CC BY
17
УДК 577.60 DOI: 10.24412/2071-6176-2022-4-33-41
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ МЕДЬСОДЕРЖАЩИХ ОКСИДАЗ В БИОСЕНСОРАХ И БИОТОПЛИВНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ: ВЫБОР МЕТОДОВ И ПОДХОДОВ
О.Н. Понаморева
Представлен критический анализ по выбору направлений и методов исследований в области биоэлектрокатализа при участии медьсодержащих оксидаз (лакказ и билирубиноксидаз). Описаны структурные особенности, характерные для всех типов лакказ и некоторых билирубиноксидаз, содержащих четыре атома меди, играющей ключевую роль в окисление субстрата, т.е. переносе электронов от субстрата на активный центр фермента. Преимуществами билирубиноксидаз является то, что они устойчивы в физиологических условиях в отличие от грибных лакказ, имеют более высокий потенциал Т1-центра по сравнению с бактериальными лакказами и способны эффективно окислять билирубин, что используют при разработке биосенсоров. Разработка биокатодов на основе лакказ и билирубиноксидаз является предметом интенсивных исследований, однако исследования осложняются тем фактом, что медьсодержащие оксидазы в иммобилизованном на электроде виде ведут себя иначе, чем в растворе. Перспективным направлением является повышение редокс-потенциала методами направленного мутагенеза и возможность наработки фермента в значительных количествах методом молекулярной биотехнологии.
Ключевые слова: лакказы, билирубиноксидазы, биоэлектрокатализ, медьсодержащие оксидазы.
Введение
Биоэлектрокатализ - одно из направлений развития современных биотехнологий по получению возобновляемой электрической энергии с помощью биотопливных элементов (БТЭ), разработке электрохимических биосенсоров и созданию биоразлагаемых материалов с улучшенными качествами [1]. Это направление исследований является междисциплинарным на стыке нескольких областей знаний, включая биокатализ, электрохимию, инженерию, функциональные материалы, в том числе наноматериалы, и др. В процессе биоэлектрокатализа ферменты катализируют окислительно-восстановительные реакции на электродах, участвуют в переносе заряда от субстрата на активный центр фермента и далее на электрод на границе раздела фаз или восстанавливают субстрат за счет электронов, полученных с поверхности электродов. Несмотря на то, что использование ферментов в электрохимических реакциях является перспективным, имеются некоторые ограничения, которые обусловлены необходимостью обеспечивать сопряжение биокатализа с переносом заряда от фермента на электрод. Тем не менее, современное развитие методов биона-нотехнологий позволяет частично решать эти проблемы и эффективно реализовывать концепции «зеленой химии» [2, 3]. Ведущее место среди
важнейших биоэлектрокатализаторов занимают металлсодержащие окси-доредуктазы с ионами меди в качестве кофактора. Медный центр служит платформой для переноса электронов от электрода через активный центр фермента к молекуле кислорода, обеспечивая его восстановление до воды. Эти ферменты называют медные (мультимедные) оксидазы (multicopper oxidases). Среди медьсодержащих оксидаз в природе наиболее распространены лакказы, что и определило их роль как биокатализаторов при разработке различных биотехнологий [4].
В обзоре [5] обобщены различные подходы и прорывы в разработке биокатодов на основе лакказ для биоэлектрокаталитического восстановления кислорода, которые интенсивно разрабатывались в последние годы прошлого века и в первом десятилетии нашего века. Этот период можно назвать ренессансом в области исследований биоэлектроката-литических систем на основе лакказ и других медьсодержащих оксидаз. Авторы отмечают роль передовых электродных материалов, таких как наночастицы и нанопроволоки в организации эффективного переноса электронов в биокатодах. Однако в этом обзоре не затронуты аспекты направленной эволюции лакказ с использованием методов молекулярной биологии.
Основные достижения в инженерии лакказ (от рационального дизайна к направленной эволюции), которые стали возможны только после получения более полного понимания взаимосвязи структуры и функции лакказ, суммированы в работе [6]. Авторы эмоционально характеризуют эту область исследований как захватывающую область и выделяют цели, поставленные перед инженерией лакказ: гетерологичную функциональную экспрессию, увеличенную активность и термостабильность, устойчивость к неприродным средам (органическим растворителям, ионным жидкостям, физиологическим жидкостям) и устойчивость к различным типам ингибиторов. При этом не проанализированы возможности молекулярной биологии и генной инженерии по улучшению биоэлектрокаталитических свойств лакказ. Интенсивные исследования в этой области выявили определенные проблемы, затормозившие внедрение полученных результатов. За последние два года (по данным PubMed) наблюдается всплеск интереса к этой тематике, обусловленный развитием биоинформатики для поиска генов ферментов с особыми свойствами, методов генной инженерии для направленного дизайна белков и наноматериалов для иммобилизации медьсодержащих оксидаз. В одном из последних обзоров [6] сделана попытка структурировать всеобъемлющию информацию о различных электрокаталитических реакциях с участием лакказ, особое внимание уделили белковой инженерии и биотехнологических методам получения ферментов с улучшенными свойствами. В заключении отмечается, что разработка подходов по оптимизации электроката-
литических свойств лакказ расширит горизонты для разработки стабильных и биосовместимых биоэлектрокатализаторов.
В этой статье представлен критический анализ по выбору направлений и методов исследований в области биоэлектрокатализа при участии медьсодержащих оксидаз (лакказ и билирубиноксидаз).
Лакказы и билирубиноксидазы как биоэлектрокатализаторы
Лакказа (КФ 1.10.3.2, пара-дифенол: кислород оксидоредуктаза) катализирует ряд реакций окисления ароматических и неароматических соединений при участии молекулярного кислорода как акцептора электронов [7]. Лакказа катализирует четырёхэлектронное восстановление молекулы кислорода до двух молекул воды, минуя стадию образования пероксида водорода, при этом происходит одноэлектронное окисление широкого спектра субстратов. Лакказы катализируют окисление различных фенольных и нефенольных соединений, среди них, например, орто- и парафенолы, полифенолы, аминофенолы, лигнины, арилдиамины. В качестве неорганических субстратов могут выступать, например, цианокомплексы Fe, Мо, 1г, W (с формулой [Ме(СК)х]у"), соединения Мп2+. Неорганические субстраты лакказ являются донорами электронов, в то время как органические являются донорами атомов водорода. Эти ферменты встречаются во многих микроорганизмах, грибах, растениях и насекомых [8, 9]. Лакказы из различных организмов различаются по строению и могут существенно отличаться по своим свойствам. Грибные лакказы широко распространены в природе и нашли широкое применение. Типичные грибные лакказы являются мономерными гликопротеинами с молекулярной массой 60 - 70 кДа, полипептид содержит три домена (трехдоменные лакказы, 3Д). Грибные лакказы более стабильны при нейтральных значениях рН, но более активны в диапазоне рН 4,5 - 5,0. Бактериальные лакказы открыты гораздо позже, они функционируют в нейтральной и слабощелочной среде, имеют высокую термостабильность, но менее эффективно окисляют различные субстраты, их потенциал как биокатализаторов не до конца исследован. Среди бактериальных лакказ найдены белки, имеющие три домена в структуре мономера (3Д), и необычные формы лакказ, мономеры которых состоят только из двух доменов (двухдоменные лакказы, 2Д). В последнем обзоре суммирована информация об особенностях строения бактерий рода ^тер^тусеъ и описаны перспективы их применения [10].
Билирубиноксидаза (ЕС 1.3.3.5, билирубин: кислород оксидоредуктаза), подкласс медьсодержащих оксидаз, открытая в 1981 году Танакой (Тапака) и Мурао (Мигао), сначала использовалась для обнаружения билирубина, а затем в 2001 году для восстановления О2 [11]. В отличие от лакказ, билирубиноксидазы обладают, помимо прочих
характеристик, высокой активностью и стабильностью при нейтральном рН и высокой толерантностью к хлорид-анионам, что делает их идеальным кандидатом для восстановления О2 в физиологических условиях [12].
Однако некоторые структурные особенности характерны для всех типов лакказ [6] и некоторых билирубиноксидаз [13]. Все лакказы содержат четыре атома меди, которые отличаются друг от друга по спектральным характеристикам, магнитным свойствам и структурной геометрии медного центра (тип I, тип II и тип III). В координировании ионов меди учувствуют десять остатков гистидина и один остаток цистеина, эти аминокислоты и их положение в первичной структуре белков - консервативны лля всех лакказ. Все атомы меди находятся в степени окисления 2+. Три иона меди Т2- и Т3-центров сближены на расстояние не больше 3,8 А и образуют Т2/Т3-трёхъядерный кластер. Ион меди центра Т1 расположен от остальных атомов меди на расстоянии 1213 А (одноядерный монокластер, Т1-металлоцентр), так называемая, «голубая медь» [14, 15]. В Т1-центре лакказ лигандами атома меди являются два гистидина и сульфгидрильная группа цистеина (рисунок).
Перенос электронов в активном центре грибной лакказы
В координационной сфере тригонального Т1-центра грибных лакказ располагается дополнительный остаток фенилаланина или лейцина. У бактериальных и растительных лакказ ион меди Т1-центра дополнительно координирован метионином, что приводит к образованию тетрагональной структуры центра. Структура билирубиноксидазы из бактерий Bacillus
pumilus имеет высокую гомологию с ранее определенными структурами бактериальных лакказ, но она обладает уникальной дисульфидной связью вблизи сайта T1 [13]. Важной функцией медного центра типа I является окисление субстрата, т.е. перенос электронов от субстрата на активный центр фермента. Электроны в дальнейшем перемещаются по редокс-центрам фермента к Т2-Т3 многоядерному центру, который обеспечивает перенос электронов на молекулу кислорода.
Разработка биокатодов на основе билирубиноксидаз является предметом интенсивных исследований, поскольку катодный процесс является лимитирующим фактором функционирования биотопливных элементов. Чтобы преодолеть эти ограничения, необходимо рассмотреть возможность увеличения удельной поверхности электродов, разработки новых стратегий прямого или опосредованного переноса электронов, получение генно-инженерных билирубиноксидаз. Последний пункт весьма сложен, поскольку, несмотря на значительный объем работ по лакказам, о билирубиноксидазах известно мало. В настоящее время продолжаются исследования по разработке билирубиноксидазных электродов. В недавних работах описаны нестандартные конфигурации биоэлектродов: водостойкий ферментативный 02-катод для деформируемого биоэлектрического кожного пластыря [16] и билирубиноксидазный сенсор для измерения рН [17]. Следует отметить, что для разработки билирубинокси-дазных электродов, в основном используют коммерчески доступный фермент - грибную билирубиноксидазу Myrrothecium verrucaria. Первая кристаллическая структура бактериальной билирубиноксидазы была получена и описана только в этом году [13].
Таким образом, поиск новых медьсодержащих оксидаз, обладающих характеристиками билирубиноксидазы для разработки биоэлектрокаталитических устройств является актуальной, но, скорее всего, непростой задачей. Так, еще десять лет назад была выделена термостабильная медьсодержащая оксидаза из гипертермофильных архей Pyrobaculum aerophilum [18]. Анализ кристаллической структуры фермента позволил выявить обширные гидрофобные взаимодействия и меньший объем полости, что, вероятно, способствует термостабильности белка, но приводит к низкой активности фермента. Только спустя десять лет японским ученым удалось добиться высокой электрохимической каталитической активности этой оксидазы путем иммобилизации на электрод из одностенных углеродных нанотрубок [19]. Таким образом, существует еще один аспект, который необходимо учитывать при исследовании биоэлектрокатализа в таких системах - выделенные ферменты не всегда ведут себя одинаково после иммобилизации на поверхности электрода по сравнению с ситуацией, когда они находятся в свободном состоянии в растворе! На это обращал внимание в своем обзоре 2013 года [12] один из ведущих ученых в области биоэлектрокатализа
билирубиноксидаз. Методы иммобилизации лакказ и других медьсодержащих оксидаз для разработки биокатодов и биоэлекродов были подробно проанализированы нами ранее [20,21].
Заключение
Таким образом, достижение низкого перенапряжения в реакции восстановления кислорода на электродах при нейтральных значениях рН является одной из самых сложных электрокаталитических реакций. В отличие от большинства металлсодержащих катализаторов неприродного происхождения, для которых требуются высокие перенапряжения, медные оксидазы, в частности лакказы и билирубиноксидазы, продемонстрировали исключительную эффективность в реакции восстановления кислорода при средних значениях рН, что важно для разработки биотопливных элементов. Всесторонний анализ основных направлений современных исследований в этой области позволил выявить те направления, на которые следует обратить особое внимание:
- разработка методов ориентированной иммобилизации ферментов;
- молекулярно-генетические методы направленного дизайна белков;
- поиск новых ферментов с улучшенными свойствами.
В этом отношении перспективными ферментами являются малые бактериальные лакказы (двухдоменные лакказы). Несмотря на то, что бактериальные лакказы являются низкопотенциальными ферментами, в отличие от высокопотенциальных грибных лакказ они обладают рядом преимуществ: высокой термостабильностью, способностью работать в широком диапазоне рН и окислять фенольные соединения в нейтральных средах, устойчивостью к ингибированию галогенидами и азидами. Очень важно, что двухдоменные лакказы можно наработать в значительных количествах методом молекулярной биотехнологии, и существует возможность повысить редокс-потенциал методами направленного мутагенеза [6]. Еще одним преимуществом рекомбинантных лакказ для биомедицинского применения является тот факт, что рекомбинантные ферменты не гликозилируются, так как именно олигосахаридные компоненты ферментов являются антигенными детерминантами. Преимуществами билирубиноксидаз является то, что они устойчивы в физиологических условиях в отличие от грибных лакказ, имеют более высокий потенциал Т1-центра по сравнению с бактериальными лакказами и способны эффективно окислять билирубин, что используется при разработке биосенсоров [22, 23]. Следует отметить, что аннотация медьсодержащих оксидаз, как лакказ или билирубиноксидаз, весьма условна и зависит не только от степени идентичности аминокислотной последовательности, но и от биохимических свойств фермента. В недавнем исследовании, опубликованном в высокорейтинговом журнале [24], в
геноме лакказопродуцирующего штамма Acinetobacter выявлены гены трех лакказоподобных белков, один из которых отнесли к семейству билирубиноксидаз. Таким образом, поиск новых медьсодержащих оксидаз, направленная эволюция известных лакказ и применение в биоэлектро-катализе нано- и функциональных материалов являются актуальными задачами на современном этапе развития исследований в биоэлектро-катализе.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания № FEWG-2020-0008.
Список литературы
1. Masa J., Schuhmann W. Electrocatalysis and bioelectrocatalysis-Distinction without a difference // Nano Energy. 2016. V. 29. P. 466-475.
2. Mazurenko I., Hitaishi V. P., Lojou E. Recent advances in surface chemistry of electrodes to promote direct enzymatic bioelectrocatalysis //Current Opinion in Electrochemistry. 2020. V. 19. P. 113-121.
3. Catalytic roles, immobilization and management of recalcitrant environmental pollutants by laccases: Significance in sustainable green chemistry / Zofair S. F. F.; Ahmad S.; Hashmi M. A. [et al]. // Journal of Environmental Management. 2022. V. 309. P.114676.
4. Applications of Microbial Laccases: Patent Review of the Past Decade (2009-2019) / Zerva A., Simic S., Topakas E. [et al]. // Catalysts. 2019. V.9. N.12. P.1023.
5. Le Goff A., Holzinger M., Cosnier S. Recent progress in oxygen-reducing laccase biocathodes for enzymatic biofuel cells // Cellular and Molecular Life Sciences. 2015 V.72. N.5. P. 941-952.
6. Dey B., Dutta T. Laccases: Thriving the domain of bioelectrocatalysis // Bioelectrochemistry. 2022. V. 146. P.108-144.
7. «Голубые» лакказы / Морозова О. В., Шумакович Г. П., Горбачева М. А. [ и др.] // Биохимия. 2007. Т. 72. №10. С.1396 - 1412.
8. Structure-function relationship among bacterial, fungal and plant laccases / Dwivedi U. N., Singh P., Pandey V. P. [et al] // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2011. V.68. N.2. P.117-128.
9. Laccase Properties, Physiological Functions, and Evolution / Janusz G., Pawlik A., Swiderska-Burek U. [et al] // International journal of molecular sciences. 2020. V.21. N.3. P.966.
10. Kaur R., Salwan R., Sharma V. Structural properties, genomic distribution of laccases from Streptomyces and their potential applications // Process Biochemistry. 2022. V.118. P.133-144.
11. Bioelectrocatalytic reduction of dioxygen to water at neutral pH using bilirubin oxidase as an enzyme and 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) as an electron transfer mediator / Tsujimura S., Tatsumi H., Ogawa J. [et al] // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2001. V.496. N.1. P. 69-75.
12. Mano N., Edembe L. Bilirubin oxidases in bioelectrochemistry: Features and recent findings // Biosensors and Bioelectronics. 2013. V.50. P.478-485.
13. Structure of Bilirubin Oxidase from Bacillus pumilus Reveals a Unique Disulfide Bond for Site-Specific Direct Electron Transfer / Gihaz S., Herzallh N. S., Cohen Y. [et al] // Biosensors. 2022. V.12. N.5. P.258.
14. Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes / Shleev S., Tkac J., Christenson A. [et al] // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V.20. N.12. P.2517-2554.
15. Мот А. С., Силаги-Думитреску Р. Лакказы: строение ферментного комплекса, катализирующего одноэлектронную реакцию // Биохимия. 2013. T.78. № 2. С.167 - 184.
16. Solomon E. I. Spectroscopic Methods in Bioinorganic Chemistry: Blue to Green to Red Copper Sites // Inorganic chemistry. 2006. V.45. N.20. P.8012-8025.
17. Water-proof anti-drying enzymatic O2 cathode for bioelectric skin patch / Terutsuki D., Okuyama K., Zhang H. [et al] // Journal of Power Sources 2022. V.546. P. 231945.
18. Mechanistic characterization of an oxygen reduction reaction-driven, fully enzymatic and self-calibrating pH biosensor based on wired bilirubin oxidase / Ramonas E., Butkevicius M., Shleev S. [ et al] // Sensors and Actuators B: Chemical. 2022. V.367. P. 132054.
19. Structure of a multicopper oxidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum aerophilum / Sakuraba H., Koga K., Yoneda K. [ et al] // Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 2011. V. 67. N.7. P. 753-757.
20. Temperature depending bioelectrocatalysis current of multicopper oxidase from a hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum aerophilum / Tominaga M., Nakao S., Takafuji M. [et al] // Electrochemistry Communications. 2021. V.125. P.106982.
21. Голикова В. И., Гордеева Т. А., Алферов С. В. Биокатоды на основе лакказ в биотопливных элементах. Мини-обзор // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2020. №. 2. С. 3-11.
22. Биоэлектрокаталитические свойства бактериальных двух доменных лакказ / Алферов С. В., Абдуллатыпов А. В., Трубицына Л. И. [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2022. №. 1. С. 9-20.
23. Bilirubin enzyme biosensor: potentiality and recent advances towards clinical bioanalysis / Hooda V., Gahlaut A., Gothwal A. [et al] // Biotechnology letters. 2017. V.39. N.10. P.1453-1462.
24. Genomic analysis uncovers laccase-coding genes and biosynthetic gene clusters encoding antimicrobial compounds in laccase-producing Acinetobacter baumannii / Pooalai R., Khongfak S., Leungtongkam U. [et al] // Scientific Reports. 2022. V.12. N.1. P.1-9.
Понаморева Ольга Николаевна, д-р хим. наук, зав. кафедрой биотехнологии, olgaponamoreva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет.
ELECTROCHEMICAL COUPLING OF COPPER-CONTAINING OXIDASES IN BIOSENSORS AND BIOFUEL CELLS: A CHOICE OF METHODS AND
APPROACHES
O.N. Ponamoreva
An attempt to conduct an analysis on selection and research in the field of bioelec-trocatalysis in the study of copper containing oxidases (laccase and bilirubin oxidases). The structural features of the characters for all types of laccases and some bilirubin oxidases containing four copper atoms, which play a key role in the oxidation of the substrate, i.e., are described. transfer of electrons from the substrate to the active site of the enzyme. The advantages of bilirubin oxidases are that they are stable under physiological conditions, unlike fungal laccases, have a higher potential of the T1 center compared to bacterial laccases, and are able to efficiently oxidize bilirubin, which is used in the development of biosensors. The development of biocathodes based on laccases and bilirubin oxidases is the subject of intense research; however, studies are complicated by the fact that copper-containing oxidases in the form immobilized on the electrode behave differently than in solution. A promising direction is to increase the redox potential by site-directed mutagenesis and the possibility of producing the enzyme in significant amounts by molecular biotechnology.
Key words: laccases, bilirubin oxidases, bioelectrocatalysis, copper-containing oxidases.
Ponamoreva Olga Nikolaevna, doctor of chemical sciences, Head of Biotechnology Department, olgaponamoreva@mail.ru, Tula, Russia, Tula State University.
