CC BY
148
Вера Александровна Рыбко, Анна Вадимовна Книжник,
Ярослав Андреевич Каинов, Андрей Викторович Комельков,
Елена Максимовна Чевкина
(Первые два автора внесли одинаковый вклад в данную работу)
АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ
Лаборатория регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, лаборатория регуляции клеточных и вирусных онкогенов, Рыбко Вера Александровна (e-mail: vera.rybko@gmail.com), Книжник Анна Вадимовна (e-mail: aknijnik@gmail.com)
Исследование посвящено сравнительному анализу активности протеиназ внеклеточного матрикса в культурах высоко- и низкометастатических линий трансформированных фибробластов, а также в первичных опухолях и образцах легких животных после подкожного введения клеток исследуемых линий. Показано, что высокометастатическая линия HET-SR1 отличается значительно большей активностью как внутриклеточной, так и секретируемой формы протеиназы uPA. Это свойство сохраняется в клетках первичной опухоли и в образцах пораженной метастазами легочной ткани экспериментальных животных. Исследование активности ММР-1, -2 и -9 позволило выявить, что in vitro основной секретируемой желатиназой является ММР-2. В условиях тканевого микроокружения в опухолях стимулируется активность ММР-9. В легочной ткани ММР-9 является самой активной среди исследованных ММР. Активность ММР-9 в легких животных с первичными опухолями и при метастазировании независимо от количества метастазов всегда повышается по сравнению с таковой в легких здоровых животных. Активность ММР-2 в клетках линии HET-SR1 выше, чем во всех низкометастатических линиях на уровне секреции в культуре, а также в формируемых ими первичных опухолях и в легких животных с очагами вторичного роста. Полученные результаты свидетельствуют об участии uPA и ММР-2 в формировании и реализации высокометастатического фенотипа клеток данной экспериментальной системы.
Ключевые слова: внеклеточный матрикс, матриксные металлопротеиназы, урокиназоподобный активатор плазминогена, метастазирование.
Формирование злокачественных новообразований и опухолевая прогрессия неразрывно связаны с процессом ремоделирования ткани, при котором нормальная ткань замещается малигнизированной. При этом большое значение имеет протеолитическая деградация внеклеточного матрикса (ВКМ) — сложно устроенной сети коллагенов различного типа, фибриллярных гликопротеинов и протеогликанов, которые определяют архитектуру ткани и модулируют различные виды активности клеток. Ремоделирование ВКМ необходимо для выживания опухолевых клеток, роста опухолевого узла, ангиогенеза, диссеминации опухолевых клеток, экстра- и интрава-зии и формирования вторичных очагов опухолевого роста. Изменения в продукции и деградации компонентов
© Рыбко В. А., Книжник А. В., Каинов Я. А., Комельков А. В., Чевкина Е. М., 2008 УДК 576.385.5:616-006-092.4/.9
ВКМ наблюдаются в широком спектре опухолей различной локализации [5]. При этом нарушается баланс между синтезом и деградацией с помощью протеолитических ферментов отдельных компонентов ВКМ. Продукция и секреция протеиназ, участвующих в деградации компонентов ВКМ, осуществляются как самими опухолевыми клетками, так и стромальными клетками микроокружения. Выделяют 4 основные группы эндопротеиназ: аспар-тиловые, цистеиновые, сериновые и металлозависимые протеиназы [22].
В последние годы при изучении процессов ремоделирования ВКМ большое внимание уделяется системе активации плазминогена. Эта система, включающая ко-активаторы, плазминоген, клеточные рецепторы и ингибиторы, играет ключевую роль в ряде биологических процессов, таких, как фибринолизис, воспаление, формирование атеросклеротических бляшек, ремоделирование матрикса при заживлении ран, опухолевая ин-
вазия, ангиогенез и метастазирование. Существуют 2 типа активаторов плазминогена — урокиназоподоб-ный активатор плазминогена (иРА) и тканевый активатор плазминогена (1РА). Оба белка катализируют конверсию плазминогена в активную протеиназу плазмин. Предполагается, что основной ролью 1РА является продукция плазмина для тромболизиса, в то время как иРА играет ключевую роль в ремоделировании матрикса и, соответственно, в большей степени участвует в процессах опухолевой инвазии и метастазировании [6]. В клетках иРА синтезируется в виде предшественника про-иРА, который превращается в активный фермент под воздействием плазмина, содержащегося в следовых количествах в матриксе.
Одновременное связывание про-иРА и плазминогена с рецептором иРА (иРАЯ) на клеточной поверхности приводит к существенной стимуляции протеолитической активности плазмина в отношении фибронектина, витро-нектина и фибрина [9]. Таким образом запускается механизм положительной обратной связи — плазмин активирует про-иРА, в результате чего образуется активная форма иРА, которая катализирует образование плазми-на из плазминогена. Плазмин способен расщеплять большинство белков ВКМ. Усиление протеолиза с участием системы активации плазминогена показано для многих новообразований человека, что коррелирует в ряде случаев с опухолевой прогрессией [2].
Другим типом ферментов, расщепляющих компоненты ВКМ и базальной мембраны, является семейство матриксных металлопротеиназ (ММР). На основании структурного сходства и субстратной специфичности их делят на несколько групп. Основные различия между отдельными группами ММР обусловлены наличием дополнительных доменов, ответственных за специфичность к субстрату, связывание с ингибиторами, взаимодействие с матриксом и локализацию на клеточной поверхности. Большинство ММР секретируются в латентной форме в виде предшественников и активируются путем протеолитического расщепления. Активация происходит во внеклеточном пространстве с помощью сери-новых протеиназ, таких, как плазмин, иРА, эластаза и др. [8]. Активность ММР регулируется преимущественно специфическими ингибиторами ММР, относящимися к семейству Т1МР [10].
Экспрессия ММР обнаружена в целом ряде опухолей, включая карциномы легкого, толстой кишки, молочной железы и поджелудочной железы [17; 24]. ММР в опухолях продуцируются не только опухолевыми клетками, но и фибробластами стромы, а также клетками, участвующими в воспалительной реакции. Эти клетки способны продуцировать цитокины и другие факторы, стимулирующие клетки микроокружения к секреции ММР. Имеются данные, свидетельствующие о том, что повышенная экспрессия отдельных ММР коррелирует с негативным прогнозом у пациентов с различными злокачественными новообразованиями [8].
Известно, что агрессивный опухолевый фенотип может быть вызван изменениями в клеточных сигнальных каскадах, ассоциированных с некоторыми малыми ГТФазами [18]. Малые ГТФазы семейств Яа1 и Ай относятся к суперсемейству белков Яав и участвуют в Яав-
зависимых системах передачи внутриклеточных сигналов. Роль этих белков в опухолевой прогрессии и мета-стазировании мало изучена. Согласно отдельным источникам литературы, эти белки способны влиять на некоторые этапы метастатического процесса как in vivo, так и in vitro [3; 19; 23]. Другие данные литературы свидетельствуют о роли этих белков в активации систем внеклеточного протеолиза [1; 13].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клеточные линии
В качестве экспериментальной модели использовали эмбриональные фибробласты сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh), трансформированные вирусом саркомы Рауса. Трансформация клеток была произведена с использованием различных изолятов штамма Schmidt—Ruppin D, в результате чего были получены линии HET-SR и HET-SR1, у которых одинаково высок уровень туморогенности in vivo, однако они принципиально различаются по спонтанной метастатической активности (СМА). Этот показатель исследовали через 2 мес после подкожного введения 20 000 клеток. Для линии HET-SR среднее количество метастазов на легкие одного животного Amet = 4, а для линии HET-SR1 Amet = 100. Клетки культивировали в среде DMEM с 0,294 мг/мл L-глутамина, 10% эмбриональной сыворотки (Gibco BRL), 0,1 мг/мл стрептомицина, 100 ед/мл пенициллина при температуре 37°C, в атмосфере 5% CO2. Подсчет клеток производили с помощью камеры Горяева.
Для введения генетических конструктов использовался ретровирусный вектор pLXSN (Clontech). В качестве клеток-упаковщиков для ретровирусных конструктов использовали клетки GP293. Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogene) согласно протоколу производителя. Инфекция клеток проходила в присутствии 4 мкг/мл Polybrene (Fluka).
Вестерн-блот-гибридизация
Лизаты получали из субконфлюэнтного монослоя клеток. Лизис проводили в буфере PLB (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 0,15 М NaCl, 1% NP-40, 0,5% DOC, 2 мМ EDTA, 0,1% SDS, 1 мМ PMSF, 1 мМ DTT, 0,6 мМ Na3VO4, 10 мМ NaF). Образцы разделяли в ДСН-ПААГ. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham). Для анализа экспрессии белков использовали следующие антитела: Arf6 — анти-HA (Cell Signaling); RalB — анти-RalB (Upstate); uPAR — анти-uPAR (Imgenex). Использовали вторичные козьи антимышиные и козьи антикроличьи антитела (Upstate, Cell Signaling), конъюгированные с пероксидазой хрена.
Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ
Для анализа активности протеиназ в кондиционированной среде на 6-луночные планшеты сажали 5 х 105 клеток. На следующий день меняли среду на бессывороточ-ную и через сутки отбирали кондиционированную среду. Для приготовления нативных клеточных белковых лизатов на 6-луночные планшеты сажали 5 х 105 клеток. Клетки лизировали в буфере Z (Tris 8 мМ, TritonX-100 2%) с помощью 3-кратного замораживания-оттаивания.
Лизаты образцов тканей от экспериментальных животных получали в тех же условиях.
Анализ желатиназной активности
Для анализа желатиназной активности исследуемые образцы разводили в 2 раза буфером для нанесения (0,125 М Tris-HCL pH 6,8; глицерин 20%; SDS 4%; бромфе-ноловый синий 0,05%) и проводили ДСН-ПААГ электрофорез в 8% геле с 0,2% содержанием желатина (Fluka). Гель инкубировали в 2,5% растворе Triton X-100 30 мин при комнатной температуре, затем 30 мин при комнатной температуре в буфере А (Trisma-base 0,121%; Tris-HCl 0,63%; NaCl 0,117 %; CaCl2 0,074%; Brij 35 0,2%) с последующей инкубацией в течение 4 ч при температуре 37 °С в буфере A. Гель окрашивали в течение 10 ч в растворе коллоидного кумасси G-250.
Анализ активности uPA
Для анализа активности uPA исследуемые образцы разделяли с помощью ДСН-ПААГ в 10% геле с содержанием 400 мг/мл а-казеина (Fluka) и 0,4 ед/мл плазмино-гена (Sigma). После электрофореза гель инкубировали в 2,5% растворе Triton X-100 30 мин при комнатной температуре. Затем гель инкубировался при тех же условиях в воде 30 мин, после чего его инкубировали 4 ч при температуре 37°С в буфере Б (Trisma-base 0,065%; Tris-HCl 0,315%; NaCl 0,585%; CaCl2 0,074%). Гель окрашивали в течение 10 ч в растворе коллоидного кумасси G-250.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В данной работе мы исследовали активность uPA, ММР-1, -2 и -9 в культурах клеток с различным метастатическим потенциалом, а также в образованных ими опухолях и образцах легких с метастатическими поражениями у животных. В качестве экспериментальной модели были выбраны ранее полученные в НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН линии первичных фибробластов сирийского хомяка, трансформированные вирусом саркомы Рауса: HET-SR и HET-SR1. Обе эти линии являются высокотуморогенными in vivo на син-генных иммунокомпетентных животных, однако различаются по уровню СМА, т. е. по количеству метастазов в легких, формируемых через 2 мес после подкожного введения клеточной суспензии. Так, линия HET-SR является низкометастатической (0—10 легочных метастазов на одного хомяка), линия HET-SR1 — высокометастатической (больше 100 легочных метастазов на одного хомяка). Кроме того, с целью изучения потенциального участия в опухолевой прогрессии малых ГТФаз RalB и Arf6 нами были получены производные линии HET-SR, стабильно экспрессирующие конститутивно активные формы данных белков: HET-SRRalBV23 и HET-SRArf6Q67L соответственно.
На рис. 1 представлены результаты проверки экспрессии белковых продуктов введенных генетических конструкций.
При проверке СМА in vivo принципиальные различия между родительской линией HET-SR и производными линиями HET-SRRalBV23 и HET-SRArf6Q67L не выявлены (данные не приводятся). В связи с этим в дальнейших экспериментах мы использовали три низкометастати-
1 2 3 4
В Г
Рисунок 1. Экспрессия белковых продуктов введенных генетических конструкций методом вестерн-блот с использованием антител. 1 — HET-SR pLXSN; 2 — HET-SR Arf6 Q67L; 3 — HET-SR pLXSN; 4 — HET-SR RalB V23.
А. Антитела к гемагглютинину. Б. Антитела к RalB. В. Гибридизация с антителами к актину (контроль для А). Г. Гибридизация с антителами к актину (контроль для Б).
ческие линии: исходную HET-SR и две ее производные, экспрессирующие активные формы белков RalB и Arf6, а также высокометастатическую линию HET-SR1.
На первом этапе сравнивали уровень секреции и уровень внутриклеточной продукции протеиназы uPA методом казеинплазминогеновой зимографии, а также уровень экспрессии белка uPAR.
Согласно данным, представленным на рис. 2, повышение секреции (рис. 2, А) и внутриклеточной продукции (рис. 2, Б) uPA наблюдалось в высокометастатической линии HET-SR1 по сравнению как с контрольной линией HET-SR, так и с обеими ее производными. Таким образом, в высокометастатической линии HET-SR1 увеличение активности uPA происходит изначально на уровне белковой продукции и сохраняется на уровне секреции. Анализ продукции uPAR позволил выявить, что этот белок экспрессируется на одинаково высоком уровне во всех анализируемых клеточных линиях (рис. 3).
Можно предполагать, что именно высокая активность uPA и, как следствие, секреция этого фермента во внеклеточное пространство дают преимущество клеткам высокометастатической линии HET-SR1 в ремоделировании ВКМ и, возможно, повышает ее метастатический потенциал.
Следующим этапом было исследование активности uPA in vivo в первичных опухолях и легочной ткани экспериментальных животных. Для анализа каждой линии использовалась группа из 10 животных. Опухоли, образованные клетками линии HET-SR и ее производными, отличались сходной активностью uPA, в то время как в опухолях, полученных после введения клеток HET-SR1, наблюдалась повышенная активность данного фермента (рис. 2, В). Таким образом, результаты анализа опухолевых образцов совпали с результатами исследования активности uPA в культурах клеток.
При анализе активности uPA в образцах легочной ткани экспериментальных животных выявлено, что во всех образцах, включая образцы, полученные от здоровых животных, активность uPA была достаточно высокая (рис. 2, Г). Мы не выявили достоверных различий активности uPA в легких между группами животных, кото-
Рисунок 2. Результаты анализа активности uPA методом казеин-плазминогеновой зимографии. 1 — HET-SR RalB V23; 2 — HET-SR Arf6 Q67L; 3 — HET-SR pLXSN; 4 — HET-SR1; 5 — здоровые легкие.
А. В кондиционированных средах. Б. В клеточных лизатах. В. В опухолях. Г. В образцах легких.
рым были введены клетки линии НЕТ-ЯЯ и ее производных. Однако при этом обнаружили повышение активности данного фермента в легких животных, которым были привиты клетки линии НЕТ-ЯМ. Поскольку у этой группы животных количество легочных метастазов было значительно больше, чем у других групп, можно сделать вывод о том, что количество метастазов коррелировало с активностью иРА.
Таким образом, мы показали, что активность иРА повышена как в культурах клеток с высоким метастатическим потенциалом, так и в формируемых ими первичных опухолях. В легочной ткани активность иРА была максимальной также у животных с опухолями, образованными клетками НЕТ-ЯМ, причем и количество метастазов у них было наибольшим. Среди низкометастатических производных линии НЕТ-ЯЯ различий по активности данного фермента обнаружено не было.
Дальнейшая часть работы была посвящена исследованию другой группы протеиназ, ремоделирующих ВКМ, — ММР, обладающих желатиназной активностью (ММР-1, -2 и -9). При сравнении кондиционированных культуральных сред от исследуемых клеточных линий выявлено значительное усиление секреции ММР-2 и ММР-1 клетками высокометастатической линии НЕТЯМ (рис. 4, А).
Согласно результатам сравнения внутриклеточной продукции ММР в белковых лизатах, существенные различия между клетками исследуемых линий отсутствуют (рис. 4, Б). Таким образом, линия НЕТ-ЯМ отличается от других культур уровнем секреции, но не продукции ММР-2 и ММР-1. Следует также отметить, что среди исследуемых ММР активность ММР-2 (как продукции, так и секреции) является максимальной. Активность ММР-9, достаточно низкая и в лизатах, и в кондиционированных средах всех исследуемых культур, остается неизменной.
После этого мы проводили сравнение активности ММР в первичных опухолях, а также в образцах легочной ткани животных после формирования легочных метастазов. При этом отмечено, что спектр активности же-
латиназ в опухолях меняется (рис. 4, В). В частности, активность ММР-9 повышается и становится равной аналогичному показателю ММР-2. Активность ММР-2 в опухолях, образованных клетками линии НЕТ-ЯМ, выше, чем у всех других опухолей, что соответствует результатам, полученным на образцах клеточных культур.
Сравнение образцов легких с очагами вторичного роста и легких здоровых хомяков позволило выявить, что в легочной ткани наиболее активной желатиназой является ММР-9 (рис. 4, Г). Активность ММР-2 значительно слабее, чем в опухолях, а ММР-1 практически не определяется. Кроме того, обнаружено, что уровень ММР-9 в легочной ткани животных, у которых имелись первичная опу-
1 2 3 4
uPAR Ч------
Актин <—
Рисунок 3. Результаты анализа экспрессии uPAR в клеточных лизатах методом вестерн-блот-гибридизации.
1 — HET-SR RalB V23; 2 — HET-SR Arf6 Q67L; 3 — HET-SR pLXSN; 4 — HET-SR1.
А. Гибридизация с антителами к uPAR. Б. Контрольная гибридизация с антителами к актину.
A
ММР-2 <-----
ММР-1 <—
Рисунок 4. Результаты анализа активности ММР-1, -2 и -9 методом желатиназной зимографии. 1 — HET-SR RalB V23; 2 — НЕТ^ Лг^67Ц 3 — НЕТ^ р1^^ 4 — НЕТ^1; 5 — здоровые легкие.
А. В кондиционированных средах. Б. В клеточных лизатах. В. В опухолях. Г. В образцах легких.
холь и метастазирование, был всегда выше, чем в легких контрольных животных. При этом мы не обнаружили достоверной корреляции между количеством легочных метастазов и активностью ММР-9 в образцах легочной ткани. Мы также обнаружили, что активность ММР-2 в легких животных с опухолями, образованными клетками НЕТ-ЯЯ1, остается выше, чем у животных других групп. Последнее, скорее всего, объясняется сравнительно небольшой долей опухолевых клеток линии НЕТ-ЯЯ (которые, по-видимому, в основном синтезируют ММР-2) в общей массе легочной ткани. Результаты эксперимента также свидетельствовали об отсутствии активности ММР-1 во всех исследованных образцах легочной ткани.
ОБСУЖДЕНИЕ
Система деградации ВКМ задействована на многих этапах опухолевой прогрессии. Элементы этой системы могут синтезироваться как самими опухолевыми клетками, так и микроокружением. В частности, предполагается, что ремоделирование опухолевого микроокружения с помощью систем деградации ВКМ необходимо для инвазии, высвобождения факторов роста и, возможно, как следствие — для метастазирования.
Стимуляция протеолиза системой активации плазми-ногена описана для ряда злокачественных новообразований человека [21; 25]. Однако данные об активности иРА сильно варьируют как по гистологическим типам опухолей, так и по отдельным пациентам. Усиление экспрессии ММР присуще большому спектру опухолей, включая карциномы легких, толстой кишки, молочной железы, поджелудочной железы и др. [17; 20]. Следует отметить, что усиление активности протеиназ, расщепля-
ющих ВКМ, в частности ММР, обнаружено не только в опухолевых клетках, но и в стромальных фибробластах, а также в клетках гемопоэтического ряда и в клетках, осуществляющих воспалительную реакцию [14]. Согласно имеющимся данным, экспрессия ММР-1 и -2 увеличивается в метастазах в регионарных лимфатических узлах по сравнению с первичной опухолью, что указывает на участие этих ферментов в процессе метастазирования [16]. Кроме того, существуют данные о корреляции повышенной экспрессии ММР-1 с неблагоприятным прогнозом для пациентов с различными неоплазиями [4; 11].
Мы определяли активность ферментов uPA, MMP-1, -2 и -9 in vitro в культурах трансформированных фибро-бластов с различным уровнем метастатической активности, а также в образованных ими после подкожного введения экспериментальным животным опухолях и образцах легочной ткани.
Клетки высокометастатической линии HET-SR1 характеризуются более высокой активностью uPA как на уровне продукции, так и на уровне секреции. При подкожном введении животным клетки линии HET-SR1 сохраняют данное свойство, и образованная ими опухоль также отличается повышенной активностью uPA. Необходимо отметить, что эта особенность сохраняется и в легких животных с активным метастатическим процессом. Поскольку образцы легких, в которых оценивалась активность uPA, представляют собой совокупность преимущественно эпителиальной легочной ткани, а также собственно опухолевых клеток из вторичных очагов опухолевого роста, последний результат может быть объяснен несколькими причинами. Одна из них — стимулирование клетками HET-SR1 стромальных клеток легко-
2
3
4
2
3
4
2
3
4
5
2
3
4
го к синтезу и секреции uPA. Эта гипотеза согласуется с данными литературы о роли этого фермента в процессе метастазирования [7]. Вторая возможность связана с наличием в легких большего количества клеток линии HET-SR1, синтезирующих uPA (за счет большего количества метастазов), по сравнению с HET-SR и ее низкометастатическими производными.
При сравнительном анализе активности MMP показано, что in vitro в низкометастатических клетках, а также в их производных, экспрессирующих экзогенные активированные RalB и Arf6, уровень продукции и секреции исследуемых MMP существенно не различается. В то же время уровень секреции, в отличие от уровня продукции ММР-1 и -2, в линии HET-SR1 значительно выше, чем в производных линии HET-SR. Однако in vivo в условиях тканевого микроокружения спектр активности исследованных ММР меняется. В частности, в подкожно сформированных опухолях увеличивается активность ММР-9. Активность ММР-2 в опухолях, образованных HET-SR1, наибольшая (как и при секреции in vitro).
В легочной ткани здоровых животных отмечается активность ММР-2 и -9. При возникновении опухолевого процесса и прогрессии наблюдается увеличение активности ММР-9 независимо от количества метастазов в легких. Это может свидетельствовать в пользу гипотезы существования «преметастатических ниш» [12; 15], согласно которой уровень экспрессии ММР-9 повышается в органе-мишени до формирования очагов вторичного роста опухоли. При этом мы обнаружили, что активность ММР-2 увеличивается только в легких животных, которым прививалась высокометастатическая линия HET-SR1.
Таким образом, мы показали, что активность uPA и ММР-2 повышена в клетках высокометастатической линии HET-SR1 как in vitro, так и in vivo в образованных ими подкожных опухолях и в легких при развитии метастатического процесса. При этом малые ГТФазы Arf6 и RalB не влияют на активность исследованных компонентов деградации ВКМ. Активность ММР-9 повышается в легких при возникновении органоспецифического процесса метастазирования. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейшего изучения uPA и ММР-2 в качестве потенциальных маркеров опухолевой прогрессии и метастазирования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Aguirre-Ghiso J. A., Frankel P., Farias E. F. et al. RalA requirement for v-Src- and v-Ras-induced tumorigenicity and overproduction of urokinase-type plasminogen activator: involvement of metalloproteases // Oncogene. — 1999. — Vol. 18, N 33. — P. 4718—4725.
2. Baker E. A., Bergin F. G., Leaper D. J. Plasminogen activator system, vascular endothelial growth factor, and colorectal cancer progression // Mol. Pathol. — 2000. — Vol. 53, N 6. — P. 307—312.
3. Bodemann B. O., White M. A. Ral GTPases and cancer: linchpin support of the tumorigenic platform // Nat. Rev. Cancer. — 2008. — Vol. 8, N 2. — P. 133—140.
4. Cheng S., Tada M., Hida Y. et al. High MMP-1 mRNA expression is a risk factor for disease-free and overall survivals in patients with invasive breast carcinoma // J. Surg. Res. — 2008. — Vol. 146, N 1. — P. 104—109.
5. Cockett M. I., Murphy G., Birch M. L. et al. Matrix metalloprotein-ases and metastatic cancer // Biochem. Soc. Symp. — 1998. — Vol. 63. — P. 295—313.
6. Dass K., Ahmad A., Azmi A. S. et al. Evolving role of uPA/uPAR system in human cancers // Cancer Treat. Rev. — 2008. — Vol. 34, N 2. — P. 122—136.
7. Duffy M. J. The urokinase plasminogen activator system: role in malignancy // Curr. Pharm. Des. — 2004. — Vol. 10, N 1. — P. 39—49.
8. Egeblad M., Werb Z. New functions for the matrix metalloprotein-ases in cancer progression // Nat. Rev. Cancer. — 2002. — Vol. 2, N 3. — P. 161—174.
9. Ellis V., Scully M. F., Kakkar V. V. Plasminogen activation initiated by single-chain urokinase-type plasminogen activator. Potentiation by U937 monocytes // J. Biol. Chem. — 1989. — Vol. 264, N 4. — P. 2185—2188.
10. Fu X., Parks W. C., Heinecke J. W. Activation and silencing of matrix metalloproteinases // Semin. Cell. Dev. Biol. — 2008. — Vol. 19, N 1. — P. 2—13.
11. Fujimoto D., Hirono Y., Goi T. et al. Prognostic value of protease-activated receptor-1 (PAR-1) and matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) in gastric cancer // Anticancer Res. — 2008. — Vol. 28, N 2A. — P. 847—854.
12. Hiratsuka S., Nakamura K., Iwai S. et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis // Cancer Cell. — 2002. — Vol. 2, N 4. — P. 289—300.
13. Ho W. T., Exton J. H., Williger B. T. Arfaptin 1 inhibits ADP-ribo-sylation factor-dependent matrix metalloproteinase-9 secretion induced by phorbol ester in HT 1080 fibrosarcoma cells // FEBS Lett. — 2003. — Vol. 537, N 1—3. — P. 91—95.
14. Jodele S., Blavier L., Yoon J. M. et al. Modifying the soil to affect the seed: role of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer progression // Cancer Metastasis Rev. — 2006. — Vol. 25, N 1. — P. 35—43.
15. Kaplan R. N., Riba R. D., Zacharoulis S. et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche // Nature. — 2005. — Vol. 438, N 7069. — P. 820—827.
16. Kawamata H., Nakashiro K., Uchida D. et al. Possible contribution of active MMP2 to lymph-node metastasis and secreted cathepsin L to bone invasion of newly established human oral-squamous-cancer cell lines // Int. J. Cancer. — 1997. — Vol. 70, N 1. — P. 120—127.
17. Leinonen T., Pirinen R., Bohm J. et al. Increased expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) predicts tumour recurrence and unfavourable outcome in non-small cell lung cancer // Histol. Histopathol. — 2008. — Vol. 23, N 6. — P. 693—700.
18. Mitin N., Rossman K. L., Der C. J. Signaling interplay in Ras superfamily function // Curr. Biol. — 2005. — Vol. 15, N 14. — P. 563—574.
19. Sabe H. Requirement for Arf6 in cell adhesion, migration, and cancer cell invasion // J. Biochem. — 2003. — Vol. 134, N 4. — P. 485—489.
20. Somiari S. B., Somiari R. I., Heckman C. M. et al. Circulating MMP2 and MMP9 in breast cancer — potential role in classification of patients into low risk, high risk, benign disease and breast cancer categories // Int. J. Cancer. — 2006. — Vol. 119, N 6. — P. 1403—1411.
21. Steiner E., Pollow K., Hasenclever D. et al. Role of urokinase-type plasminogen activator (uPA) and plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) for prognosis in endometrial cancer // Gynecol. Oncol. — 2008. — Vol. 108, N 3. — P. 569—576.
22. Sternlicht M. D., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. — 2001. — Vol. 17. — P. 463—516.
23. Tchevkina E., Agapova L., Dyakova N. et al. The small G-protein RalA stimulates metastasis of transformed cells // Oncogene. — 2005. — Vol. 24, N 3. — P. 329—335.
24. Wu Z. S., Wu Q., Yang J. H. et al. Prognostic significance of MMP-9 and TIMP-1 serum and tissue expression in breast cancer // Int. J. Cancer. — 2008. — Vol. 122, N 9. — P. 2050—2056.
25. Xue A., Scarlett C. J., Jackson C. J. et al. Prognostic significance of growth factors and the urokinase-type plasminogen activator system in pancreatic ductal adenocarcinoma // Pancreas. — 2008. — Vol. 36, N 2. — P. 160—167.
Поступила 23.06.2008
Vera Alexandrovna Rybko, Anna Vadimovna Knizhnik,
Yaroslav Andreyevich Kainov, Andrey Victorovich Komelkov,
Elena Maximovna Tchevkina
(The first two authors made equal contributions to this study)
EXTRACELLULAR MATRIX PROTEASE ACTIVITY IN AN EXPERIMENTAL MODEL OF TUMOR PROGRESSION
Cell and Viral Oncogene Regulation Laboratory, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478,
Russian Federation)
Address for correspondence: Rybko Vera Alexandrovna, Knizhnik Anna Vadimovna, Cell and Viral
Oncogene Regulation Laboratory, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, Russian Federation; e-mail: vera.rybko@gmail.com (Rybko Vera Alexandrovna); aknijnik@gmail.com (Knizhnik Anna Vadimovna)
This study is focused on comparative analysis of extracellular protease activity in highly and low metastatic lines of transformed fibroblasts as well as in primary lung tumors and lungs of experimental animals after subcutaneous injection of study cell lines. We showed that uPA activity was elevated significantly in the highly metastatic HET-SR1 line at both intracellular production and secretion levels. This property was also preserved in primary tumor cells and samples of lungs with metastatic lesions. As demonstrated by analysis of MMP-1, -2 and -9 activity, MMP-2 was the most actively secreted in vitro among the MMPs studied. Tissue microenvironment stimulated in vivo cell MMP-9 activity in tumors. MMP-9 was the most active in lungs. MMP-9 activity in animal lungs with primary and metastatic tumors was always increased as compared to that of healthy animals irrespective of the number of metastases. MMP-2 secretion was elevated in highly metastatic HET-SR1 cell line as well as in primary tumors originating from these cells and in lungs with metastatic lesions. These findings demonstrate that uPA and MMP-2 contribute to development of highly metastatic cell phenotype in the experimental model studied.
Key words: extracellular matrix, matrix metalloproteases (MMPs), urokinase plasminogen activator (uPA), metastases.
