CC BY
18
УДК 547.466.24
А. О. Ленкова (асп.), А. В. Зорин (к.х.н., в.н.с.), А. Р. Чанышева (к.х.н., доц.), К. В. Гельмель (магистрант), Г. А. Файзуллина (магистрант), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ БУТИЛОВОГО ЭФИРА а-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ В ПРИСУТСТВИИ NOVOZYM 435
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, РБ, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: chemist.518@mail.ru
A. O. Lenkova, A. V. Zorin, A. R. Chanysheva, K. V. Gelmel, G. A. Faizullina, V. V. Zorin
ENANTIOSELECTIVE HYDROLYSIS OF BUTYL ESTER OF a-AMINOBUTYRIC ACID IN THE PRESENCE
OF NOVOZYM 435
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: chemist.518@mail.ru
На примере а-аминомасляной кислоты исследована возможность получения энантиомерно чистых а-аминокислот с участием биокатализатора Candida Antarctica (CAL-B) (Novozym 435) путем парциального гидролиза ее бутилового эфира. Установлено, что энантиоселективный гидролиз рацемического бутилового эфира а-аминомасля-ной кислоты в присутствии ферментного препарата Novozym 435 приводит к образованию ^-(-)-а-аминомасляной кислоты и бутилового эфира 54+)-а-аминомасляной кислоты с выходами 72 и 94 % от теоретического и оптической чистотой 84% ее и 61% ее, соответственно.
Ключевые слова: а-аминомасляная кислота; бутиловый эфир а-аминомасляной кислоты; Novozym 435; энантиоселективный гидролиз; энантиомеры.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках государственного задания.
The possibility of obtaining of enantiomerically pure a-amino acids using a-aminobutyric acid in the presence of biocatalyst Candida Antarctica (CAL-B) (Novozym 435) by partial hydrolysis of its butyl ester is investigated. It is found that the enantioselective hydrolysis of racemic butyl ester of a-aminobutyric acid in the presence of Candida antarctica lipase (Novozym 435) leads to the formation of _R-(-)-a-aminobutyric acid and butyl 5-(+)-a-aminobutyrate with 72 and 94 % yields (of theory) respectively and an optical purity of 84% ee and 61% ee, respectively.
Key words: a-aminobutyric acid; butyl ester of a-aminobutyric acid; Novozym 435; enantio-selective hydrolysis; enantiomers.
This work was financially supported by the Ministry of Education and Science of Russia in the framework of the state task.
Энантиомерно чистые а-аминокислоты и их производные являются фармакозначимыми соединениями и широко используются при создании лекарственных препаратов 1-3.
Существуют различные синтетические и
биосинтетические подходы к синтезу а-амино-1 4
кислот ' .
Привлекательным и перспективным методом получения а-аминокислот является прямая функционализация енолятов ацилатов под действием хлораминов 5, а также вовлечение
Дата поступления 08.10.16
енолятов ацилатов в реакцию аминирования под действием метоксиамина 6. Однако, выходы целевых а-аминокислот при использовании этих методов не превышают 10—33 %.
Другой перспективный подход к синтезу а-аминокислот, описанный на примере а-ами-номасляной кислоты, включает двухстадий-ную схему, в которой первоначально осуществляют оксиминирование енолятов бутирата лития под действием изобутилнитрита 7 и затем восстановление а-оксиминомасляной кислоты с помощью хлорида олова до рацемической а-аминомасляной кислоты .
Нами с целью разделения энантиомеров а-аминомасляной кислоты была исследована возможность осуществления парциального гидролиза ее бутилового эфира в присутствии ферментного препарата на основе Candida Antarctica (CAL-B) (Novozym 435) по схеме 1.
Синтез а-аминомасляной кислоты и ее бутилового эфира был осуществлен по извест-
7 9
ным методикам .
Установлено, что ферментативный гидролиз бутилового эфира а-аминомасляной кислоты (1) при 20—25 оС в присутствии ферментного препарата Novozym 435 в течение 46 ч приводит к образованию R-(—)- а-аминомасляной кислоты (3) с выходом 36% (72% от теоретического) и оптической чистотой 84% ее (по данным поляриметрических исследований) и бутилового эфира S-(+)- а-аминомасляной кислоты (2) c выходом 47% (94% от теоретического) и оптической чистотой 61% ее (по данным энантиоселективного ГЖХ анализа). С увеличением продолжительности гидролиза оптическая чистота несколько снижается, вследствие медленного гидролиза бутилового эфира S-(+)-а-аминомасляной кислоты.
Строение продуктов подтверждено спектральными методами ЯМР 1Н и С и ХМС.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР 1Н и С записаны в D2O (CDCl3) на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — ТМС. Хроматографи-ческий анализ продуктов проводили на программно-аппаратном комплексе Хроматэк-Кристалл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором, газ-носитель — гелий (1.1 мл/ мин), энантиоселективная колонка Astec CHIRALDEX B-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 мкм). Использовали программированный температурный режим: 80—200 °C, скорость подъема температуры 2 оС/мин. Хромато-масс-спект-ральный анализ проводили на приборе GCMS-QP2010S Shimadzu (электронная ионизация при 70 эВ, диапазон детектируемых масс 33350 Да). Использовали капиллярную колонку HP-1MS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), температура испарителя 300 температура ионизационной камеры 250 Анализ проводили,
NH2
O
Схема 1.
используя программированный температурный режим от 50 до 300 оС со скоростью 20 оС/мин, газ-носитель — гелий (1.1 мл/ мин). Удельное вращение полученного продукта (3) ([a]D) измеряли на автоматическом поляриметре «Optical Activity Limited» модели АА-55 с галогеновой лампой (стандартная длина волны 589.44 нм). Стандартная величина удельного вращения ^-(-)-а-аминомасля-ной кислоты [a]D20 = —19 (с=4, Н20) 10.
Методика синтеза а-оксиминомасляной кислоты 7. В трехгорлую колбу, снабженную магнитной мешалкой, термометром и газоподво-дящей трубкой, в атмосфере аргона помещали 0.01 моль диизопропиламида лития в 30 мл тет-рагидрофурана и охлаждали до 0—5 оС на ледяной бане. Затем, при перемешивании добавляли 0.005 моль масляной кислоты, растворенной в 20 мл абсолютного тетрагидрофурана. Реакционную смесь нагревали до 35—40 оС и перемешивали 40 мин. Затем колбу охлаждали до 20—25 оС и добавляли 0.025 моль изобутилнитрита и перемешивали при 45—50 оС в течение 2 ч. После завершения реакции в реакционную смесь приливали 20—30 мл дистиллированной воды. Водный слой обрабатывали соляной кислотой до рН 1 и экстрагировали диэтиловым эфиром (3 х 30 мл). После упаривания эфира образовывались кристаллы а-оксиминомасляной кислоты.
а-Оксиминомасляная кислота. Выход 78% от теоретического. Тпл. = 159 оС. Спектр ЯМР (D2O, 5, м.д.): 0.96-1.00 т (3Н, СН3), 2.44-2.51 к (2Н, СН2). Спектр ЯМР 13С (D2O, 5, м.д.): 11.97 (1С, СН3), 27.45 (1С, CH2), 157.76 (1С, C=NOH), 169.09 (1С, COOH).
Методика восстановления а-оксимино-масляной кислоты 8. В круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, помещали 10 мл концентрированной соляной кислоты, далее порциями добавляли 0.01 моль Sn02 и 0.005 моль а-оксиминомасляной кислоты. Полученную смесь перемешивали в течение 20 минут и оставляли на ночь при комнатной температуре, а затем концентрировали в вакууме до густой массы, которую растворяли в 20 мл воды и нейтрализовали 28% раствором аммиака до рН 7. 0садок удалили и промывали 30 мл воды. Фильтрат выпаривали в вакууме досуха. Полученный остаток перекристаллизо-вывали из этанола (3 х 30 мл). После упарива-
ния этанола образовывались белые кристаллы гидрохлорида а-аминомасляной кислоты.
Гидрохлорид а-аминомасляной кислоты. Выход 53%. Тпл.=300 оС. Спектр ЯМР 1Н (в В20 в 5, м. д.): 1.06 т (3Н, СН3), 1.98-2.08 м (2Н, СН2), 4.12 т (1Н, СН-КН3+). Спектр ЯМР 13С (в Э20 в 5, м. д.): 11.26 (1С, СН3), 25.93 (1С, СН2), 56.71 (1С, СН(КН3+)С00Н), 174.69 (1С, СООН).
Бутиловый эфир а-аминомасляной кислоты синтезировали по методике .
Бутиловый эфир а-аминомасляной кислоты 1. Выход 74% от теоретического. Спектр ЯМР *Н (СБС13, 5, м.д.): 0.81-0.84 т (3Н, СН3), 0.84-0.89 т (3Н, СН3), 1.24-1.36 м (2Н, СН2), 1.49-1.59 м (2Н, СН2), 1.49-1.72 м (2Н, СН2), 3.28-3.33 т (1Н, СНКН2), 4.02-4.06 т (2Н, СН2). Спектр ЯМР 13С (СЭС13, 5, м.д.): 9.66 (1С, СН3), 13.46 (1С, СН3), 18.94 (1С, СН2), 27.78 (1С, СН2), 30.51 (1С, СН2), 55.46 (1С, СНКН2), 64.48 (1С, СН2), 175.92 (1С,
C=O). Масс-спектр, m/z (I0TH, %): 130 (1), 74 (7), 59 (4), 58 (100), 57 (3), 56 (4), 43 (2), 42 (2), 41 (13), 39 (2), 30 (7).
Методика парциального гидролиза рацемического бутилового эфира а-аминомасля-ной кислоты. К 1.6 ммоль бутилового эфира а-аминомасляной кислоты (1) в 2—2.5 мл воды при нормальных условиях (20—25 оС) добавляли 8.7 мг ферментного препарата Novozym 435. Протекание реакции контролировали с использованием метода энантиоселективной газо-жидкостной хроматографии.
_К-(-)-а-аминомасляная кислота 3. Выход 36% (72% от теоретического). [a]D20 = —16.03. Оптическая чистота 84% ее. Спектр ЯМР (D2O, 5, м.д.): 0.92-0.97 т (3Н, СН3), 1.33-1.92 м (2Н, СН2), 3.66-3.70 т (1H, CHNH2). Спектр ЯМР 13С (D2O, 5, м.д.): 11.03 (1С, СН3), 26.19 (1С, СН2), 58.37 (1C, CHNH2), 177.3 (1C, COOH).
Литература
1. Преображенский Н.А., Евстигнеева Р. П. Химия биологически активных веществ.— М: Химия, 1970.- 512 с.
2. Сафарова В.Г., Зорин В.В. Химия биологически активных веществ.- Уфа: Нефтегазовое дело, 2007.- 127 с.
3. Сафарова В. Г., Чанышева А. Р., Зорин В.В. Биологически активные вещества. — Уфа: изд-во УГНТУ, 2016.— 208 с.
4. Грачева И.М., Гаврилова Н.И., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров.— М.: Пищевая промышленность, 1980.— 448 с.
5. Oguri T., Shioiri T., Yamada S. Amino acids and peptides. XV. A new synthesis of а-amino acids by amination of а-metalated carboxylic acids // Chem. Pharm. Bull.— 1975. — №23. — Р. 167-172.
6. Yamada S., Oguri T., Shioiri T. а-Amination of сarboxylic acids: a new synthesis of а-aminoacids / / J. Chem. Soc., Chem. Commun.— 1972.— Р. 623.
7. Хачатурян А.Б., Зорин А.В., Спирихин Л.В., Зорин В.В. Синтез а-аминомасляной кислоты // Баш. хим. ж.— 2010.— Т. 17, №5.— С.30—31.
8. Bixler R., Niemann C. Synthesis of ¿8-(4-Pyridyl)-DL-alanine and of ^-(4-Pyridyl-1-oxide)-DL-, D-, and L-alanine // J. Org. Chem.— 1958. V.23.— P.575-584.
9. Гринштейн Дж. Химия аминокислот и пептидов / Под ред. М.М. Шемякина.— М.: Мир, 1965.— 825 с.
10. Каталог фирмы Sigma-Aldrich, Inc. «D-2-Aminobutyric acid». Электронный ресурс, режим доступа https://www.sigmaaldrich.com /catalog/product/ aldrich/116122.
References
1. Preobrazhenskii N.A., Evstigneeva R.P. Khimiya biologicheski aktivnykh veshchestv [Chemistry of biologically active compound]. Moscow, Khimiya Publ., 1970, 512 p.
2. Safarova V.G., Zorin V.V. Khimiya biologicheski aktivnykh veschestv [Chemistry of biologically active substances]. Ufa, Neftega-zovoe delo Publ., 2007, 127 p.
3. Safarova V.G., Chanisheva A.R., Zorin V.V. Biologicheski aktivnye veshchestva [Biologically active substances]. Ufa, UGNTU Publ., 2016, 208 p.
4. Grachev I.M., Gavrilov N.I., Ivanova L.A. Tekhnologiya mikrobnykh belkovykh preparatov, aminokislot i zhirov [Technology protein preparations, amino acids and fats]. Moscow, Pischevaya promyshlennost' Publ., 1980, 448 p.
5. Oguri, T., Shioiri T., Yamada S. [Amino acids and peptides. XV. A new synthesis of a-amino acids by amination of a-metalated carboxylic acids]. Chem. Pharm. Bull., 1975, no. 23, pp. 167-172.
6. Yamada S., Oguri T., Shioiri T. [a-Amination of carboxylic acids: a new synthesis of a-amino-acids]. J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1972, p. 623.
7. Khachaturyan A.B., Zorin A.V., Spirikhin L.V., Zorin V.V. Sintez a-aminomaslianoi kisloty [Synthesis of a-aminobutyric acid]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2010, v. 17, no. 5, pp. 30-31.
8. Bixler R., Niemann C. [Synthesis of /3-(4-Pyridyl)-DL-alanine and of ¿0-(4-Pyridyl-1-oxide)-DL-, D-, and L-alanine]. J. Org. Chem., 1958, v. 23, pp.575-584.
9. Greenstein J. Khimiya aminokislot i peptidov [Amino acid and peptide chemistry]. Ed. M.M. Shemyiakin. Moscow, Mir Publ., 1965, 825 p.
10. [The company's catalog Sigma-Aldrich, Inc. «D-2-Aminobutyric acid»]. https://www.sigmaaldrich.com /catalog/product/aldrich/116122.
