CC BY
9
УДК 547.484.22
DOI: 10.17122/bcj-2018-1-5-73-76
Г. А. Файзуллина (магистрант), А. О. Ленкова (асп.), Д. Р. Нигметзянова (магистрант), А. В. Зорин (к.х.н., в.н.с.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ АЛКИЛОВЫХ ЭФИРОВ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)2431935, e-mail: chemist.518@mail.ru
G. A. Faizullina, A. O. Lenkova, D. R. Nigmetzyanova, A. V. Zorin, V. V. Zorin
ENANTIOSELECTIVE REDUCTION OF ALKYL ESTERS
OF PYRUVIC ACID
Ufa State Petroleum Technological Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347)2431935, e-mail: chemist.518@mail.ru
Исследована способность дрожжевых культур Rhodotorula glutinis ВКПМ Y3576 и Pichia anómala 80-11 к энантиоселективному восстановлению пропил ового, бутилового и амилового эфиров пировиноградной кислоты до соответствующих эфиров 2-гидроксипропионовой кислоты. Установлено, что при 30—32 оС в течение 48 ч в присутствии клеток Rhodotorula glutinis ВКПМ Y3576 образуются пропиловый и бутиловый эфиры 2S-(—)-гидроксипропионовой кислоты с выходами 56 и 96 % и оптической чистотой 81 и 93 % ее, а под действием культуры Pichia anomala 80-11 — с выходами 29 и 98 % и оптической чистотой 76 и 96 % ее, соответственно. Амиловый эфир 25-(—)-гидроксипропионо-вой кислоты под действием этих культур образуется значительно быстрее. В течение 1 ч выходы достигают 89 и 88 % при энантиомерной чистоте 82 и 96 % ее, соответственно.
Ключевые слова: алкиловые эфиры пировиноградной кислоты; алкиловые эфиры 2-гидро-ксипропионовой кислоты; дрожжевые культуры; энантиоселективное восстановление.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки России в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности (№ 4.6451.2017/8.9).
Энантиомерно чистые 2-гидроксикарбоно-вые кислоты являются важными промежуточными продуктами в синтезе фармацевтических препаратов Они находят широкое применение в косметологии в качестве противовоспалительного и антимикробного средств, а также пищевой промышленности как консерванты и регуляторы кислотности 2-4.
Дата поступления 18.01.17
The ability of two yeast cultures Rhodotorula glutinis VKPM Y3576 and Pichia anomala 80-11 to enantioselective reduction of propyl, butyl and pentyl esters of pyruvic acid to the corresponding esters of 2-hydroxypropionic acid was studied. It was found that at 30—32 0C for 48 hours in the presence of Rhodotorula glutinis VKPM Y3576 cells propyl and butyl esters of 2S-(—)-hydroxypropionic acid are formed with yields of 56 and 96 % and optical purity of 81 and 93 % ee, and the action of the Pichia anomala 80-11 culture - with yields of 29 and 98 % and optical purity of 76 and 96 % ee, respectively. The 2S-(—)-hydroxypropionic acid pentyl ester forms much faster under the action of these cultures. Within 1 hour the yields reach 89 and 88 % with enantiomeric purity of 82 and 96 % ee, respectively.
Key words: alkyl esters of pyruvic acid; alkyl esters of 2-hydroxypropionic acid; yeast cultures; enantioselective reduction.
The work was supported by the Ministry of Education and Science of Russia within the framework of the basic part of the state task in the field of scientific activity (№ 4.6451.2017 / 8.9)
Сложные эфиры 2-гидроксипропионовой кислоты входят в состав экологически биораз-лагаемых смесей, обладающих широким спектром дезинфицирующего и антимикробного действия 5.
Нами исследована возможность получения энантиомерно чистых алкиловых эфиров 2-гидроксипропионовой кислоты путем энан-тиоселективного восстановления алкиловых
эфиров пировиноградной кислоты в присутствии клеток дрожжей Rhodotorula glutinis ВКПМ Y3576 и Pichia anómala 80-11.
1. Rhodotorula glutinis ВКПМ Y3576 OR 2. Pichia anomala 80-11
OH
OR
1-3
R = C3H7 (1, 4); C4H9 (2, 5); С5Нц (3, 6).
O
4-6 2S-(-)
Установлено, что дрожжи ЯкойоЬоти1а дЫИтэ ВКПМ У3576 и Р1еН1а апота1а 80-11 в течение 48 ч в аэробных условиях при температуре 30—32 °С в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 г/л субстрата и 25 г/л биомассы, восстанавливают пропиловый, бутиловый и амиловый эфиры пировиноградной кислоты 1—3 в соответствующие эфиры 2-гид-роксипропионовой кислоты 4—6 (табл. 1).
Анализ кинетики накопления продуктов 4—6 в процессе биовосстановления алкиловых эфиров пировиноградной кислоты в присутствии клеток культуры ЯкойоЬоти1а дЫНпгз ВКПМ У3576 показывает, что продукт 4 образуется с сравнительно низкой скоростью и в течение 48 ч его выход составляет лишь 56%, а выход продукта 5 в течение того же времени
достигает 96%. Образование продукта 6 протекает с большей скоростью, так как в течение 1 ч его выход составил 89%. При увеличении продолжительности реакции более, чем до 1 ч наблюдается протекание обратной реакции, ведущей к образованию исходного амилового эфира пировиноградной кислоты.
В присутствии клеток культуры Р1еЫа апота1а 80-11 выход продуктов 4 и 5 в течение 48 ч составил 29 и 98 %, а продукта 6 в течение 1 ч - 88%.
Исследование оптических свойств продуктов 4—6 показало, что культуры ЯкойоЬоти1а дЫИтэ ВКПМ У3576 и Р1еН1а апота1а 80-11 энантиоселективно осуществляют восстановление алкиловых эфиров пировиноградной кислоты с преимущественным образованием алкиловых эфиров 25-(—)-гидроксипропионовой кислоты (табл. 2).
Таким образом, ЯкойоЬоти1а д1иЬгпг$ ВКПМ У3576 и Р1еН1а апота1а 80-11 являются перспективными культурами для энантиосе-лективного восстановления алкиловых эфиров пировиноградной кислоты.
Строение продуктов подтверждено спектральными методами ЯМР и 13С спектроскопии и хромато-масс-спектрометрии.
O
O
Таблица 1
Выходы продуктов восстановления алкиловых эфиров пировиноградной кислоты в присутствии микроорганизмов Rhodotorula glutinis ВКПМ Y3576 и Pichia anomala 80-11 при 30-32 оС, в 0.1М фосфатном буфере (рН 7)
Время,ч Выход продуктов, %
R. glutinis ВКПМ Y3576 Pichia anomala 80-11
4 5 6 4 5 6
0.25 3 14 80 2 17 83
0.50 6 29 84 3 39 84
0.75 10 42 88 5 53 86
1 12 58 89 6 62 88
2 25 72 52 12 81 80
6 42 88 11 20 92 36
12 46 90 - 21 94 -
24 48 93 - 25 95 -
48 56 96 - 29 98 -
Таблица 2
Оптическая чистота алкиловых эфиров 25-(-)-гидроксипропионовой кислоты (2, 4, 6) при восстановлении пировиноградной
кислоты с помощью микроорганизмов
^^^^ П родукт Кул ьту ра ^^^^ дрожжей ^^^^ Пропиловый эфир 25-(-)-гидрокси-пропионовой кислоты! Бутиловый эфир 2 5-(-)-гидрокси-пропионовой кислоты Амиловый эфир 2Б-(-)-гидрокси-пропионовой кислоты
Оптическая чистота*, % ее
R. glutinis ВКПМ Y3576 81 93 82
Pichia anomala 80-11 76 96 96
* - по данным энантиоселективного ГЖХ-анализа
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР и ЯМР 13С записаны в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (300.13 МГц (1Н) и 75.47 МГц (13С)) и Bruker АМ-500 (600.30 МГц (1Н) и 159.96 МГц (13С)). Химические сдвиги в спектрах ЯМР 1Н измеряли относительно ТМС, в спектрах ЯМР 13С — относительно сигнала растворителя (77.0 м.д.). Хромато-масс-спектральный анализ проводили на приборе GCMS-QP2010S Shimadzu (электронная ионизация при 70 эВ). Хроматографи-ческий анализ продуктов проводили на программно-аппаратном комплексе Хроматэк-Крис-талл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором, газ-носитель — гелий (1.1 мл/мин), энантиоселективная колонка Astec CHIRAL-DEXTM B-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 х мкм). Удельное вращение полученных продуктов ([a]D продукта) измеряли на автоматическом поляриметре АА-55 Optical Activity Ltd. (X = 589 нм). Стандартная величина удельного вращения бутилового эфира 25-(—)-гидроксипро-пионовой кислоты [a]D20 = —13 o 6.
Пировиноградную кислоту и ее алкило-вые эфиры синтезировали по известным мето-
7 8
дикам .
Пропиловый эфир пировиноградной кислоты 1. Выход 87%. Спектр ЯМР 1Н, 5, м. д.: 0.98 т (3Н, СН3), 1.65-1.78 м (2H, СН2), 2.43 с (3Н, СН3), 4.18 т (2Н, СН20). Спектр ЯМР 13С, 5с, м. д.: 10.66 (1С, CH3), 21.86 (1С, CH2), 26.65 (1С, CH3), 67.61 (1С, CH20), 169.82 (1С, COO-), 189.78 (1С, C=0).
Бутиловый эфир пировиноградной кислоты 2. Выход 97%. Спектр ЯМР !Н, 5, м. д.: 0.91 т (3Н, СН3), 1.35-1.53 м (2Н, СН2), 1.541.68 м (2Н, СН2), 2.43 с (3Н, СН3), 4.13 т (2Н, СН20). Спектр ЯМР 13С, 5с, м.д.: 13.64 (1С, CH3), 18.94 (1С, CH2), 26.47 (1С, CH3), 30.37 (1С, CH2), 64.84 (1С, CH20), 169.82 (1С, C00-), 189.78 (1С, C=0). Масс-спектр, m/z (IomH, %): 173 (15), 145 (8), 117 (20), 89 (14), 61 (100), 57 (51), 56 (7), 55 (4), 43 (21), 41 (29).
Амииловый эфир пировиноградной кислоты 3. Выход 88%. Спектр ЯМР *Н, 5, м. д.: 0.89 т (3Н, СН3), 1.17-1.21 м (2Н, СН2), 1.321.34 м (2H, СН2), 1.58-1.69 м (2H, СН2), 2.15 с (3Н, СН3), 4.14 т (2H, СН20). Спектр ЯМР 13С, 5с, м. д.: 14.00 (1С, CH3), 21.87 (1С, CH3), 22.22 (1С, CH2), 28.23 (1С, CH2), 28.32
(1С, CH2), 62.39 (1С, CH2O), 169.98 (1С, COO-), 186.05 (1С, C=O). Масс-спектр, m/z (IomH, %): 131 (9), 71 (42), 70 (7), 61 (65), 55 (12), 44 (8), 43 (100), 42 (15), 41 (25), 39 (6).
Культуры Rhodotorula glutinis ВКПМ Y3576 и Pichia anómala 80-11 выращивали на универсальной среде для дрожжей следующего состава (г/л): глюкоза — 10; дрожжевой экстракт — 5; рыбный агар — 38; микробиологический агар — 15. Выращивали в чашках Петри при 28—30 оС в течение 72 ч.
Биовосстановление алкиловых эфиров пировиноградной кислоты 1—3 осуществляли при температуре 30—32 оС в 0.1М фосфатном буфере (pH 7), содержащем 5 г/л субстрата и 25 г/л биомассы, при перемешивании в течение 48 ч и отделяли биомассу дрожжей центрифугированием (10 мин при 7000 об/мин). Фу-гат экстрагировали этилацетатом (3x30 мл). Объединенные экстракты сушили Na2SO4 и концентрировали.
Пропиловый эфир 25'-(—)-гидроксипро-пионовой кислоты 4. Спектр ЯМР 5, м. д.: 0.92 т (3Н, СН3), 1.36 д (3Н, СН3), 1.59-1.71 м (2H, СН2), 4.09 т (2Н, СН^), 4.17-4.24 м (1H, СНОН). Спектр ЯМР 13С, 5с, м. д.: 10.19 (1С, CH3), 20.30 (1С, CH3), 21.84 (1С, CH2), 66.55 (1С, CHOH), 66.91 (1С, CH2O), 175.59 (1С, COO-). Масс-спектр, m/z (IomH, %): 75 (5), 59 (2), 56 (1), 46 (3), 45 (100), 44 (4), 43 (28), 42 (3), 41 (12), 39 (3).
Бутиловый эфир 25'-(—)-гидроксипропи-оновой кислоты 5. Спектр ЯМР !Н, 5, м. д.: 0.95 т (3Н, CH3), 1.36-1.47 м (2Н, CH2), 1.41 д (3Н, CH3), 1.71-1.77 м (2Н, CH2), 4.18 т (2Н, CH20), 4.24-4.29 м (1Н, CHOH). Спектр ЯМР 13С, 5с, м. д.: 13.39 (1С, CH3), 18.95 (1С, CH2), 20.37 (1С, CH3), 30.66 (1С, CH2), 65.51 (1С, CH2O), 66.69 (1С, CHOH), 174.91 (1С, COO-). Масс-спектр, m/z (IomH, %): 85 (8), 75 (4), 57 (22), 56 (13), 55 (4), 45 (100), 44 (3), 43 (7), 41 (20), 39 (3).
Амиловый эфир 25'-(—)-гидроксипропио-новой кислоты 6. Спектр ЯМР !Н, 5, м. д.: 0.89 т (3Н, CH3), 1.14-1.31 м (4Н, 2CH2), 1.36 д (3Н, CH3), 1.51-1.65 м (2Н, CH2), 4.13 т (2Н, CH20), 4.16-4.24 м (1Н, CHOH). Спектр ЯМР 13С, 5с, м. д.: 13.89 (1С, CH3), 20.34 (1С, CH3), 22.19 (1С, CH2), 28.4 (1С, CH2), 29.37 (1С, CH2), 65.46 (1С, CH2O), 66.49 (1С, CHOH), 175.59 (1С, COO-).
Литература
1. Tsai S.W. Enantiopreference of Candida antarctica lipase B toward carboxylic acids: Substrate models and enantioselectivity thereof // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.- 2016.- Vol.127.- Pp.98-116.
2. Datta R., Tsai S.P., Bonsignore P., Moon S.H., Frank J.R. Technological and economic potential of poly(lactic acid) and lactic acid derivatives // FEMS Microbiology Reviews.- 1995.- Vol.16.-Pp.221-231.
3. Bousquet M-P., Willemot R-M., Monsan P., Boures E. Enzymatic synthesis of AHA derivatives for cosmetic application // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.- 1998.-Vol.5.- Pp.49-53.
4. Pirozzi D., Greco G. Activity and stability of lipases in the synthesis of butyl lactate // Enzyme and Microbial Technology.- 2004.-Vol.34.- Pp.94-100.
5. Kavcic S., Knez Z., Leitgeb M. Antimicrobial activity of n-butyl lactate obtained via enzymatic esterification of lactic acid with n-butanol in supercritical trifluoromethane // J. of Supercritical Fluids.- 2014.- Vol.85.- Pp.143-150.
6. Каталог фирмы Sigma-Aldrich, Inc. «(-)-Butyl L-lactate» Электронный ресурс, режим доступа: https: //www.sigmaaldrich.com/catalog/ product/aldrich/69819.
7. Синтезы органических препаратов. Сборник I под ред. Казанского Б.А. - М.: Государственное издательство иностранной литературы, 1949.- С.604.
8. Синтезы органических препаратов. Сборник III под ред. Казанского Б.А.- М.: Государственное издательство иностранной литературы, 1952.-С.581.
References
1. Tsai S.W. [Enantiopreference of Candida Antarctica lipase B toward carboxylic acids: Substrate models and enantioselectivity thereof]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2016, vol.127, pp.98-116.
2. Datta R., Tsai S.P., Bonsignore P., Moon S.H., Frank J.R. [Technological and economic potential of poly(lactic acid) and lactic acid derivatives]. FEMS Microbiology Reviews, 1995, vol.16, pp.221-231.
3. Bousquet M-P., Willemot R-M., Monsan P., Boures E. [Enzymatic synthesis of AHA derivatives for cosmetic application]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 1998, vol.5, pp.49-53.
4. Pirozzi D., Greco G. [Activity and stability of lipases in the synthesis of butyl lactate]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, vol.34, pp.94-100.
5. Kavcic S., Knez Z., Leitgeb M. [Antimicrobial activity of n-butyl lactate obtained via enzymatic esterification of lactic acid with n-butanol in supercritical trifluoromethane] J. of Supercritical Fluids, 2014, vol.85, pp.143-150.
6. [The company's catalog Sigma-Aldrich, Inc. «(—)-Butyl L-lactate»] https://www.sigmaaldrich. com/catalog/product/aldrich/69819.
7. Sintezy organicheskikh preparatov Sbornik I [Synthesis of organic preparations. Issue I]. Ed. Kazanskii B.A. Moscow, Gosudarstvennoe izdatel'stvo inostrannoi literatury Publ., 1949, p.604.
8. Sintezy organicheskikh preparatov Sbornik III [Synthesis of organic preparations. Issue III]. Ed. Kazanskii B.A. Moscow, Gosudarstvennoe izdatel'stvo inostrannoi literatury Publ., 1952, p.581.
