CC BY
14
УДК 547.466.24
А. О. Ленкова (асп.), А. В. Зорин (к.х.н., в.н.с.), А. Р. Чанышева (к.х.н., доц.),Л. Н. Зорина (к.х.н., доц., с.н.с.)*
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ АЛКИЛОВЫХ ЭФИРОВ а-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ В ПРИСУТСТВИИ ХИМОТРИПСИНА
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств, кафедра общей и аналитической химии 450062, РБ, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
A. O. Lenkova, A. V. Zorin, A. R. Chanysheva, L. N. Zorina
ENANTIOSELECTIVE HYDROLYSIS OF ALKYL ESTERS OF а-AMINOBUTYRIC ACID IN THE PRESENCE
OF CHYMOTRYPSIN
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
Энантиоселективный гидролиз рацемических бутилового и амилового эфиров а-аминомасля-ной кислоты в присутствии ферментного препарата химотрипсина приводит к образованию 25-(+)-а-аминомасляной кислоты с выходами 58 и 46 % от теоретического и оптической чистотой 80% ее и 74% ее, соответственно.Остаточные бутиловый и амиловый эфиры 2Л-(—)-а-аминомасляной кислоты получены с выходами 30 и 28 % от теоретического и оптической чистотой 52% ее и 28% ее, соответственно. При увеличении продолжительности ферментативного гидролиза оптическая чистота продуктов несколько снижается.
Ключевые слова: а-аминомасляная кислота; бутиловый и амиловый эфиры а-аминомасля-ной кислоты; химотрипсин; энантиомеры; энан-тиоселективный гидролиз.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках государственного задания.
Оптически активные аминокислоты находят широкое применение в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине 1-3.
Ферментный препарат химотрипсин, обладающий широкой субстратной специфичностью, осуществляет гидролиз пептидов, а также эфиров, амидов и других ацилпроизводных. Характерным свойством химотрипсина являет-
Дата поступления 11.01.17
Enantioselective hydrolysis of racemic butyl and amyl esters of a-aminobutyric acid in the presence of an enzyme chymotrypsin leads to the formation of 25-(+)-a-aminobutyric acid with 58 and 46 % yields (of theory) and an optical purity of 80% ee and 74% ee, respectively. Residual butyl and amyl esters of 2R-(—)- a-aminobutyric acid are obtained with 30 and 28% yields (of theory) and an optical purity of 52% ee and 28% ee, respectively. The increaseof enzymatic hydrolysis timegives products with more poor optical purity.
Key words: a-aminobutyric acid; butyl and amyl esters of a-aminobutyric acid; chymotrypsin; enantiomers; enantioselective hydrolysis.
This work was financially supported by the Ministry of Education and Science of Russia in the framework of the state task.
ся его высокая стереоспецифичность по отношению к L-изомерам эфиров аминокислот со свободной аминогруппой, что позволяет использовать эти реакции для разделения рацематов аминокислот 4 5.
Ранее нами было показано, что в присутствии иммобилизированной липазы Candida Antarctica (CAL-B) (Novozym 435) парциаль-
ный гидролиз рацемического бутилового эфира а-аминомасляной кислоты протекает с образованием 2^-(—)-а-аминомасляной кислоты и бутилового эфира 25-( + )-а-аминомасляной кислоты с выходами 72 и 94 % от теоретического и оптической чистотой 84% ее и 61% ее, соответственно 6.
В продолжение исследований по разделению энантиомеров а-аминомасляной кислоты была изучена возможность осуществления парциального гидролиза ее бутилового и амилового эфиров в присутствии ферментного препарата химотрипсина.
nh2
COOR 1, 2
Химотрипсин .
H2O '
NH2
COOR 3, 4
nh2
Я = я-С4Н9 (1, 3); Я = С5Нц (2, 4).
Синтез а-аминомасляной кислоты и ее ал-киловых эфиров был осуществлен по извест-
7 8
ным методикам .
Установлено, что ферментативный гидролиз бутилового эфира а-аминомасляной кислоты (1) при 20—25 оС в присутствии ферментного препарата химотрипсина в течение 46 ч приводит к образованию 25-(+)-а-аминомасляной кислоты (5) с выходом 29% (58% от теоретического) и оптической чистотой 80% ее (по данным поляриметрических исследований [а^ = +15.24°) и бутилового эфира 2Я-(—)-а-аминомасляной кислоты (3) с выходом 15% (30% от теоретического) и оптической чистотой 52% ее (по данным энантиоселективного ГЖХ анализа).
В аналогичных условиях ферментативный гидролиз амилового эфира а-аминомасляной кислоты (2) в течение 48 ч приводит к образованию 25-(+)-а-аминомасляной кислоты (5) с выходом 23% (46% от теоретического) и оптической чистотой 74%ее (по данным поляриметрических исследований = +13.98о) и бутилового эфира 2Я-(—)-а-аминомасляной кислоты (4) с выходом 14% (28% от теоретического) и оптической чистотой 28% ее (по данным энантиоселективного ГЖХ анализа).
С увеличением продолжительности гидролиза оптическая чистота продуктов несколько снижается вследствие медленного гидролиза бутилового эфира 25-( + )-а-аминомасляной кислоты.
Строение продуктов подтверждено спектральными методами ЯМР *Н и 13С и ХМС.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР *Н и С записаны в CDCl3(D2O) на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — ТМС. Хроматографи-ческий анализ продуктов проводили на программно-аппаратном комплексе Хроматэк-Кристалл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором, газ-носитель — гелий (1.1 мл/ мин), энантиоселективная колонка Astec CHIRALDEXB-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 мкм). Использовали программированный температурный режим: 80—200 оС, скорость подъема температуры 2 оС/мин. Хромато-масс-спектральный анализ проводили на приборе GCMS-QP2010SShimadzu (электронная ионизация при 70 эВ, диапазон детектируемых масс 33—350 Да). Использовали капиллярную колонку HP-1MS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), температура испарителя 300 °C, температура ионизационной камеры 250 Анализ проводили, используя программированный температурный режим от 50 до 300 "C со скоростью 20 ^/мин, газ-носитель — гелий (1.1 мл/ мин). Удельное вращение полученного продукта (3) ( ) измеряли на автоматическом поляриметре «Optical Activity Limited» модели АА-55 с галогеновой лампой (стандартная длина волны 589.44 нм). Стандартная величина удельного вращения 2^-(—)-а-аминомасля-ной кислоты [а]0 = —19о (с=4, Н20);25-(+)-а-аминомасляной кислоты [а]0 = +19о (с=4, Н2О) 9.
Бутиловый и амиловый эфиры а-амино-масляной кислоты были получены встречным синтезом по методике .
Бутиловый эфир а-аминомасляной кислоты 1. Спектр ЯМР (CDCl3, 5, м.д.): 0.810.84 т (3Н, СН3), 0.84-0.89 т (3Н, СН3), 1.241.36 м (2Н, СН2), 1.49-1.59 м (2Н, СН2), 1.491.72 м (2Н, СН2), 3.28-3.33 т (1H, CHNH2), 4.02-4.06 т (2Н, СН2). Спектр ЯМР 13С (CDCl3, 5, м.д.): 9.66 (1C, СН3), 13.46 (1C, CH3), 18.94 (1C, CH2), 27.78 (1C, СН2), 30.51 (1C, CH2), 55.46 (1C, CHNH2), 64.48 (1C, CH2), 175.92 (1C, C=O). Масс-спектр, m/z (/отн, %): 130 (1), 74 (7), 59 (4), 58 (100), 57 (3), 56 (4), 43 (2), 42 (2), 41 (13), 39 (2), 30 (7).
Амиловый эфир а-аминомасляной кислоты 2. Спектр ЯМР !Н, (CDCl3, 5, м.д.): 0.880.92 т (3Н, СН3), 1.04-1.09 т (3Н, СН3), 1.241.29 м (2Н, СН2), 1.30-1.35 м (2Н, СН2), 1.541.75 м (2Н, СН2), 1.94-2.08 м (2Н, СН2), 3.613.65 т (1H, CHNH2), 4.11-4.24 м (2Н, СН2).
+
5
Спектр ЯМР 13С (CDCl3, 5, м.д.): 9.45 (1C, СН3), 13.82 (1C, CH3), 22.15 (1C, CH2), 24.81 (1C, CH2), 27.81 (1C, CH2), 28.05 (1C, СН2), 54.41 (1C, CHNH2), 66.03 (1C, CH2), 176.03 (1C, C=O).
Методика парциального гидролиза рацемических бутилового и амилового эфиров а-аминомасляной кислоты. К 1.68 ммоль ал-килового эфира а-аминомасляной кислоты (1, 2) в 2—2.5 мл воды при нормальных условиях (20—25 °C) добавляли 3.5% от загрузки ферментного препарата химотрипсина. Протекание реакции контролировали с использованием метода энантиоселективной газо-жидко-стной хроматографии. После окончания реак-
Литература
1. Преображенский Н.А., Евстигнеева Р. П. Химия биологически активных веществ.— М: Химия, 1970.- 512 с.
2. Сафарова В.Г., Зорин В.В. Химия биологически активных веществ.- Уфа: Нефтегазовое дело, 2007.- 127 с.
3. Сафарова В.Г., Чанышева А.Р., Зорин В.В. Биологически активные вещества.- Уфа: УГНТУ, 2016.- 208 с.
4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина, 1982.- 750 с.
5. Неницеску К. Д. Органическая химия / Под ред. М.И. Кабачника.- М.: Издательство Иностранной литературы, 1963.- Т. 2.- 1048 с.
6. Ленкова А.О., Зорин А.В., Чанышева А.Р., Гельмель К.В., Файзуллина Г.А., Зорин В. В. Энантиоселективный гидролиз бутилового эфира а-аминомасляной кислоты в присутствии Novozym 435 // Баш. хим. ж.-2016.- Т. 23, №4.- C.42-44.
7. Хачатурян А.Б., Зорин А.В., Спирихин Л.В., Зорин В.В. Синтез а-аминомасляной кислоты // Баш. хим. ж.- 2010.- Т. 17, №5.- C.30-31.
8. Гринштейн Дж. Химия аминокислот и пептидов / Под ред. М.М. Шемякина.- М.: Мир, 1965.825 с.
9. Каталогфирмы Sigma- Aldrich, Inc. «D-2-Aminobutyricacid». Электронный ресурс, режим доступа https://www.sigmaaldrich. com/catalog/product/ aldrich/116122.
ции фермент осаждали 5% водным раствором трихлоруксусной кислоты и осадок отфильтровывали. Из фильтрата остаточный алкило-вый эфир а-аминомасляной кислоты экстрагировали гексаном (2x10 мл). Водный слой упаривали в вакууме. После упаривания воды образовывались кристаллы 25-(+)-а-аминомас-ляной кислоты.
25'-( + )-а-аминомасляная кислота 5. Спектр ЯМР *Н (D2O, 5, м.д.): 0.82-0.85т (3Н, СН3), 1.74-1.77м (2Н, СН2), 3.55-3.58т (1H, CHNH2). Спектр ЯМР 13С (D2O, 5, м.д.): 8.42(1C, СН3), 23.58(1C, СН2), 55.27 (1C, CHNH2), 174.74 (1C, COOH).
References
1. Preobrazhenskii N.A., Evstigneeva R.P. Khimiya biologicheski aktivnykh veshchestv [Chemistry of biologically active compound]. Moscow, Khimiya Publ., 1970, 512 p.
2. Safarova V.G., Zorin V.V. Khimiya biologicheski activnykh veschestv[ Chemistry of biologically active substances]. Ufa, Neftegazovoedelo Publ., 2007, 127 p.
3. Safarova V.G., Chanysheva A.R., Zorin V.V. Biologicheski aktivnye veshchestva [Biologically active substances]. Ufa, UGNTU Publ., 2016, 208 p.
4. Berezov T.T., Korovkin B.F. Biologicheskaya khimiya [Biological chemistry]. Moscow, Meditsina Publ., 1982, 750 p.
5. Nenitsesku K.D. Organicheskaiakhimiia. Pod red. M.I. Kabachnika [Organic chemistry]. Moscow, Inostrannoi literatury Publ., 1963,v. 2, 1048 p.
6. Lenkova A.O., Zorin A.V., Chanysheva A.R., Gelmel K.V., Faizullina G.A., Zorin V. V. Enantioselektivnyi gidroliz butilovogo efira a-aminomaslyanoi kisloty v prisutstvii Novozym 435 [Enantioselective hydrolysis of butyl ester of a-aminobutyric acid in the presence of Novozym 435] // Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2016, v.23, no.4, pp. 42-44.
7. Khachaturyan A.B., Zorin A.V., Spirikhin L.V., Zorin V.V. Sintez a-aminomaslianoi kisloty [Synthesis of a-aminobutyric acid] // Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2010, v.17, no.5, pp.30-31.
8. Greenstein J. Khimiya aminokislot i peptidov [Amino acid and peptide chemistry]. Ed. M.M. Shemyakin. Moscow, Mir Publ., 1965, 825 p.
9. [The company's catalog Sigma-Aldrich, Inc.«D-2-Aminobutyric acid»]. https://www.sigma-aldrich.com/catalog/product/aldrich/116122.
