CC BY
20
УДК 577.152.192.31; 547.99
БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА С УЧАСТИЕМ МЕДЬСОДЕРЖАЩИХ ОКСИДАЗ
М.Е. Хлупова1, И.С. Васильева1, Г.П. Шумакович1, О.В. Морозова1,
Е.А. Зайцева2, В.А. Чертков3, А.К. Шестакова4, А.В. Кисин4, А.И. Ярополов1*
(1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; 2кафедра химической энзимоло-гии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; 3кафедра органической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; 4 Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элементоор-ганических соединений; *e-mail: yaropolov@inbi.ras.ru)
Проведена окислительная полимеризация дигидрокверцетина (ДГК) с участием многоядерных медьсодержащих оксидаз: билирубиноксидазы (БОД) Myrothecium verrucaria и лакказы (ЛК) базидиального гриба Trametes hirsuta. При выбранных условиях, ферментативно синтезированные олигомеры ДГК были получены с хорошим выходом. Продукты ферментативного синтеза были охарактеризованы методами УФ-видимой, FTIR-, ЯМР 1Н- и 13С-спектроскопией. По сравнению с мономером олигомеры ДГК, синтезированные с использованием обоих ферментов, имели более высокую термостабильность. Физико-химические характеристики продуктов полимеризации ДГК различались в зависимости от используемой оксидазы. В результате ЯМР-исследований было показано различие в структурах олигомеров ДГК, полученных с использованием ЛК и БОД.
Ключевые слова: биокатализ, билирубиноксидаза, грибная лакказа, дигидрокверцитин, ферментативная полимеризация, ЯМР исследования.
Биокатализ представляет собой альтернативу традиционному химическому синтезу и позволяет проводить реакции в мягких условиях, соответствующих экологическим требованиям. Оксидо-редуктазы - важный инструмент для окислительной модификации природных соединений в целях получения новых субстанций для фармацевтики. Лакказа (и-дифенол : кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) и билирубиноксидаза (билирубин : кислород оксидоредуктаза, КФ 1.3.3.5) относятся к медьсодержащим оксидазам и катализируют од-ноэлектронное окисление органических и неорганических соединений молекулярным кислородом с сопутствующим восстановлением последнего непосредственно до воды [1, 2]. Окисление ароматических соединений происходит по радикальному механизму с последующим сочетанием ин-термедиатов, приводящим в итоге к образованию олигомерных или полимерных продуктов [3-8]. В результате окислительной полимеризации природных физиологически активных соединений, включая флавоноиды, могут быть получены новые соединения для фармацевтики. Согласно литературным данным, высокомолекулярные полифе-нольные природные соединения проявляют улучшенные физиологические свойства по сравнению с их мономерами [9-12].
Дигидрокверцетин относится к природным флавоноидам (рис. 1, 1). По своему химическому строению он близок к кверцетину (2) и рутину (3). Согласно имеющимся в литературе данным, ДГК не обладает генотоксичностью [13]. ДГК имеет широкий спектр фармакологического действия: он проявляет антиокси-дантные, ангиопротекторные, гепатопротек-торные, противоопухолевые и другие свойства [14-17]. Кроме того, ДГК обладает регулятор-ными свойствами и может контролировать репарацию ДНК, апоптоз, митохондриальный биогенез, а также регулировать активность различных ферментов [14, 18-21]. Известно, что многие флаваноиды, включая ДГК, быстро разлагаются в организме, в то время как их относительно высокомолекулярные производные имеют большее время жизни in vivo [22].
Приведенные выше данные указывают на перспективность получения новых производных ДГК. Поэтому целью настоящей работы стало изучение возможности использования медьсодержащих оксидаз (грибной лакказы и билирубиноксидазы) для окислительной полимеризации ДГК, а также изучение структуры и физико-химических свойств образующихся продуктов.
Рис. 1. Структурные формулы некоторых флавоноидов
Экспериментальная часть
Реактивы. В настоящей работе были использованы реактивы фирмы «Sigma- Al drich»: KH2PO4, NaOH, лимонная кислота, а также 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) (АБТС), N-метилпирролидон, тетрагидрофуран (ТГФ), 1,1'-дифенил-2-пикрилгидразил радикал (DPPH) и диметил-сульфоксид (ДМСО) («Марбиофарм», Россия) без дополнительной очистки. Все растворы были приготовлены с использованием деионизированной воды, полученной на установке «Milli Q-system» («Mil-lipore», США). Дигидрокверцетин (>96%) был приобретен у фирмы «БиоХимМак-СТ» (Россия).
Ферменты. Лакказа была выделена из куль-туральной жидкости базидиального гриба Trametes hirsuta, согласно методике, описанной в работе [23]. Фермент был гомогенен по данным SDS-электрофореза и имел удельную активность 158 МЕ/мг белка. За единицу ак-
13
тивности ЯМР С принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкмоль АБТС за 1 мин. Билирубиноксидаза Myrothecium verrucaria «Amano 3» («Amano Enzyme Inc.»,
Япония) была дополнительно очищена методом ионообменной хроматографии с использованием Тоуареаг1 БЕЛЕ, 650 М («Т080п Вю81епсе», Япония). Удельная активность полученного ферментного препарата составляла 110 МЕ/мг белка при использовании в качестве субстрата АБТС.
Ферментативная полимеризация ДГК. Ферментативный синтез олигомеров ДГК проводили в буферных растворах, содержащих 3 об.% этилового спирта, при комнатной температуре в аэробных условиях. БОД-катализируемую полимеризацию ДГК проводили в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7,0), а ЛК-катализируемую полимеризацию - в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 4,5). В типичном эксперименте 10 мг ДГК растворяли в 0,3 мл этилового спирта и к полученному раствору добавляли 10 мл соответствующего буферного раствора. Конечная концентрация ДГК в реакционной среде составляла 3,2 мМ. Полимеризацию мономера инициировали добавлением фермента. Синтез проводили в течение 24 ч на воздухе при комнатной температуре (21-22 оС) и постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Удельная активность
обоих ферментов в реакционной среде составляла 0,4 МЕ/мл. Образовавшиеся осадки олиго-меров ДГК отделяли центрифугированием, многократно промывали раствором этанола (3 об.%), высушивали и использовали в дальнейших экспериментах.
Характеризация продуктов полимеризации ДГК. Среднечисленную молекулярную массу (Mn) и индекс полидисперстности синтезированных олигомеров ДГК определяли методом гель-проникающей хроматографии высокого давления с помощью рефрактометрического детектора. Определение молекулярной массы ЛК-олигоДГК проводили на колонке PL-gel C («Phenomenex») с использованием ТГФ в качестве подвижной фазы, а БОД-олигоДГК - на колонке PL Gel MIXED-C («Agilent»), используя в качестве подвижной фазы N-метилпирролидон. Калибровку колонок проводили по полистирольным стандартам.
УФ-видимые спектры олигомеров ДГК записывали на спектрофотометре «UV1240 mini» («Shimadzu», Япония); FTIR-спектры были получены на спектрометре «Frontier FT-IR/FIR» («PerkinElmer Inc.») с использованием таблеток KBr. Термогравиметрический анализ образцов проводили в потоке азота со скоростью изменения температуры 10 °С/мин, используя термоанализатор «NETZSCH STA 409 PC/PG».
Спектры ЯМР 1Н и 13С регистрировали для образцов в растворе ДМСО^6 на спектрометре «Bruker AVANCE 600» с рабочей частотой для ядер 1Н 600,03 МГц.
Антиоксидантную активность измеряли спектрофотометрически при 515 нм, используя радикал DPPH в метаноле [24].
Результаты и обсуждение
В предварительных экспериментах были определены рН-зависимости активности ЛК и БОД в реакциях окисления мономера ДГК. ЛК имеет оптимум активности в реакции окисления ДГК при рН 4,0-4,5, а для БОД этот параметр сдвинут в область нейтральных значений рН. Следует отметить, что в ЛК-катализируемом синтезе при рН > 6,7 не образуются нерастворимые в реакционной смеси олигомеры ДГК. Максимальный выход нерастворимого продукта для этой реакции составлял ~32% при рН 4,5. Напротив, при использовании в качестве биокатализатора БОД максимального выхода (~36%) нерастворимых олигомеров ДГК удалось достичь при рН 7,0. При рН 4,5 образования нерастворимых продуктов не наблюдалось.
Было проведено сравнение физико-химических свойств олигомеров ДГК, синтезированных при рН 4,5 с участием грибной лакказы (ЛК-олигоДГК) и при рН 7,0 с использованием БОД (БОД-олигоДГК). Синтезированные олигомеры обладали разной растворимостью в органических растворителях. ЛК-олигоДГК и БОД-олигоДГК были растворимы в ДМСО и метаноле, однако в ТГФ полностью растворялись только олигомеры, синтезированные с использованием лакказы.
По данным гель-проникающей хроматографии, ЛК-олигоДГК имели среднечисленную молекулярную массу (Mn), равную 1000 г/моль, и индекс полидисперсности (РВ1), равный 1,4. В результате БОД-катализируемой реакции образовывались олигомеры с Mn = 2800 г/моль и РБ1 = 8,6.
По сравнению с мономером, УФ-видимые спектры олигомеров ДГК (рис. 2), полученных с использованием обоих ферментов, имели длинноволновый «хвост» в области 360-550 нм, указывающий на присутствие расширенного сопряжения [25]. В отличие от ЛК-олигоДГК, спектр олигомеров ДГК, синтезированных с участием БОД, имел выраженную полосу поглощения в области 420-450 нм.
Термогравиметрическим методом было показано, что до температуры 240-250 оС оли-гоДГК и мономер имели приблизительно одинаковую стабильность. При более высоких значениях температуры происходила резкая потеря веса всех исследованных образцов, причем термостабильность обоих олигомеров была выше, чем у мономера: олигоДГК теряли приблизительно 20% веса при 385 °С, в то время как у ДГК такая же потеря веса наблюдалась при 306 °С.
и -I-,-.----1--1 I I
250 300 350 400 450 500 550 600
Длина волны,нм
Рис. 2. УФ-видимые спектры БОД-олигоДГК (1), ЛК-олигоДГК (2) и мономера дГк (3) в ДМСО
12
11
I 1 1 1 1 I 1 1 1 1
13
10
13
ррш
ррш
5-ОН н5< Н6' н6 Н8
а 7-ОН З'-ОН 4'-ОН 11 Н2. ,3-ОН Нг Нз I
12
11
10
ррш
Рис. 3. Спектры ЯМР 1Н: а - мономер ДГК, б - БОД-олигоДГК, в - разбавленный раствор БОД-олигоДГК с добавле-
ЛК-олигоДГК, д - разбавленный раствор ЛК-олигоДГК с добавлением Б20
нием Э20, г
Антиоксидантную активность определяли как концентрацию олигомеров или мономера ДГК, необходимую для уменьшения начальной концентрации радикала ЭРРИ на 50%. Сначала измеряли скорость восстановления ЭРРИ при разных значениях концентрации исследуемых соединений. Выход на стационарные значения оптической плотности происходил через ~25 мин. Для БОД-олигоДГК антиоксидантная активность составляла 4 мкг/мл, для ЛК-олигоДГК и мономера ДГК - 10 и 7 мкг/мл соответственно. Таким образом, при БОД-полимеризации мономера образуются продукты, обладающие более высокой антиоксидантной активностью по сравнению с мономером.
Структуру ферментативно синтезированных олигомеров ДГК изучали методами БТ1Я-и ЯМР-спектроскопии. РТ1Я-спектры БОД-олигоДГК и ЛК-олигоДГК имели некоторые различия в интенсивности и форме пиков в областях
1400-1550, 1350-1400 и 960-1000 см-1. Оба эти спектра достаточно похожи на колебательный спектр мономера ДГК, однако их пики поглощения более широкие и сглаженные по сравнению со спектром мономера. Широкий пик с максимумом 3400 см-1 соответствует колебаниям О-Н-связи фенольных гидроксилов [26], сигнал при 1640 см 1 можно отнести к карбонильным группам [6, 10]. Адсорбция при 1150 см-1 обусловлена колебаниями С, -О-связи [27], слабые
арил 1 л7
сигналы в области 780-810 см- можно отнести к связям С=С и С-Н ароматического кольца [6]. Необходимо отметить, что на РТ1Я-спектрах олигоДГК отсутствовали полосы поглощения в области 870, 1200, 1240 см-1, соответствующие коллективным колебаниям связей Сарил-О-Сарил.
арил арил
Однако достоверную информацию о структуре олигомеров из этих данных получить непросто. Для более подробной структурной характеристики ферментативно синтезированных олигоДГК
был использован метод спектроскопии ЯМР 1Н
13^
и С.
Сравнительный анализ спектров (рис. 3) и 13С (рис. 4) мономера и олигомеров ДГК проводили исходя из предположения, что при ферментативной полимеризации не происходит разрыва С-С-связей бензольных колец.
На рис. 3, а приведено отнесение всех протонных сигналов ДГК. Для выявления сигналов гидроксильных протонов в спектрах ЯМР 1Н растворы олигоДГК в ДМСО-06 разбавляли в 15 раз и добавляли 10 мкл Э20 (тяжелой воды). В протонных спектрах олигомеров (рис. 3, в, д) заметно уменьшилась интенсивность сигналов гидрок-сильных групп в результате замещения протонов атомами дейтерия, что позволило выделить сигналы, относящиеся к ОН-группам. Сравнивая области химических сдвигов 8,3-13,5 м.д. в спектрах (рис. 3), можно заключить, что в образцах БОД-олигоДГК (рис. 3, б, в) и ЛК-олигоДГК (рис. 3, г, д) присутствуют все фенольные ги-дроксилы. При этом протоны гидроксильных групп 7-ОН, 3'-0Н и 4'-0Н вовлечены в обменные процессы. В то же время в олигомерах ДГК, как и в мономере, группа 5-ОН участвует в образовании водородной связи с карбонильным
кислородом кольца С (рис. 1), о чем свидетельствует наличие нескольких относительно слабо уширенных и четко различающихся сигналов в области 11,5-13,5 м.д. (рис. 3, б) и в области 11,3-12,3 м.д. (рис. 3, г). В спектрах олигоДГК отсутствует сигнал группы 3-ОН. Это позволяет предположить, что процесс ферментативной полимеризации ДГК с участием ЛК и БОД начинается с окисления гидроксильной группы в положении 3.
В области 5,5-8,0 м.д. в спектрах обоих оли-гомеров наблюдаются уширенные сигналы с высокой интегральной интенсивностью, соответствующие сигналам фенильных протонов мономера Н2', Н5', Н6', Н6 и Н8. Однако в спектре ЛК-олигоДГК (рис. 3, г, д) сигналы, соответствующие фенильным протонам Н2', Н5' и Н6', имеют заметно пониженную интенсивность по сравнению с интенсивностью сигналов Н6 и Н8. В спектре ЯМР 1Н БОД-олигоДГК (рис. 3, б) в областях 6,0-6,6 и 7,0-8,1 м.д. наблюдаются сигналы, которые отсутствуют в спектре мономера. Эти сигналы, вероятно, можно отнести к фе-нильным протонам, соответствующим протонам родственных флавоноидов 2-7 (рис. 1), имеющих двойную связь С2=С3. Кроме того, в спектрах
Рис. 4. Спектры ЯМР 13С - {1Н}: а - мономера ДГК, б - БОД-олигоДГК, в - ЛК-олигоДГК
олигомеров ДГК в области алифатических протонов Н2 и Н3 (4,5-5,8 м.д.) присутствуют уширенные сигналы, но их общая интегральная интенсивность заметно снижена по сравнению с сигналами фенильных протонов.
Таким образом, в результате сравнительного анализа протонных спектров олигомеров ДГК и мономера можно сделать вывод, что процесс ферментативной полимеризации ДГК с участием обеих оксидаз начинается с окисления гидроксиль-ной группы в положении 3. При этом наибольшие изменения происходят в положениях 2 и 3 кольца С молекулы ДГК. Вероятно, образовавшийся на первой стадии алкоксильный радикал мономера атакует вторую молекулу ДГК с замещением атомов водорода по всем возможным положениям в кольцах А и В при БОД-катализируемой полимеризации ДГК и преимущественным замещением атомов водорода в кольце В при ЛК-катализируемой полимеризации.
13
Сравнение спектров ЯМР С мономера (рис. 4, а) со спектрами БОД-олигоДГК и ЛК-олигоДГК (рис. 4, б, в) показало, что всем сигналам атомов углерода в спектре мономера соответствуют группы сигналов в спектрах оли-гомеров ДГК. Например, сигналы карбонильного углерода в спектрах олигоДГК в области 197-198 м.д. представляют собой уширенный сигнал и соответствуют положению карбонильной группы в мономере (197,7 м.д.). Однако наибольший интерес представляют те сигналы в спектрах олигомеров, которых нет в спектре мономера ДГК. Прежде всего, это группа сигналов четвертичных углеродов в области 191-193 м.д., особенно заметная в спектре ЛК-олигоДГК. Анализ литературных данных [28-31] позволяет предположить, что эти сигналы относятся к карбонильной группе С4, а изменение химического сдвига обусловлено замещением гидроксила в положении 3 на алкоксильную группу. В спектре ЯМР 13С БОД-олигоДГК (рис. 4, б) наблюдается группа сигналов четвертичных углеродов в области 176,0-177,5 м.д., которую можно отнести к карбонильной группе С4. Изменение химического сдвига обусловлено появлением двойной связи С2=С3, как в кверцетине (2) рутине (3), флавоне (5) и его производных (6)-(7). Образование двойной связи в БОД-олигоДГК, также подтверждается наличием сигналов четвертичных атомов углерода в области 135,5-136,0 м.д. (атом С3 в кверцетине (2) и рутине (3)) и в области 146,7-162,0 м.д. (атом С2 в флавоноидах (2)-(7)) [28-31].
Сигналам четвертичных и СН-углеродов колец А и В мономера соответствуют уширенные сигналы в спектрах обоих олигомеров ДГК. При этом сигналы углеродов С5, С6, С7, С8 и С10 в ЛК-олигоДГК (рис. 4, в) практически не меняют своего положения по сравнению с мономером. В то же время сигналы всех шести углеродов кольца В сильно уширены и имеют заметно пониженную интенсивность по сравнению с сигналами углеродов кольца А. В области 123-147 м.д. наблюдаются многочисленные узкие сигналы четвертичных атомов углерода. Такой вид спектра, вероятнее всего, свидетельствует о том, что при ЛК-катализируемой полимеризации ДГК происходит замещение атомов водорода на алкоксильный радикал по всем трем возможным положениям Н2', Н5' и Н6' в кольце В.
Спектр ЯМР 13С БОД-олигоДГК (рис. 4, б) имеет ряд особенностей. В области сигнала С1' мономера при 128 м.д. в спектре БОД-олигоДГК в области 121,9-128,4 м.д. присутствуют четыре группы сигналов четвертичных атомов углерода. Это может свидетельствовать о том, что на положение сигнала углерода С1' заметное влияние оказало изменение статуса ближайших соседей этого углерода в кольце С, в результате образования двойной связи С2=С3, как в кверцетине (2) и рутине (3) [29, 30]. Таким образом, в отличие от ЛК-катализируемой полимеризации ДГК, в процессе БОД-полимеризации происходит образование двойной связи С2=С3.
В спектре БОД-олигоДГК сигналы четвертичных атомов углеродов С5, С7, С9, С10 и С-Н углеродов С6 и С8 сохраняют свое положение, но уширяются (рис. 4, б). Наблюдаемые многочисленные узкие сигналы четвертичных углеродов в области 145,0-164,0 м.д. соответствуют углеродам С5 и С7. Также в спектре появляются заметные сигналы СН-групп при 90,7; 93,6; 98,4 и 98,7 м.д. Эти значения химических сдвигов очень хорошо согласуются с данными для кверцетина (2), рутина (3) и замещенных флавонов (6) и (7) [28-31]. В области 104,4112,4 м.д. наблюдаются сигналы четвертичных атомов углерода, значения химических сдвигов которых согласуются со сдвигами углерода С10 в кверцетине (2), рутине (3), генистеине (4) и в замещенных флавонах (6)-(7) [28-31]. Сигнал СН-группы при 107,2 м.д. может соответствовать атому углерода С3, как во флавонах ( 5)-(7), что обусловлено образованием связи С2=С3.
В области алифатических углеродов С2 и С3 в спектрах БОД-олигоДГК и ЛК-олигоДГК
наблюдаются уширенные сигналы на месте аналогичных сигналов в спектре мономера (83,0 и 71,5 м.д. соответственно).
Таким образом, на основании результатов сравнительного анализа спектров ЯМР 1Н и 13С мономера, БОД- и ЛК-синтезированных олигомеров ДГК и литературных данных для родственных соединений [28-31] можно выдвинуть следующие предположения. Окисление ДГК с участием обеих оксидаз начинается с отрыва атома водорода от гидроксильной группы в положении 3 с образованием активного радикала. При ЛК-катализируемой реакции алкок-сильный радикал предпочтительно замещает атомы водорода в положениях 2', 5', 6' кольца B другой молекулы мономера. В случае БОД-катализируемой реакции радикал может присоединяться к фенильным углеродам в положения 6, 8 кольца А и положения 2', 5', 6'кольца В. Может также происходить отрыв атомов водорода Н2 и Н3 в кольце С с образованием двойной связи С2=С3 с сохранением или без сохранения связи С3-О. Таким образом, БОД-олигоДГК имеют довольно нерегулярную структуру и содержат все возможные фрагменты в разных комбинациях. Сравнение результатов окисли-
тельной полимеризации ДГК с использованием ЛК и БОД позволяет предположить, что в ЛК-катализируемой реакции образуются короткие олигомеры (2-4 фрагмента ДГК в цепи), а при использовании БОД образуются олигомеры разной длины и более сложного строения.
Выводы
В работе описан ферментативный синтез оли-гомеров биологически активного соединения ДГК с использованием лакказы Trametes hirsuta и билирубиноксидазы Myrothecium verrucaria. Показано, что при оптимальном для каждого фермента значении рН реакционной среды образующиеся олигомеры имеют не только различные среднечисленные значения молекулярной массы и индекса полидисперсности, но и разную структуру. Термостабильность олигомеров ДГК выше, чем у исходного мономера. Кроме того, БОД-олигоДГК обладают большей антиоксидантной активностью по сравнению с мономером. Сравнение результатов и
13С-спектроскопии для олигомеров ДГК, мономера и родственных флавоноидов показало, что ферментативно синтезированные олигоДГК имеют нерегулярную структуру.
Исследований проводили с помощью оборудования Центра коллективного пользования «Промышленные биотехнологии» Федерального государственного учреждения «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Baldrian P. // FEMS Microbiol Rev. 2006. Vol. 30. N 2. P. 215.
2. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. // Chem. Rev. 1996. Vol. 96. N 7. P. 2563.
3. Witayakran S., RagauskasA.J. // Adv. Synth. Catal. 2009. Vol. 351. N 9. P. 1187.
4. Walde P., Guo Z. // Soft Matter. 2011. Vol. 7. N 2. P. 316.
5. Hollmann F., Arends I.W.C.E. // Polymers. 2012. Vol. 4. N 1. P. 759.
6. Mejias L., Reihmann M.H., Sepulveda-Boza S., Ritter H. // Macromol. Biosci. 2002. Vol. 2. N 1. P. 24.
7. Kim Y.-J., Uyama H., Kobayashi Sh. // Macromol. 2003. Vol. 36. N 14. P. 5058.
8. Magharabi M., Faramazzi M.A. // Adv. Synth. Can. 2014. Vol. 356. N 5. P. 897.
9. Hagerman A.E., Riedl K.M., Jones G.A., Sovik K.N., Ritchard N.T., Hartzfeld P.W., Riechel T.L. // J. Agric. Food Chem. 1998. Vol. 46. N 5. P. 1887.
10. Kurisawa M., Chung J.E., Uyama H., Kobayashi S. // Biomacromol. 2003. Vol. 4. N 5. P. 1394.
11. Kurisawa M., Chung J.E., Uyama H., Kobayashi S. // Macromol. Biosci. 2003. Vol. 3. N 12. P. 758.
12. Zhao J., Wang J., Chen Y., Agarwa R. // Carcinogenesis. 1999. Vol. 20. N 9. P. 1737.
13. Makena P.S., Pierce S.C., Chung K.-T., Sinclair S.E. // Environm. Molec. Mutagenesis. 2009. Vol. 50. N 6. P. 451.
14. Weidmann A.E. // Eur. J. Pharmacol. 2012. Vol. 684. N 1-3. P. 19.
15. Pantouris G., Mowat Ch.G. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2014. Vol. 443. N 1. P. 28.
16. Polyak S.J., Morishima Ch., Lohmann V., Pal S., Lee D.Y.W., Liu Y., Graf T.N. // PNAS. 2010. Vol. 107. N 13. P. 5995.
17. Soto M., Murakami K., Uno M., Ikubo H., Nakagama Yu., Katayama S., Akagi K., Irie K. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2013. Vol. 77. N 5. P. 1100.
18. Bordoni A., Hrelia S., Angeloni C., Giordano E., Guarni-eri C., Caldarera C.M., Bia P.L. // J. Nutr. Biochem. 2002. Vol. 13. N 2. P. 103.
19. Ferry D.R., Smith A., Malkhandi J., Fyfe D.W., Takats P.G., Anderson D., Baker J., Kerr D.J. // Clin. Cancer Res.
1996. Vol. 2. N 4. P. 659.
20. Ono K., Nakane H., Fukushima M., Chermann J.-C., Barre-Sinoussi F. // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 190. N 3. P. 469.
21. Zhang Zh.R., Zaharna M.A., Wong M.M.-K., Chin S.-K., Cheng H.-Y. // PLOS ONE. 2013. Vol. 8, N 1. P. e54577.
22. Hollman P.C., Katan M.B. // Biomed. Pharmacother.
1997. Vol. 51. N 8. P. 305.
23. Gorshina E.S., Rusinova T.V., Biryukov V.V., Morozova O.V., ShleevS.V., YaropolovA.I. // Appl. Biochem. Microbiol. 2006. Vol. 42. N 6. P. 558.
24. Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C. // LWT Food Sci. Technol. 1995. Vol. 28. N 1. P. 25.
25. Bruno F.F., Trotta A., Fossey S., Nagarajan S., Nagarajan R., Samuelson L.A., Kumar J. // J. Mac-romol. Sci., Part A: Pure Appl. Chem. 2010. Vol. 47. N 12. P. 1191.
26. ParkS.Y., Kim YH., Won K., SongB.K. // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009. Vol. 57. N 1-4. P. 312.
27. Won K., Kim Y.H., An E.S., Lee Y.S., Song B.K. // Bio-macromol. 2004. Vol. 5. N 1. P. 1.
28. Kiehlmann E., Slade P.W. // J. Nat. Prod. 2003. Vol. 66. N 12. P. 1562.
29. KolesnikY.A., TitovaE.V., Chertkov V.A., Tashlitskiy V.N., Tichonov V.P., Shmatkov D.A. // Planta Med. 2011. Vol. 77. N 12. P. 1266.
30. Sinha R., Joshi A., Joshi U.J., Srivastava S., Govil G. // Eur. J. Med. Chem. 2014. Vol. 80. P. 285.
31. Cotterill P.J., Scheinmann F., Stenhouse I.A. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1. 1978. N 6. P. 532.
Поступила в редакцию 10.09.17
MULTICOPPER OXIDASE-CATALYZED BIOTRANSFORMATION OF DIHYDROQUERCITIN
M.E. Khlupova1, I.S. Vasil'eva1, G.P. Shumakovich1, O.V. Morozova1, E.A. Zaitseva2, V.A. Chertkov3, A.K. Shestakova4, A.V. Kisin4, A.I. Yaropolov1*
(1 Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology RAS; 2 Enzymol-ogy Division, Chemistry Department, M.V. Lomonosov Moscow State University; Division of Organic Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University; State Research Institute of Chemistry and Technology of Organoelement Compounds; *e-mail: yaropolov@inbi.ras.ru)
Multicopper oxidases such as bilirubin oxidase (BOD) from Myrothecium verrucaria and laccase (LC) from the basidial fungus Trametes hirsuta have been used as catalysts in dihydroquercitin (DHQ) oxidative polymerization. The conditions selected enabled good yields of DHQ oligomers, which were then analyzed using UV-vis, FTIR, 1Н и 13С NMR spectroscopy. DHQ oligomers synthesized using both enzymes showed higher thermostability as compared with the monomer. Depending on the enzyme used, the products of DHQ polymerization differed in physico-chemical properties, and as shown by NMR studies, had different structures.
Key words: biocatalysis, bilirubinoxidase, fungal laccase, dihydroqurcetin (taxifolin), enzymatic polymerization, NMR investigation.
Сведения об авторах: Хлупова Мария Евгеньевна - науч. сотр. Института биохимии им. А.Н. Баха ФИЦ Биотехнологии РАН, канд. биол. наук (dave80@yandex.ru); Васильева Ирина Сергеевна - науч. сотр. Института биохимии им. А.Н. Баха ФИЦ Биотехнологии РАН, канд. хим. наук (irinasin@yandex.ru); Шумакович Галина Петровна - ст. науч. сотр. Института биохимии им. А.Н. Баха ФИЦ Биотехнологии РАН, канд. биол. наук (shumakovich1945@yandex.ru); Морозова Ольга Владимировна - ст. науч. сотр. Института биохимии им. А.Н. Баха ФИЦ Биотехнологии РАН, канд. хим. наук (morozova@inbi.ras.ru); Зайцева Елена Анатольевна - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (ezaitseva2008@gmail.com); Чертков Вячеслав Алексеевич - вед. науч. сотр. кафедры органической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук (vchertkov@hotmail.com); Шестакова Алла Константиновна - вед. науч. сотр. Государственного научно-исследовательского института химии и технологии элементоорганических соединений, канд. хим. наук (alshestakova@yandex.ru); Кисин Александр Вадимович - зав. лабораторией спектральных исследований Государственного научно-исследовательского института химии и технологии элементоорганических соединений, канд. хим. наук (kiskiskiskis@yandex. ru); Ярополов Александр Иванович - зав. лабораторией химической энзимологии Института биохимии им. А. Н. Баха ФИЦ Биотехнологии РАН, профессор, докт. хим. наук (yaropolov@ inbi.ras.ru).
