CC BY
61
УДК 612.014.1:616-006:577.15
СООТНОШЕНИЕ ПРОФОРМ И АКТИВНЫХ ФОРМ ММП-2, -7 В ТКАНИ ОПУХОЛИ И ЛЕГКИХ С МЕТАСТАЗАМИ В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС У МЫШЕЙ
Яна Анатольевна КИСАРОВА
НИИ физиологии СО РАМН,
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Исследовано соотношение проформ и активных форм матриксных металлопротеаз (ММП -2, -7) в ткани опухоли и легких с метастазами при аденокарциноме легких Льюис (АЛЛ). Развитие опухоли (на 20-е сут. по сравнению с 15-ми сут.) характеризовалось увеличением общей активности ММП-2, -7 (активная форма + проММП-2, -7) в ткани опухоли за счет преобладания проММП-2, -7. Выявлена положительная корреляционная связь между весом опухоли и содержанием проММП-2, -7 в ткани опухоли мышей с АЛЛ. В ткани легких интактных животных преобладала проММП-2, -7. Развитие метастазов в легких сопровождалось увеличением общей активности ММП-2, -7 на всех исследованных сроках (7-е, 15-е и 20-е сут. после перевивки опухоли) за счет увеличения активной формы и снижения проММП-2, -7. Выявлена положительная корреляционная связь между общей активностью ММП-2, -7 и активной формой ММП-2, -7 в ткани легких мышей с АЛЛ. Обнаружено, что соотношение проформ и активных форм ММП-2, -7 в ткани опухоли отличается от соотношения этих показателей в ткани легких с метастазами, что указывает на различную роль проформ и активных форм ММП-2, -7 в клетках опухоли и метастазах.
Ключевые слова: матриксные металлопротеазы, проформы матриксных металлопротеаз, аденокар цинома легких Льюис, метастазирование.
Введение
Матриксные металлопротеазы (ММП) — группа цинкзависимых эндопептидаз, которые участвуют в деградации внеклеточного матрикса (ВКМ). ММП (ММП-2, ММП-7, ММП-9) образуются в виде зимогенов с секреторной сигнальной последовательностью и пропептидом, содержащим «законсервированный» цистеин, ковалентно связанный с цинком каталитического домена. При активации ММП освобождается каталитический участок, происходит аутокаталитическое разрушение пропептида и образуется активная форма ММП [1]. In vitro латентные формы ММП могут быть активированы различными протеазами, включая плазмин, ММП-3, МТ1-ММП, а также некоторыми ртутьсодержащими соединениями. In vivo активация проММП происходит с помощью цитокинов, факторов роста, а также за счет изменений клеточно-ВКМ и клеточно-клеточных взаимодействий [1]. Активные формы различных ММП (ММП-2, -7, -9) расщепляют компоненты ВКМ, обеспечивая инвазию и ангиогенез опухоли при развитии опухолевого процесса, способствуют диссеминации опухолевых клеток и прогрессированию рака [2]. До настоящего времени неясно, какова роль проформ и активных форм ММП в патогенезе различных опухолей и метастазов у человека и животных.
ММП-2 (желатиназа А) экспрессируется стро-мальными клетками, фибробластами и макрофагами, ассоциированными с опухолью (популяция М2) [3, 4]. Так, экспрессия и активность ММП-2 в
ткани опухоли и в сыворотке крови при аденокарциноме легких у человека, карциноме яичников, мочевого пузыря и нейробластоме коррелирует с прогрессированием опухолевого процесса [3]. Активность проММП-2 увеличивается в сыворотке крови больных раком молочной железы параллельно прогрессированию опухолевого процесса: обнаружена положительная корреляция между активностью проММП-2 и размером данной опухоли [5]. Активная форма МмП-2 и проММП-2 имеют более высокие значения в ткани опухоли при колоректальном раке по сравнению со здоровыми тканями у людей [6]. Однако при раке мочевого пузыря неблагоприятный прогноз коррелирует с низким уровнем проММП-2 в сыворотке крови [7]. В отличие от ММП-2, ММП-7 экспрессируется клетками опухоли, а не стромальными клетками [8]. Имеются единичные работы, посвященные изучению роли проММП-7 в развитии опухолей у человека и животных.
Несмотря на наличие исследований экспрессии ряда ММП и работ с использованием иммунофер-ментного анализа, роль активных форм различных ММП и проММП в патогенезе разных типов опухолей остается малоизученной.
Цель работы — изучить соотношение проформ и активных форм ММП-2, -7 в ткани опухоли и легких с метастазами в динамике развития аденокарциномы легких Льюис (АЛЛ) у мышей.
Материал и методы
Работа проведена на половозрелых мышах самцах линии С57В1/6 массой 20—27 г (виварий Института
Кисарова Я.А. — аспирант лаборатории клеточной биохимии и физиологии, e-mail: y_kisarova@physiol.ru 138 БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 31, № 2, 2011 г.
цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск). Содержание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.). Животных содержали по 6-7 особей в клетке при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище (гранулированный комбикорм ПК 120-1 ООО «Ла-бораторснаб», г. Москва) для лабораторных крыс и мышей. Исследование проводили согласно рекомендациям Этического комитета НИИ физиологии СО РАМН о гуманном обращении с животными.
Использовали экспериментальную опухоль мышей — аденокарцинома легких Льюис. Опухолевые клетки перевивали в мышцы бедра в количестве (0,5—1,0) х 106 на мышь. Известно, что при перевивке АЛЛ внутримышечно в указанном количестве опухоль специфически метастазирует в легкие, а в другие органы (селезенка и др.) метастазирование отсутствует или представлено минорно (на порядок меньше) [9, 10]. Забой животных осуществляли де-капитацией на 7 (начало развития метастазов), 15 (прогрессирование опухолевого процесса) и 20 сут. (максимальное развитие опухоли и метастазов) после трансплантации опухоли. Определяли массу опухоли, легких (орган, из которого произошла АЛЛ) и селезенки. Все процедуры приготовления гомогенатов проводили на холоде (0 ... +4 °С). Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури. Для исследования активности ММП-2, -7 пробы обрабатывали тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,1 % (объем/объем 1:1) в течение 30 минут на холоде. Концентрация белка в пробах составляла 8—12 мг/мл.
Активность ММП-2, -7 в гомогенатах опухоли, легких и селезенки определяли по методу Knight C.G. et al. при pH 7,5 против субстрата MCA-Pro-Leu-Gly~Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 («American Peptide Company, Inc.», США), где MCA — 7-метоксикумарин-4-ацетил, Dpa — ^3-(2,4-ди-нитрофенил)^- а, ß -диаминопропионил, гаситель флуоресценции [11]. С помощью данного субстрата определяется активность ММП-2, -7, которые расщепляют связь Gly~Leu. Реакцию останавливали добавлением 50 мкМ охлажденного раствора ЭДТА. Интенсивность флуоресценции определяли с помощью спектрофлуориметра Shimadzu RF-5301 PC (Япония) при длине волн возбуждения и эмиссии соответственно 328 и 393 нм. В качестве стандарта использовали 7-метилкумарин («ICN Biomedicals Inc.», США).
Определение активности ММП-2, -7 проводили в присутствии специфичного ингибитора сериновых протеаз фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) («Boehringer Mannhein», Германия) в концентрации
0,5 мМ для исключения их влияния в расщеплении используемого субстрата. Для активации латентных форм ММП-2, -7 использовали специфичный акти-
ватор ММП аминофенилмеркурий-ацетат (АФМА) в конечной концентрации 1 мМ (любезно предоставлен проф. Ch. Overall, University of British Columbia, Vancouver, Canada). Пробы инкубировали в течение 120 минут при температуре 37 °С в присутствии АФМА (активная форма + + проММП) и без АФМА (активная форма ММП). Результаты выражали в мкмоль МКА/мин на 1 г белка для го-могенатов ткани.
Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью пакета Statistica 6.0. Форму распределения оценивали критерием Колмогорова — Смирнова, значимость различий средних — однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) и t-критерием Стьюдента. Уровень значимости а принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
Ранее нами показано, что развитие АЛЛ (на 16 сут., когда отмечено прогрессирование опухоли и развитие метастазов) характеризуется увеличением активности ММП в ткани легких, а в ткани опухоли активность ММП (активная форма) ниже, чем в легких с метастазами [12]. В связи с этим представляло интерес проследить изменения активности ММП в динамике развития и метаста-зирования АЛЛ с учетом соотношения активных и проформ ММП.
Обнаружено, что в ткани опухоли происходит увеличение содержания проформ ММП-2, -7 на 20 сут. после перевивки по сравнению с тканью опухоли мышей с АЛЛ на 15 сут. (рис. 1). Выявлена положительная корреляционная связь между весом опухоли и содержанием в ней проММП-2, -7 (r = 0,68, p < 0,05). Известно, что развитие рака является результатом взаимодействия опухолевых клеток с активированными клетками стромы, а также с динамическим микроокружением, в котором они находятся. Присутствие опухолевых
I I ММП-2,-7
I I проММП-2,-7
15 сут.
20 сут.
Рис. 1. Активность ММП-2,-7 в ткани опухоли мышей с АЛЛ.
* — р<0,001 по сравнению с тканью опухоли мышей с АЛЛ на 15 сутки после перевивки
Рис. 2А. Соотношение активных форм ММП-2, -7 и проММП-2,7 в легких мышей в динамике развития АЛЛ.
* — р < 0,05 по сравнению с легкими интактных мышей; ** — р < 0,05 по сравнению с легкими интактных мышей и мышей с АЛЛ на 7 сутки после перевивки; а — р < 0,05 по сравнению с легкими интактных мышей
клеток в прилежащих здоровых тканях приводит к активации фибробластов и иммунных клеток. Клетки опухоли и активированные ими фибробла-сты и иммунные клетки секретируют различные факторы, включая ММП-2 и ММП-9 [13]. ММП инициируют ремоделирование всех компонентов ВКМ, приводя к высвобождению содержащихся в нем медиаторов и активации латентных факторов роста [13].
У интактных животных в ткани легких преобладает проММП-2, -7; общая активность ММП-2, -7 (активная форма + проММП-2, -7) в ткани легких выше, чем в селезенке (рис. 2).
В процессе развития метастазов в легких увеличивается общая активность ММП-2, -7 за счет активных форм ММП-2, -7 (рис. 2А). Выявлена положительная корреляционная связь между общей активностью ММП-2, -7 и активной формой ММП-2, -7 в ткани легких мышей с АЛЛ (г = 0,91, р < 0,05), что указывает на значительный вклад последней в формирование метастазов. Одновременно у этих животных происходит снижение латентных форм ММП-2, -7 в ткани легких, что возможно, связано с их трансформацией из неактивного состояния в активное (рис. 2А).
Для исследования влияния опухоленоситель-ства определяли активность ММП-2, -7 в селезенке. На всех исследуемых сроках (7, 15, 20 сут. после перевивки опухоли) отмечено увеличение как активной, так и латентной форм ММП-2, -7 и проММП-2, -7 в селезенке опухоленосителей относительно соответствующих показателей селезенки интактных животных (рис. 2Б). Выявлена положительная корреляционная связь между весом селезенки и активной ММП-2, -7 и проММП-2,
Рис. 2Б. Соотношение активных форм ММП-2, -7 и проММП-2,-7в селезенке мышей в динамике развития АЛЛ.
* — р < 0,05 по сравнению с селезенкой интактных мышей и мышей с АЛЛ на 7 сутки после перевивки; ** — р < 0,05 по сравнению с селезенкой интактных мышей и мышей с АЛЛ на 7 и 15 сутки после перевивки
-7 (г = 0,55 и г = 0,47 соответственно, р < 0,05). Вероятно, это обусловлено значительным притоком макрофагов, фибробластов и других иммунных клеток в селезенку, что способствует увеличенной продукции ММП при опухоленосительстве.
Заключение
Таким образом, можно сделать заключение, что развитие АЛЛ характеризуется увеличением общей активности ММП-2, -7 как в ткани опухоли, так и в легких мышей. В ткани опухоли увеличивается содержание проММП-2, -7, что связано, вероятно, с пролиферацией опухолевых клеток. В легких мышей с АЛЛ отмечается повышение активности ММП-2, -7 и снижение проММП-2, -7, что способствует развитию и увеличению количества метастазов. Можно предположить, что обнаруженное снижение проММП-2, -7 в ткани легких свидетельствует об ее активном участии в процессе развития метастазов. Опухоленоситель-ство характеризовалось увеличением содержания как активной, так и латентной форм ММП-2, -7 в селезенке, коррелировавшим с весом органа и отличавшимся от соответствующих показателей опухоли и легких с метастазами, что свидетельствует о вовлечении селезенки в опухолевый процесс и требует дальнейшего изучения.
Благодарности
Выражаю признательность и благодарность научному руководителю данной работы — д.м.н., профессору Короленко Татьяне Александровне — заведующей лабораторией клеточной биохимии и физиологии НИИ физиологии СО РАМН, а также ведущему научному сотруднику Института цитологии и генетики СО РАН, к.б.н. Каледину Васи-
лию Ивановичу за помощь при работе с животными с аденокарциномой легких Льюис.
Список литературы
1. Amalinei C., Caruntu I-D., Balan R.A. Biology of metalloproteinases // Rom. J. Morphol. Embryol. 2007. 48. (4). 323-334.
2. Murphy G., Nagase H. Progress in matrix met-alloproteinase research // Mol. Aspects Med. 2008. 29. 290-308.
3. Vihinen P., Kahari V.-M. Matrix metalloproteinases in cancer: prognostic markers and therapueutic targets // Int. J. Cancer. 2002. 99. 157-166.
4. Lamagna C., Aurrand-Lions M., Imhof B.A. Dual role of macrophages in tumor growth and angio-genesis // J. Leukocyte Biol. 2006. 80. 705-713.
5. Stankovic S., Konjevic G., Gopcevic K. Activity of MMP-2 and MMP-9 in sera of breast cancer patients // Pathol. Res. Pract. 2010. 206. (4). 241-247.
6. Murnane M.J., Cai J., Shuja S. Active MMP-2 effectively identifies the presence of colorectal cancer // Int. J. Cancer. 2009. 125. (12). 2893-2902.
7. Vasala K., Kuvaja P., Turpeenniemi-Hujanen T. Low circulating levels of ProMMP-2 are associated with adverse prognosis in bladder cancer // Tumor Biol. 2008. 29. (5). 279-286.
8. Wang F., So J., Reierstad S. et al. Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase // Int. J. Cancer 2005. 114. 19-31.
9. Osinsky S.P., Ganusevich I.I., Bubnovskaya L.N. et al. Hypoxia level and matrix metalloproteinases-2 and -9 activity in Lewis lung carcinoma: correlation with metastasis // Exp. Oncol. 2005. 27. (3). 202205.
10. Жанаева С.Я., Алексеенко Т.В., Короленко Т.А. Влияние хлорида гадолиния на рост и ме-тастазирование аденокарциномы легких Льюис у мышей // Бюл. экспер. биол. мед. 2008. 146. (11). 548-551.
Zhanaeva S.Ya., Alekseenko T.V., Korolenko T.A. Effect of gadolinium chloride on the growth and metastasizing of Lewis pulmonary adenocarcinoma in mice // Byul. exper. biol. med. 2008. 146. (5). 612-615.
11. Knight C.G., Willenbrock F., Murphy G. A novel coumarin-labelled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinases // FEBS Lett. 1992. 296. 263-266.
12. Кисарова Я.А. Активность матриксных ме-таллопротеаз у мышей при развитии и метастази-ровании аденокарциномы легких Льюис // Бюл. СО РАМН. 2010. (4). 154-158.
Kisarova Ya.A. Matrix metalloproteases activity in mice with lung adenocarcinoma growth and metastasis into lungs // Byul. SO RAMN. 2010. (4). 154-158.
13. Stamenkovic I. Extracellular matrix remodeling: the role of matrix metalloproteinases // J. Pathol. 2003. 200. 448-464.
BALANCE BETWEEN LATENT AND ACTIVE FORMS OF MMP-2, -7 IN TUMOR TISSUE AND METASTATIC LUNG TISSUE IN DYNAMICS OF LEWIS LUNG ADENOCARCINOMA GROWTH IN MICE
Yana Anatoljevna KISAROVA
Institute of Physiology SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 4
The balance between latent and active forms of matrix metalloprotease-2, -7 (MMP-2, -7) in tumor tissue and lungs with metastases in mice with Lewis lung adenocarcinoma (LLA) has been investigated. The tumor growth (20th day as compare to 15th day) has been defined by the increased total activity of MMP-2, -7 (active + latent forms of MMP-2, -7) in tumor tissue at the expense of proMMP-2, -7 prevalence. The positive correlation between tumor weight and proMMP-2, -7 content in tumor tissue of LLA mice has been revealed. The proMMP-2, -7 prevailed in lung tissue of intact mice. Metastases growth in lungs was followed by the increased total activity of MMP-2, -7 at fixed times (7th, 15th and 20th day after tumor transplantation) at the expense of increase in active MMP-2, -7 and decrease in latent MMP-2, -7 form. The positive correlation between the total activity of MMP-2, -7 and active MMP-2, -7 in lung tissue of mice with LLA has been revealed. It has been found that the balance between proMMP-2, -7 and active MMP-2, -7 in tumor tissue differs from the balance between very same measures in tissue of lungs with metastases. These data show different role of latent and active forms of MMP-2, -7 in tumor cells and metastases.
Key words: matrix metalloproteases, latent MMP, Lewis lung adenocarcinoma, metastasis.
Kisarova Ya.A. — post-graduate student, laboratory of cellular biochemistry and physiology, e-mail: y_kisarova@physiol.ru
