток первого этапа отбора (селективные дозы колхицина от 0,01 до 0,075 мкг/мл) по уровню устойчивости к колхицину выделяются клетки Нер-0,04 (уровень устойчивости к колхицину около 20 раз). Такой высокий уровень лекарственной устойчивости клеток связан с тем, что клетки дикого типа Hep G2 высокочувствительны к цитостатику (см. табл. 1).
Как правило, независимо от чувствительности к колхицину исходных клеток отличия в окраске родамином-123 наблюдались впервые в клетках, которые могли пролиферировать в среде с 0,04 — 0,05 мкг колхицина на 1 мл среды. Именно эти варианты мы относили к клеткам первого шага отбора на МЛУ. Возможно, изменение окраски родамином отражает определенный уровень изменений функции или количества белка МЛУ, Р-гликопротеина, достаточный для обеспечения первых этапов устойчивости. Наши данные с использованием ПЦР для изучения клеток серии Hep G2 показывают, что гиперэкспрессия гена mdrl может отмечаться раньше, чем изменения окраски клеток флюоресцентным красителем.
Определение активности ГГТ в сублиниях клеток ге-патомы крысы МсА RH 7777 и почки собаки MDCK с МЛУ. Наши данные показали, что развитие относительно высокого уровня устойчивости к колхицину как в клетках гепатомы, так и в клетках почки сопровож-
Fig. 1. Expression of mdr 1 gene. Polymerase chain reaction (PCR). Reaction conditions: dénaturation at 94°C for 1 min; primer annealing at 60°C for 2 min, elongation at 72°C for 2 min. 35 PCR cycles. cDNA (matrices) in lanes 2—5: 2, Hep-0.01; 3, Hep-0.04; 4, Hep-0.1 ;
5, Hep G2.. No matrix in lane 1 (negative control).
relatively high resistance to colchicine both in hepatoma and kidney cells was accompanied with a considerable decrease in GGT activity as compared to wild-type cells (fig. 2a). The GGT activity in MDCK cell populations 150—500-fold resistant to colchicine was 30—50% of that in the wild-type cells. The 7777-04 cells (resistance level about 20) demonstrated a less marked decrease in the enzyme activity, nevertheless the decrease in the GGT activity was observed in both experiments. We studied 5 independent cloned and non-cloned MDCK sublines and 1 McA RH 7777 subline of the first stages of selection for MDR (fig. 2b). Of these 6 lines with a resistance level of 3-5 three clones (41, 40 and 7777-0.04) presented a 20—65% decrease in the GGT activity as compared with the wild-type cells. Two other lines (clone 39 and line A) showed just a slight tendency to decrease in the GGT activity The line B exhibited a pronounced increase in the enzyme activity. The number of cell lines studied was not large (6 lines of the first selection stage), however, the obtained results suggested that cells with a decrease in GGT activity might be selected already at the first stages of selection for MDR.
Study of AFP Synthesis in MDR Cell Sublines of Human Hep G2 and Rat Me A RH 7777 Hepatomas. Fig. 3 shows results of experiments with staining of sensitive and resistant cells with monoclonal antibodies to AFP. The fraction of AFP-negative colonies increased in populations of all colchicine-resistant hepatoma sublines except Hep-0.01. It is noteworthy that this cell population nevertheless differed from wild-type cells: the AFP-positive colony fraction decreased while the mixed colony fraction increased. The level of resistance to colchicine seemed to correlate with the increase in the AFP-negative fraction in the rat hepatoma populations resistant to the cytostatic. There was no such correlation in the colchicine-resistant human hepatoma cells.
Proliférai n Rates of Colchicine-Sensitive and Colchicine - Resistant Sublines Hep G2 and M c A R H 7777. The difference in GGT and AFP expression in the parental and colchicine-resistant sublines might be due to the rate of propagation of these cells. Our experiments show that the parental and resistant cells can
MDCK
Дикий тип 2.0 5.0 10.0
Wild type
7777
Дикий тип 0.4 Wild type
200
150 --
100 --
50 --
а).
b).
Дмий тип Клом 41 typ* CkMW 41
Рис. 2. Активность ГГТ в чувствительных и устойчивых к колхицину клетках (измерена в мкМ р-нитроанилина на 1 мг белка и вычислена в процентах от чувствительных клеток).
По вертикали — процент от контроля, а — в клетках с высоким уровнем устойчивости к колхицину (У—6 — повторность опытов).
Ь — в клетках с низким уровнем устойчивости к колхицину (/—4 — повторность опытов).
Дикий тип 0.04 Un* В VMd 1ур*
Fig. 2. GGT activity in colchicine-sensitive and colchicine-resistant cells (measured in fjM of r-nitroaniline per mg of protein and calculated as percentage of enzyme activity in sensitive cells).
Numbers on the vertical show percentage with respect to the control enzyme activity, a, in highly resistant cells (1-6, experiment replication), b, in cells with low resistance level (1-4, experiment replication).
дается существенным снижением активности ГГТ по сравнению с клетками дикого типа (рис. 2, а). Популяции клеток МБСК, резистентные к колхицину (уровни устойчивости 150—500 раз), характеризовались снижением уровня ГГТ до 50—30% от активности фермента в клетках дикого типа. В клетках 7777-0,4 (устойчивость около 20 раз) снижение активности фермента было менее выраженным, но тем не менее наблюдалось в обоих опытах. Мы исследовали 5 независимых клоновых и неклонированных сублиний МОСК и 1 сублинию МсА ЯН 7777 первых этапов селекции на МЛУ (рис. 2, Ь). Из этих 6 линий с уровнями устойчивости 3—5 раз в 3 (клоны 41, 40 и 7777-0,04) наблюдалось снижение активности ГГТ на 20—65% от активности фермента в клетках дикого типа. Другие 2 линии (клон 39 и линия А) проявляли слабовыраженную тенденцию к снижению активности ГГТ по сравнению с исходными клетками, практически не отличаясь по этому признаку от клеток дикого типа. Лишь линия Б характеризовалась выраженным повышением уровня фермента.
demonstrate no difference in proliferation rate. For instance, the number of 7777-0.04 cells increased 14-fold by day 6 of cultivation, i.e. these cells had the same proliferation rate as the wild-type cells (fig. 4a). However, Hep-0.01 cells with the same characteristics of Rho-damine staining and the same AFP-negative fraction as the parental cells showed a decrease in proliferative activity as compared with the parental cells (fig 4b). Thus, the results obtained give no evidence of correlation between the down-regulation of embryo-specific protein expression in the cells with MDR and the variation in their proliferation rates.
Discussion. Thus, we have shown that MDR cell lines of hepatomas and transformed kidney epithelium often demonstrate decreased GGT and AFP expression. There are a number of facts to prove that these observations are not just random events.
First, increase in resistance to colchicine resulted in decrease in expression of both embryo-specific proteins studied.
120
100
80
60
40
20
0
120
100
80
60
40
20
0
a).
Hep
Hep=0.01 Hep-0.04
Hep=0.1
b).
0.04
1АФЛ+ IAFP+
АФП+ I AFP±
1 АФП ■
Iafp-
Рис. 3. Распределение колоний с разной степенью экспрессии АФП в популяциях сублиний Нер 02 (а) и МсА НН 7777 (¿>).
По вертикали — процент колоний в популяции клеток с определенной экспрессией АФП, по горизонтали — сублинии клеток.
Fig. 3. Distribution of colonies with different AFP expression in Hep H2 (a) and McA RH 7777 (A) subline populations.
Numbers on the vertical show percentage of colonies with a certain character of AFP expression; numbers on the horizontal show cell sublines.
Выборка, исследованная в данной работе (6 линий первого этапа селекции), невелика, однако полученные результаты позволяют говорить о том, что уже на первых этапах селекции на МЛУ могут отбираться клетки, характеризующиеся снижением активности ГГТ.
Исследование синтеза АФП сублиниями клеток ге-патом человека Нер 02 и крысы McARH 7777, обладающими МЛУ. Результаты опытов по окраске моноклональными антителами к АФП колоний чувствительных и резистентных клеток исследованных линий приведены на рис. 3. Как видно, наблюдается повышение доли АФП-отрицательных колоний в популяциях всех устойчивых к колхицину сублиний гепатом, кроме Нер-0,01. Нужно заметить, что популяция этих клеток также отличается от клеток дикого типа: доля АФП-поло-жительных колоний в ней заметно падает и нарастает доля колоний со смешанным фенотипом. В популяциях клеток гепатомы крысы, устойчивых к колхицину, намечается корреляция между степенью устойчивости клеток к цитостатику и повышением количества АФП-отрицательных клеток. Для колхицинрезистентных клеток гепатомы человека эта корреляция не отмечена.
Secondly, decrease in expression of AFP and GGT became more marked in parallel with rise in the level of drug resistance: at the first stages of MDR establishment the down-regulation of expression of these proteins was detected only in a part of independent cell lines, but as the resistance to colchicine rose the decrease in the GGT expression and in the fraction of AFP-synthesizing cells became common for all the lines under study.
Thirdly, our previous findings proved that expression of tissue-specific differentiation markers increased during establishment of MDR in cells of different histogenesis, i.e. water and ion transport capability of kidney epithelium was observed as well as enhanced hemoglobin synthesis in erythroleukemia cells [3, 5]. The decrease in expression of the embryo-specific protein GGT associated with other traits of differentiation of MDCK cells [5 ], as well as the simultaneous decrease in expression of the two markers (GGT and AFP) in the McA RH 7777 rat hepatoma cells, gave evidence in support of the coordinated alteration of the differentiation markers during MDR establishment.
35 -I-
30 Л
У
О -I----1-----1-----н-
0 2 4-6
ЮО J
во 60 40 -20 --
о -I- Е' —*.I—
0 2 4 6
Рис. 4. Пролиферация чувствительных и устойчивых к колхицину клеток.
а — клетки McARH 7777 U) и 7777-0,04 (2); Ь — клетки Hep G2 (1) и Hep G2-0.01 (2). По осям абсцисс — время после рассева, сут; по осям ординат — число клеток х 10 ООО.
Скорость размножения чувствительных и устойчивых к колхицину сублиний Hep G2 и МсА RH 7777. Различия в уровне экспрессии ГГТ и АФП в исходных и устойчивых к колхицину сублиниях можно было бы связать с различиями в скорости размножения этих клеток. Известно, что нередко клетки, устойчивые к разным цитостатикам, пролиферируют медленнее чувствительных клеток. Наши данные показали, что разница в скорости пролиферации между исходными и резистентными клетками может отсутствовать. Так, количество клеток сублинии 7777-0,04 увеличилось на 6-й день культивирования в 14 раз — примерно в той же степени, что и количество клеток дикого типа (рис. 4, а). С другой стороны, клетки Нер-0,01, не отличавшиеся от исходных по окраске родамином и по доле АФП-отрица-тельных клеток, обнаружили резкое снижение пролиферативной активности по сравнению с исходными клетками (рис. 4, Ь). Результаты этих опытов, таким образом, не выявляют корреляции между подавлением экспрессии эмбриоспецифических белков в клетках с МЛУ и изменением скорости их пролиферации.
Обсуждение. Таким образом, показано, что в
а).
Ч-----------1------------1----------1
8 Ю 12 14
/V Ь).
V1
2
—i----------------------------------------1-1-1-1
8 10 12 14 16
Fig. 4. Proliferation of colchicine-sensitive and colchicine-resistant cells.
a, cells McA RH 7777 U) and 7777-0.04 (2); b, cells Hep G2 U) and Hep G2-0.01 (2). Numbers on the x axes mark time after cell plating, days; numbers on the y axes show cell count x 10,000.
The decreased expression of GGT and AFP suggests that MDR confers alterations of cell differentiation status. The GGT decrease is shown to accompany the establishment of a higher differentiation phenotype in rat hepatoma cells cultured in vitro [2 ]. A similar inverse correlation is observed between AFP expression and differentiation of spontaneous mouse hepatomas [6 ]. We have demonstrated that GGT activity decreases in MDCK cells and in hepatoma cells with high level of MDR as compared to wild-type cells. Some cell lines show a decreased GGT activity at the first stages of colchicine selection. Kidney tissues are the only adult tissues with high GGT expression. The activity of the enzyme decreases in some renal tumors [9 ]. Basing on these data one may expect the GGT activity to increase rather than to decrease in MDR cells with higher differentiation. However, the decrease or increase in the GGT expression is obviously determined by the cell type [23 ]. The MDCK cell are thought to originate from cells of distal tubules of the kidney. The trend of GGT alteration in carcinogenesis for these cells is unclear. It is also possible that the in vitro regulation of GGT acti-
исследованных нами клеточных линиях гепатом и трансформированного эпителия почки с МЛУ достаточно часто снижена экспрессия ГГТ и АФП. В пользу того, что это снижение не объясняется случайными причинами, а связано с МЛУ, свидетельствует ряд фактов.
Во-первых, повышение устойчивости к колхицину повлекло за собой снижение экспрессии обоих исследованных эмбриоспецифических белков.
Во-вторых, с повышением уровня лекарственной устойчивости снижение экспрессии АФП и ГГТ становится все более выраженным: если на первых этапах развития МЛУ снижение экспрессии этих белков наблюдалось лишь в части независимо полученных клеточных линий, то при повышении уровня устойчивости к колхицину снижение экспрессии ГГТ и уменьшение числа АФП-синтезирующих клеток отмечено во всех изученных линиях.
В-третьих, данные, полученные нами ранее, свидетельствуют о том, что в клетках разного гистогенеза при возникновении и развитии МЛУ усиливается экспрессия тканеспецифических маркеров дифференци-ровки: происходит направленный транспорт воды и ионов в эпителии почки, возрастает синтез гемоглобина в клетках эритролейкоза [3, 5 ]. Сочетание снижения экспрессии эмбриоспецифического белка ГГТ и приобретение признака дифференцировки клетками почки собаки MDCK [5], снижение экспрессии одновременно двух маркеров (ГГТ и АФП) в клетках гепа-томы крысы МсА RH 7777 свидетельствует в пользу координированного изменения признаков дифференцировки при МЛУ.
Снижение экспрессии ГГТ и АФП в клетках свидетельствует в пользу изменения статуса дифференцировки клеток с МЛУ. Показано, что снижение ГГТ сопутствует более дифференцированному фенотипу клеток гепатом крысы, культивируемых in vitro [2]. Обнаружена такая же обратная корреляция между экспрессией АФП и степенью дифференцировки спонтанных гепатом мышей [6 ]. На клетках почки собаки MDCK с высокими уровнями МЛУ мы, так же как на клетках гепатом, продемонстрировали снижение активности ГГТ по сравнению с клетками дикого типа. В некоторых линиях первых этапов селекции колхицином активность ГГТ также была снижена. Ткани почки представляют собой единственный пример тканей взрослого организма, в которых отмечается высокий уровень экспрессии ГГТ. В некоторых опухолях почки активность этого фермента снижается [9 ]. Исходя из этих сведений, можно было бы ожидать не уменьшения, а повышения активности ГГТ в более дифференцированных клетках с МЛУ. Очевидно, однако, что снижение или повышение активности ГГТ зависит от клеток, из которых происходит опухоль почки [23 ]. Полагают, что клетки MDCK произошли из клеток дистальных канальцев почки, тенденции изменений ГГТ для которых при малигнизации пока неясны. Нельзя исключить также, что регуляция активности ГГТ in vitro подчиняется
vity differs from the in vivo regulation, and its mechanism in vitro is the same as in hepatoma cells.
The data on the correlation of MDR and cell differentiation have recently increased. Elevated mdr 1 expression has been observed in highly differentiated tumors or tumor regions of higher differentiation [12]. It is shown that some differentiation inducers also elevate expression of the mdr 1 gene [10,18 ]. Thus, our findings of this and previous studies [3, 5 ], as well as the data reported in the literature support our supposition that cell variants of higher differentiation survive in the process of selection for MDR. The data presented here have shown for the first time that cells with MDR demonstrate both reexpression of differentiation markers and decreased expression of embryo-specific proteins.
The mechanisms determining differentiation changes during MDR establishment are still unknown. Alteration of interellular contacts or shape of drug-resistant cells may be involved. The GGT synthesis in transformed rat hepatocytes is shown to be regulated by changes in the cell shape [2]. It is supposed that the regulation of AFP synthesis in hepatocytes depends on the cell shape and contacts of the cells with the extracellular matrix and intercellular communications [8 ]. The alteration of the MDR cell phenotype is a complex process. The data by R.I.Abdryashitov et al [1 ] show that MDR evolution is accompanied with restoration of the actin cytoskeleton of transformed cells, replacement of fibroblast-like cell populations by epithelium-like populations which form areas of cells closely connected with each other. These findings suggest that the shape and contacts of the cells can change during MDR establishment. Further investigations are needed to clear up the role of these mechanisms in alteration of embryo-specific protein syntheses in MDR cells.
There is also a practical aspect in study of correlation of differentiation and MDR in cell cultures. Modern polychemotherapeutic regimens consist of several cycles of drug treatment. Therefore, the study of changes in tumor cells in the course of therapy is important for evaluation of the treatment effect. Analysis of cell populations with intrinsic or acquired MDR is of especial significance. We believe that the increase in the grade of tumor cell differentiation during establishment of MDR should be taken into account in studies of therapeutical tumor pathomorphosis and resolving problems of neoadjuvant chemotherapy.
иным закономерностям, чем in vivo, и осуществляется теми же механизмами, что и в клетках гепатомы.
Данные о связи МЛУ и дифференцировки начинают накапливаться в литературе. В высокодифференцированных опухолях и в более дифференцированных участках опухолей отмечена повышенная экспрессия гена mdrl [12]. Обнаружено, что некоторые индукторы дифференцировки вызывают также экспрессию гена mdrl [10, 18 ]. Таким образом, результаты, полученные в этой работе и ранее [3, 5], вместе с данными литературы свидетельствуют в пользу высказанного нами предположения о том, что при отборе на МЛУ отбираются более дифференцированные варианты клеток. Полученные в данном исследовании результаты впервые показывают также, что в клетках с МЛУ наблюдается не только реэкспрессия маркеров дифференцировки, но и подавление экспрессии эм-бриоспецифических белков.
Неясными остаются механизмы, определяющие изменения дифференцировки при МЛУ. Одним из таких механизмов могут быть изменения межклеточных контактов или формы лекарственно-устойчивых клеток. Показано, что синтез ГГТ в трансформированных гепатоцитах крысы регулируется изменениями формы клеток [2]. Предполагается, что регуляция синтеза АФП гепатоци-тами также связана с формой клеток, их контактами с внеклеточным матриксом, межклеточными связями [8 ]. Изменения фенотипа клеток с МЛУ носят множественный характер. По данным Р.И. Абдряшитова и соавт. [ 1 ], при прогрессировании МЛУ восстанавливается актино-вый цитоскелет трансформированных клеток, происходит смена фибробластоподобных клеточных популяций эпителиоидными, образующими островки хорошо связанных между собой клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что форма клеток и контакты между ними при МЛУ могут меняться. Дальнейшие исследования должны выяснить роль этих механизмов в изменениях синтеза эмбриоспецифических белков в клетках с МЛУ.
Исследование координации дифференцировки и МЛУ на моделях длительно пассируемых культур клеток имеет и практический аспект. Современные режимы полихимиотерапии предусматривают, как правило, проведение многокурсовых циклов лечения. В этих условиях изучение свойств опухолевых клеток в динамике терапии является принципиальным этапом оценки эффективности лечения. Особенно важен анализ популяций клеток с первичной и приобретенной МЛУ. Мы полагаем, что возрастание степени дифференцировки опухолевых клеток при приобретении ими МЛУ следует учитывать при исследовании лечебного патоморфоза опухолей и решении вопросов неоадъювантной химиотерапии.
Литература / References
1. Абдряиштов Р.И., Бершадский А.Д., Какпакова Е.С. II Экспер. онкол. — 1989. — Т 11, № 5. — С. 26—30.
2. АнфимоваМ.Л., Банников Г.А. // Бюлл. экспер. биол. — 1985.
— Т.100, №7.— С. 23—25.
3. Джураева Ф.Х., Ставровская A.A., Стромская Т.П. // Вестн.
ВОНЦ АМН СССР. — 1991. — № 4. — С. 7—12.
4. Нейфах A.A., Александрова А.Ю. 11 Докл. АН СССР. — 1987.
— Т. 291. — С. 989—991.
5. Ставровская A.A., Стромская Т.П., Чернова О.Б., Джураева Ф.Х. II Молекул, генетика. — 1990. — № 5. — С. 3—7.
6. Шипова Л.Я., Харьковская H.A., Ладыгина Н.Г. II Экспер. онкол. — 1983. — Т. 5, № 5. — С. 27—31.
7. AbelevG.I. II Advan. Cancer Res. — 1971. — Vol. 14. — P. 295— 358.
8. AbelevG.I. II Tumor Biol. — 1989. — Vol. 10. — P. 63—74.
9. Bannasch P., Hacker H.J., Tsuda H., Zebran H. II Advances in
Enzyme Regulation / Ed. G.Webe. — Oxford, 1986. — Vol. 25 — P. 276—296.
10. Bates S.E., Mickley L.A., Chep Y.-N., Richert N. et al. // Molec. cell. Biol. — 1989. — Vol. 9. — P. 4337—4344.
11. Becker J., de Nechaud B., Potter V.P. II Onco-developmental gene expression / Eds W.H.Fishman, S.Sell. — New York, 1976. — P. 259—270.
12. Bradley G., Juranka P.P., Ling V. II Biochim. biophys. Acta. — 1988. — Vol. 948. — P. 87—128.
13. Gottesman M.M., Goldstein L.J., Fojo A. et ai. 11 Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed.
I.B.Roninson. — New York; London, 1991. — P. 291—301.
14. Hanigan M.H., Pitot H.C. II Carcinogenesis. — 1985. — Vol. 6.
— P. 165—172.
15. Knowles B.B., Howe C.C., Aden D.P. II Science. — 1980. — Vol. 200. — P. 497—499.
16. Lever J.E. II Proc. nat. Acad. Sei. USA. — 1979. — Vol. 76. — P. 1323—1327.
17. Melloni E., Pontremoli S., Damiani G., Viotti P. et al. // Ibid. — 1988. — Vol. 85. — P. 3835—3839.
18. Mickley L.A., Bates S.E., Richert N.D., Current S. et al. // J. biol. Chem. — 1989. — Vol. 264. — P. 18031 —18040.
19. Noonan K.E., Rononson I.B. II Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed. I.B.Roninson. — New York; London, 1991.— P. 319 —333.
20. Orlovwski M., Szewczuk A. // Clin. chim.Acta. — 1961. — Vol. 6.
— P. 430—433.
21. Sulakhe S.L, Lautt W.W. II Int. J. Biochem. — 1987. — Vol. 19.
— P. 23—32.
22. Taylor C.R. II Arch. Path. Lab. Med. — 1978. — Vol. 102 — P. 113—120.
23. Tsuda H., Moore M.A., Asamoto M., Satoh K. et al. // Jap. J. Cancer Res. — 1985. — Vol. 76. — P. 919—929.
Поступила 27.12.91. / Submitted 14.11.91.
