CC BY
103
УДК: 616.5-006.81-06-085:615.35
особенности метастазиробания перевиваемой меланомы в16 после ингибирования активности ММП-9
М.Б. Аксененко, Л.А. Шестакова, Т.Г. Рукша
Красноярский государственный медицинский университет 660022, Россия, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1, e-mail:aksenenko_mariya@mail.ru
В эксперименте проведена оценка метастазирования меланомы кожи in vivo при селективном ингибировании ММП-9. Работа выполнена на 20 мышах линии С57В1/6 с использованием культуры клеток меланомы В16. В опытной группе отмечалось уменьшение доли животных, имеющих метастазы в печень (p<0,05), но при этом не было выявлено изменений в процессах развития метастазов в легких и селезенке. Помимо этого, у животных опытной группы определялось изменение характера метастатических очагов в виде достоверного уменьшения их размеров. Полученные результаты могут свидетельствовать о замедлении процесса метастазирования при избирательном блокировании ММП-9, а также о возможной эффективности использования селективного ингибирования ММП-9 для регуляции развития процессов метастазирования при меланоме кожи в эксперименте.
Ключевые слова: меланома кожи, метастазирование, матриксная металлопротеиназа-9 (ММП-9).
FEATURES OF METASTASIS TRANSPLANTED B16 MELANOMA AFTER INHIBITION MMP-9 M.B. Aksenenko, L.A. Shestakova, T.G. Ruksha Krasnoyarsk State Medical University named after V.F. Vojno-Yasentsky, Krasnoyarsk,
1, Partizan Zheleznyak str., 660022-Krasnoyarsk, Russia, e-mail:aksenenko_mariya@mail.ru
The purpose of this study was to evaluate the metastatic melanoma in vivo by selective inhibition of MMP-9. The work was performed on 20 mice C57B1/6, using cell cultures of B16 melanoma. The survey yielded the following results: a declining percentage of animals with liver metastases in the treatment group (p<0,05), but showed no change in the processes of development of metastases in the lungs and spleen. In addition, the treatment group of animals was determined by the changing nature of metastatic foci: recorded significant reduction in their size. These results may indicate a slowing of the process of metastasis by selective blocking of MMP-9, and the possible effectiveness of the selective inhibition of MMP-9 in regulating the development of processes of metastasis in melanoma of the skin in the experiment.
Key words: skin melanoma, metastasis, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9).
Меланома является наиболее агрессивной формой злокачественных новообразований кожи. Несмотря на последние достижения в онкологии, результаты химиотерапии пациентов с метастатической меланомой остаются неудовлетворительными в основном из-за относительной лекарственной устойчивости метастатических клеток. Метастази-рование является одной из главных причин смерти у больных злокачественными новообразованиями. Оно представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в ходе которого отдельные клетки первичной опухоли постепенно приобретают новые черты, что позволяет им проникать в окружающие ткани, мигрировать в лимфатические узлы и отдаленные органы [5, 6]. Данный процесс регулируется многими факторами, включая молекулы адгезии и протеиназы [7]. Некоторые из данных
веществ могут быть потенциально значимыми при оценке эффективности антиметастатической терапии [2].
К подобным молекулам можно отнести матрикс-ные металлопротеиназы (ММП), секретируемые опухолевыми клетками и клетками микроокружения, которые участвуют в обеспечении инвазивного роста опухолевых клеток, а также в развитии неоангиогенеза [27]. Благодаря способности ферментов данной группы к деградации внеклеточного матрикса и деструкции базальной мембраны ММП позволяют опухолевым клеткам пенетрировать стенку кровеносных сосудов [3]. Говоря о роли ММП-9, необходимо отметить то, что данный фермент играет критическую роль в развитии неоангиогенеза и инициирует образование сосудов в начальной стадии васкуляризации опухоли.
Кроме того, ММП-9 участвуют в формировании феномена «васкулогенной мимикрии», при которой опухолевые клетки способны вести себя как эндотелиальные и формировать сообщающиеся каналы между островками неопластических клеток [4] .
Различные клинико-экспериментальные исследования в последние годы сосредоточены на изучении прогностического значения матриксных металлопротеиназ, а также их тканевых ингибиторов. Большое внимание уделяется изучению ингибиторов ММП как потенциальных противоопухолевых агентов. Ингибиторы ММП нашли своё применение не только при опухолевой патологии, но и для коррекции изменений, связанных с хроническим воспалением [10]. Однако большинство исследований экспериментального характера в этом направлении заключаются в ингибировании сразу нескольких ММП [11, 13, 20]. Анализ избирательной роли ММП-9 в развитии злокачественных новообразований исследовался преимущественно на культуре клеток, но не in vivo [21, 25]. При этом подавляющее большинство работ касается ингибирования активности данного фермента при опухолях эпителиального происхождения [13, 16, 17, 20, 24]. Вместе с тем показано, что функционирование различных типов ММП в клетках кожи может разниться в значительной степени [26].
Цель работы - определение изменений характера метастазирования меланомы кожи после селективного ингибирования ММП-9 и оценка его роли в развитии опухолей неэпителиального характера.
Материал и методы
В эксперименте были использованы мыши, самки линии C57 Bl6 8-недельного возраста. Животные были получены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН, филиал «Столбовая». Культура клеток меланомы В16 была получена в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва). Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Все исследования проводились в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики». Животные были разделены на 2 группы (контрольную и опытную) случайным образом, по
10 животных в каждой группе. Перевивка опухоли производилась путём подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенк-са (1:10) по стандартным методикам. На 10-е сут после трансплантации опухоли животным опытной группы было начато введение селективного ингибитора ММП-9 (Inhibitor MMP-9 I, Calbiochem) в концентрации 5nM в количестве 0,3 мл, внутримышечно, ежедневно, однократно, в течение 7 дней. Животные находились в эксперименте до естественной гибели, после чего производился расчёт выживаемости животных-опухоленосителей в каждой группе. Кроме того, был произведен расчёт увеличения продолжительности жизни (уПж) по следующей формуле [1]:
УПЖ =
СПЖо-СПЖк
СПЖк
X 100%,
где СПЖо и СПЖк - средняя продолжительность жизни животных опытной и контрольных групп соответственно. Эффект в отношении продолжительности жизни считался значимым при УПЖ >25 %.
Внутренние органы животных осматривались, проводился подсчёт метастазов на макропрепарате при помощи лампы-лупы, после чего препараты фиксировались в 10 % забуференном формалине, затем заключались в парафин. Далее с каждого органа была получена серия гистологических срезов толщиной 5 мкм, которые впоследствии окрашивались гематоксилин-эозином. Микропрепараты оценивались под микроскопом Olympus BX 41. Подсчёт метастазов производился в основных органах метастазирования: лёгких, печени, селезёнке. Определялось количество метастатических очагов на микропрепарате, при подсчёте парные органы рассматривались как единый органокомплекс, и для них рассчитывалось среднее значение.
Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы Statistica 6,0 c определением средних значений с указанием стандартных отклонений. Значимость различий средних показателей оценивалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Существенными считали различия при p<0,05.
Результаты и обсуждение
После проведенной трансплантации культуры клеток меланомы В16 опухоль развилась у всех животных опытной и контрольной групп. При
Рис. 1. Уровень метастазирования у животных с перевиваемой опухолью - меланома В16. Различия статистически значимы по отношению к группе контроля (р<0,05)
Рис. 2. Уровень метастазирования (по данным исследования макропрепарата)
Рис. 3. Уровень метастазирования по данным микроскопического исследования
оценке полученных результатов выявлено, что средняя продолжительность жизни животных-опухоленосителей увеличилась в 1,5 раза, произошло значительное увеличение показателя УПЖ (таблица). Это позволяет говорить о достаточно выраженном антиметастатическом эффекте данного ингибитора. Меланома В16 является высокометастатической линией, широко используемой для изучения механизмов метастазирования и тестирования различных терапевтических агентов. Известно, что меланома В16 метастазирует в 2 этапа: сначала в лёгкие, а затем из лёгких в другие системы органов [23]. Как правило, высокометастатические линии опухолей способны сформировать отдаленные метастазы при подкожной имплантации. Такие линии очень популярны для исследования механизмов метастазирования и исследования антиметастатической терапии [14].
Ингибиторы ММП - это соединения, снижающие, либо блокирующие активность многих ме-таллопротеиназ, либо ингибирующие селективно активность одной из них [15]. Синтетические ингибиторы матриксных металлопротеиназ были зарегистрированы для подавления опухолевой прогрессии и ангиогенеза в условиях естественных биомоделей [18]. Кроме того, ММП-ингибиторы могут подавлять образование факторов роста, связанных с деградацией экстрацеллюлярного матрикса [22]. Многие исследования показывают, что ингибиторы ММП ингибируют метастазы в биомоделях [12]. В данном исследовании был применен ингибитор ММП-9 в концентрации, необходимой для селективного ингибирования данного фермента. Многочисленные экспериментальные исследования, проводимые на животных, показали, что процесс лимфогенного метастазиро-вания менее восприимчив к ингибиторам ММП, чем процесс гематогенного метастазирования [8]. Имеются данные о том, что ингибиторы ММП ингибируют гематогенное метастазирование как с точки зрения количества, так и размеров опухолевых очагов [22] и могут быть полезны в
Таблица
Па раметры эффективности антиметастатического воздействия
Параметры Контрольная группа (п=10) Опытная группа (п=10) Р
СПЖ, дни 23,8 ± 2,6 32,6 ± 6,3 0,003
УПЖ, % - 37%
комбинации со стандартной химиотерапией или иммунотерапией [19].
В ходе проведенного исследования наличие метастазов определялось в лёгких, печени, селезенке в обеих группах животных-опухоленосителей (рис. 1-3). В контрольной группе метастазы в лёгкие отмечались у всех животных, в опытной группе метастазы не определялись у 30 % животных. Количество же метастазов в лёгкие на макро- и микропрепаратах достоверно не различалось. На микропрепарате у животных контрольной группы метастазы были обширными и носили сливной характер. В опытной группе они были менее обширными, носили очаговый характер. Отмечалось статистически значимое уменьшение процента животных, имеющих метастазы в печень (p<0,05). Среднее количество метастазов в печень на макропрепарате в опытной и контрольной группах не различалось (р>0,05). Не отличалось и расположение метастатических очагов в контрольной и опытной группах, они носили чётко сгруппированный характер. Характер метастазирования в селезёнку не отличался в сравниваемых группах, метастазы в данный орган были представлены в виде крупных очагов. При проведении данного исследования был выявлен факт несоответствия количества метастазов на макропрепарате и микропрепарате в обеих группах, что может быть следствием наличия микрометастазов в обеих группах, выявляемых только при микроскопическом исследовании.
Говоря о характере метастазирования после ингибирования активности ММП-9, можно предполагать, что данный ингибитор оказывает воздействие на гематогенное метастазирование, в частности, об этом может свидетельствовать факт уменьшения количества животных, имеющих метастазы в печень. В процессе исследования не было выявлено статистически значимых различий в количестве метастазов по сравнению с контролем. Данный факт может объясняться тем, что животные находились в эксперименте до естественной гибели, поскольку к моменту гибели количество метастазов в контрольной и опытных группах становится примерно одинаковым. Гибель животных происходит при наличии определённого количества метастазов во внутренних органах, главным образом в легких. приводя тем самым к развитию лёгочной недостаточности. Тем не менее можно предполагать, что процесс метастазирования при селективном инги-
бировании ММП-9 происходит более медленно, что подтверждает факт увеличения продолжительности жизни животных-опухоленосителей. Кроме того, в процессе экспериментального лечения увеличивалась двигательная активность животных после проведения экспериментального лечения, что также может свидетельствовать о замедлении процесса метастазирования.
Таким образом, можно считать, что контроль за протеолитической активностью может быть использован в качестве рациональной противоопухолевой терапевтической стратегии, а ММП-9 можно считать эффективной молекулярной мишенью в разработке антиметастатической терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трещалина ЕМ., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У Хабриева. М.: ОАО «Медицина», 2005. 832 с.
2. Bianchini F., Alessio S., Fibbi G. et at. Cytokine-dependent invasiveness in B16 murine melanoma cells: role of uPA system and MMP-9 // Oncol. Rep. 2006. Vol. 15 (3). P. 709-714.
3. Birkedal-Hansen H. Proteolytic remodeling of extracellular matrix // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. Vol. 7 (5). P. 728-735.
4. Bergers G., Brekken R., McMahon G. et at. Matrix metalloprotei-nase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis // Nature Cell Biol. 2000. Vol. 2 (10). P. 737-744.
5. Blackburn J.S., Rhoders C.H., Coon C.I., Brinckerhoff C.E. RNA interference inhibition of matrix metalloproteinase-1 prevents melanoma metastasis by reducing tumor collagenase activity and angiogenesis // Cancer Res. 2007. Vol. 67 (22). P. 10849-10858.
6. Chakraborty A.K., Sodi S., Rachkovsky M. et al. A spontaneous murine melanoma lung metastasis comprised of host x tumor hybrids // Cancer Res. 2000. Vol. 60 (9). P 2512-2519.
7. Daniele A., Zito A.F., Giannelli G. et al. Expression of metallopro-teinases MMP-2 and MMP-9 in sentinel lymph node and serum of patients with metastatic and non-metastatic breast cancer // Anticancer Res. 2010. Vol. 30 (9). P 3521-3527.
8. Deryugina E.I., Quigley J.P. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis // Cancer Metastasis Rev. 2006. Vol. 25 (1). P. 9-34.
9. Gaggar A., Jackson P.L., Noerager B.D. et al. A novel proteolytic cascade generates an extracellular matrix-derived chemoattractant in chronic neutrophilic inflammation // J. Immunol. 2008. Vol. 180 (8). P. 5662-5669.
10. Gaggar A., Li Y., Weathington N. et al. Matrix metalloprotease-9 dysregulation in lower airway secretions of cystic fibrosis patients // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2007. Vol. 293 (1). P. 96-104.
11. Hara T., Miyazaki H., Lee A. et al. Androgen receptor and invasion in prostate cancer // Cancer Res. 2008. Vol. 68 (4). P. 1128-1135.
12. HidalgoM., Eckhardt S.G. Development of matrix metalloprotei-nase inhibitors in cancer therapy // J. Natl. Cancer Inst. 2001. Vol. 93 (3). P. 178-193.
13. Lubbe W.J., Zhou Z.Y., Fu W. et al. Tumor epithelial cell matrix metalloproteinase 9 is a target for antimetastatic therapy in colorectal cancer // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12 (6). P. 1876-1882.
14. Miller F.R., Heppner G.H. Cellular interactions in metastasis // Cancer Met. Rev. 1990. Vol. 9 (1). P. 21-34.
15. Naglich J.G., Jure-Kunkel M., Gupta E. et al. Inhibition of angio-genesis and metastasis in two murine models by the matrix metalloproteinase inhibitor, BMS-275291 // Cancer Res. 2001. Vol. 61 (23). P. 8480-8485.
16. Okawa T., Michaylira C.Z., Kalabis J. et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation // Genes Dev. 2007. Vol. 21 (21). P. 2788-2803.
17. Olsen C.E., Liguori A.E., Zong Y. et al. Arsenic upregulates MMP-9 and inhibits wound repair in human airway epithelial cells // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2008. Vol. 295 (2). P 293-302.
18. Powell W.C., Matrisian L.M. Complex roles of matrix metal-loproteinases in tumor progression // Curr. Topics Microbiol. Immunol. 1996. Vol. 213. P. 1-21.
19. Riedlinger G., Kridel S., Al-Housseini A.M. et al. Metastatic melanoma and matrix metalloproteinases // Drugs Fut. 2003. Vol. 28 (9). P. 897.
20. Seiler R., Thalmann G.N., Fleischmann A. MMP-2 and MMP-9 in lymph-node-positive bladder cancer // J. Clin. Pathol. 2011. Vol. 64(12). P. 1078-1082.
21. Sheu B.C., Hsu S.M., Ho HM. et al. A novel role of metallopro-teinase in cancer- mediated immunosuppression // Cancer Res. 2001. Vol. 61. P. 237-242.
22. Southgate KM., Davies M., Booth R.F, Newby A.C. Invo lvement of extracellular-matrix-degrading metalloproteinases in rabbit aortic smooth-muscle cell proliferation // J. Biochem. 1992. Vol. 288. P. 93-99.
23. Stackpole C.W., Valle E.F., Alterman A.L. B16 melanoma metastasis to an «artificial organ» implant // Cancer Res. 1991. Vol. 51 (9). P. 2444-2450.
24. Williams T.M., Medina F., Badano I. et al. Caveolin-1 gene disruption promotes mammary tumorigenesis and dramatically enhances lung metastasis in vivo. Role of Cav-1 in cell invasiveness and matrix metalloproteinase (MMP-2/9) secretion // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279 (49). P. 51630-51646.
25. Xu D., SuenagaN., EdelmannM.G. et al. Novel MMP-9 substrates in cancer cells revealed by a label-free quantitative proteomics approach // Mol. Cell. Proteomics. 2008. Vol. 7 (11). P. 2215-2228.
26. XueM., Jackson C.J. Autocrine actions of matrix metalloproteinase (MMP)-2 counter the effects of MMP-9 to promote survival and prevent terminal differentiation of cultured human keratinocytes // J. Invest. Dermatol. 2008 (11). Vol. 128. P. 2676-2684.
27. Yoon S.O., ParkS.J., Yun C.H., ChungA.S. Roles of matrix metal-loproteinases in tumor metastasis and angiogenesis // J. Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol. 36 (1). P. 128-137.
nocTynuna 17.10.11
