CC BY
50
average daily live weight gain values and stratified at the interval of 100g per day were surveyed. Most of the animals earlier affected by gastrointestinal and respiratory diseases appeared to be in the first group; average daily gain for them was 532 g in average. Calving Ease item was analyzed for 4 first-calf heifer groups, formed by average daily live weight gain from the birth to the fist fruitful insemination. The first group involved animals having gains of 700 g per day; and further, 3 first-calf heifer groups were identified using the same interval of 100 g per day as in the first case. It was ascertained that the easiest calving events were registered in the first-calf heifers with live weight gains from the birth to insemination within 700-900 g per day, and their age at first calving was 23 to 27 months of old. Among the cows of those groups, the service-period was running less. These parameters should be considered as optimal for the herd. Later, gynecological diseases were registered more often among the first-calf heifers with difficult calving; over 20% of heads from the first and fourth groups were culled out before the end of the first lactation. As reducing age at the first calving at less than 23 months as extending it beyond 27 months resulted in the frequency of a difficult calving that increased by 18-37% being the main reason to cull them out of the herd.
Key words: heifer, growth intensity, well-being of calving, live weight growth, service-period.
УДК 601.4
ЭКСТРАГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНФОРМАЦИЯ - КАК ФАКТОР ЭМБРИОНАЛЬНОЙ СМЕРТНОСТИ ЖИВОТНЫХ
В.А. БАГИРОВ, член-корреспондент РАСХН, зав. лабораторией
В.П. КОНОНОВ, доктор биологических наук, главный научный сотрудник
П.М. КЛЕНОВИЦКИЙ, доктор сельскохозяйственных наук, главный научный сотрудник
Б.С. ИОЛЧИЕВ, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
ВИЖРоссельхозакадемии,
\Л.К. ЭРНСТ |, доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН
E-mail: [email protected]
Резюме. Среди факторов, влияющих на уровень воспроизведения животных, особое место занимают эмбриональные потери, которые могут достигать почти половины всех оплодотворенных ооцитов, особенно при осеменении криокон-сервированным семенем. Исследования проводили с целью определения возможности переноса сперматозоидами чужеродных нуклеиновых кислот (чДНК) в ооциты кроликов. В качестве чДНК использовали репортерный ген pCMVlacZ, перенос которого в ооцит и последующую экспрессию можно довольно точно определить по реакции фермента в-галактозидазы с субстратом X-gal. Генную конструкцию добавляли к охлажденному до 0 oC семени из расчета 1 мкг ДНК на 1 млн сперматозоидов в виде 0,01 %-ного раствора в трис-ЭДТА буфере. В контрольные образцы добавляли соответствующее количество трис-ЭДТА буфера. У 12 % эмбрионов, полученных от семени, инкубированного с чДНК, проявилась положительная реакция на в-галактозидазу. При этом существенного влияния на оплодотворяемость не наблюдалось. В контрольной группе на стадии 16 бластомеров находилось 86,9 % эмбрионов, на стадии 8 бластомеров -13,1 %, при использовании семени, замороженного с чДНК, стадии 16 бластомеров достигли только 50,7 % эмбрионов, 8 бластомеров - 24,9 %, 4 бластомеров - 15,1 %, 1.2- клеточной стадии - 9,3 %. Присутствие чДНК при замораживании семени привело к появлению большого числа дегенериро-ванных эмбрионов (33±3 %), что свидетельствует о высокой эмбриональной смертности. Поскольку в контроле этого не отмечено, на наш взгляд, такая ситуация обусловлена действием экстрагенетической информации, заключенной в гене pCMVlacZ. С учетом изложенного для снижения эмбриональных потерь при искусственном осеменении необходима защита сперматозоидов от чужеродной генетической информации.
Ключевые слова: сперматозоиды, криоконсервация, эмбриональная смертность, чужеродные ДНК.
Среди факторов, влияющих на уровень воспроизведения животных, особое место занимают эмбриональные потери, которые могут достигать почти половины всех оплодотворенных ооцитов, особенно после осеменения криоконсервированным семенем [1].
Для успешного решения этой проблемы, прежде всего, необходимо углубленное изучение причин ранней эмбриональной смертности [2]. Особое место среди них отводится генетическим и микробиологическим факторам [3]. Однако достаточной ясности в механизме их действия до сих пор нет.
Возможность включения чужеродных нуклеиновых кислот (чДНК) в ооциты с помощью сперматозоидов впервые была показана в 1971 г. [4]. Результаты последующих биотехнологические исследований подтвердили реальность этого процесса. Так, _ау|^апо М. в! а1. сообщили [5], что перенос чДНК посредством сперматозоидов может иметь место при оплодотворении у мышей. Используя сперматозоиды в качестве вектора, эти авторы получили трансгенных животных.
Аналогичные результаты переноса генов отмечены у кроликов [6...8], КРС [9], свиней [10]. В опытах, проведенных на разных видах животных, показано, что внесенная сперматозоидом чДНК способна к экспрессии [11]. РгапсоНп М. в! а1. [7] показали, что способность сперматозоидов захватывать экзогенную ДНК - свойство большинства клеток в популяции (70.90 %), при этом 50 % сперматозоидов, связавших ДНК, включают ее в ядро.
Цель наших исследований - определить возможности переноса сперматозоидами чДНК в ооциты кроликов.
Условия, материалы и методы. Работа выполнена на базе ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии. В качестве чДНК использовали репортерный ген рОМУ1ас7. Применение этой генной конструкции позволяет довольно точно выявлять перенос чДНК сперматозоидами в ооцит и последующую экспрессию по реакции фермента р-галактозидазы с субстратом Х-да1 [12].
Для проверки гипотезы о возможности включения чужеродной генетической информации в сперматозоиды генную конструкцию рОМУ1ас7 добавляли к
охлажденному до 0 0С семени из расчета 1 мкг ДНК на 1 млн сперматозоидов в виде 0,01 %-ного раствора в трис-ЭДТА буфере. В контрольные образцы добавляли соответствующее количество трис-ЭДТА буфера. Семя инкубировали при 0 0С в течение 10.15 мин. и замораживали гранулами по 0,25.0,30 мл на охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластине в течение 5 мин. и в соломинках 0,25 мл. Замороженное семя переносили в сосуды Дьюара и сохраняли в жидком азоте до использования в осеменении.
Таблица 1. Частота проявления экспрессии гена pCMVlacZ в эмбрионах
Инкубация Исследовано эмбрионов, шт. Положительная реакция на в-галакто-зидазу
шт. \ %
Без чДНК (контроль) 113 0 0 В присутствии чДНК (опыт) 252 29 12+2***
*** р<0,001
Через 44.46 ч. после осеменения самок убивали, эмбрионы вымывали из яйцеводов 0,9 %-ным раствором ЫаС!. Подсчитывали число оплодотворенных яйцеклеток, сопоставляя его с числом вскрытых фолликулов в яичниках. Жизнеспособность эмбрионов определяли по степени развития морулы, морфологическому состоянию их клеточного комплекса и соответствию стадии развития зародыша возрасту от осеменения крольчихи-донора до извлечения эмбриона.
Таблица 2. Влияние добавления чДНК к семени на оплодотворяемость
Инкубация Осе- мене- Извлечено ооци-тов и эмбрионов Оплодот-воряе-мость, %
но маток все- го эмбри- онов ооци- тов
Без чДНК (контроль) 8 108 99 9 92+3
В присутствии чДНК (опыт) 16 230 205 25 89+ 2
После морфологического тестирования зигот их подвергали гистохимической реакции на активность р-галактозидазы.
Эмбрионы фиксировали 2,5 %-ным глутаровым альдегидом, отмывали фосфатным буфером и инкубировали 30 мин. 0,2 % Тритона Х-100, 150 мкг/мл хлорок-вина в фосфатном буфере (рН=7,4.7,6). После этого добавляли субстрат Х-да1 до конечной концентрации 0,4 мкг/мл и проводили инкубацию в течение 8.48 ч. при 30 0С [13]. Положительной реакцией на активность р-галактозидазы считали наличие в бластомерах участков, окрашенных в отчетливый зелено-голубой цвет.
Результаты и обсуждение. Среди эмбрионов, полученных от семени, обработанного чДНК, у 12 % проявилась положительная реакция на р-гапактозидазу (табл. 1). Следовательно, при криоконсервации семени генетическая конструкция рСМУ!ае7 связывалась со сперматозоидами и вносилась в ооциты в процессе оплодотворения с последующей экспрессией.
При заблокированной охлаждением активности нуклеаз инкубирование семени в присутствии чДНК не отразилось на оплодот-воряемости (табл. 2).
Морфологический анализ показал, что эмбрионы, полученные при использовании семени, замороженного с чДНК, значительно отставали в своем развитии (табл. 3). Так, в контрольной группе на стадии 16 бластомеров находилось 86,9 % эмбрионов, на стадии 8 бластомеров - 13,1 %, что свидетельствует об их нормальном развитии. В опытной группе стадии 16 бластомеров достигли только 50,7 % эмбрионов, 8 бластомеров - 24,9 %, 4 бластомеров - 15,1 %, 1.2клеточной стадии - 9,3 %.
В результате дальнейших исследований (табл 4.) было установлено существенное влияние присутствия чДНК при замораживании семени на качество эмбрионов. В наших экспериментах это привело к появлению большого числа дегенерированных эмбрионов. Поскольку в контроле такого явления не отмечено, мы однозначно можем объяснить такую ситуацию действием экстрагенетической информации, заключенной в гене рСМУ!ае7.
В ряде случаев при обработке сперматозоидов рекомбинантными ДНК у доимплантационных эмбрионов кролика были выявлены характерные морфологические признаки апоптоза. Причиной индукции апоптоза в ранних эмбрионах может быть деградация как экзогенной, так и хозяйской ДНК сперматозоидов [14]. Это предположение основано на представлении о роли белка р53 в остановке и переключении клеточного цикла для репарации или дальнейшего развития клетки по пути апоптоза при появлении разрывов в хромосомной ДНК [15]. При разрывах в хромосомной ДНК белок р53 на некоторое время останавливает клеточный цикл и запускает репарацию ДНК. Если повреждения устранить не удается, то клетка направляется в апоптоз.
С-концевой домен белка р53 способен связываться с концами поврежденной ДНК, и это взаимодействие приводит к изменению его конформации и активности, а также к накоплению в ядрах клеток. Включение механизмов апоптоза у ранних эмбрионов в ответ на проникновение со сперматозоидом фрагментированной ДНК представляется вполне вероятным [16]. Возможно, это один из способов защиты развивающегося организма от чужеродной генетической информации.
С учетом результатов наших исследований для снижения эмбриональных потерь необходима защита сперматозоидов от чужеродной генетической информации. Однако современная технология искусственного осеменения не позволяет получать стерильное семя, а его последующая санация не избавляет от чДНК. Кроме того, чужеродная генетическая информация заносится в семя при его технологической обработке с желтком куриных яиц -непременным компонентом криопротективных сред. Также в семени присутствует хотя и не чужеродная, но неспецифическая для эмбрионов ДНК из разрушающихся тканей половых органов самцов.
В этой связи, как уже указывалось, высокая активность нуклеаз в семени [17] - эволюционно вырабо-
Таблица 3. Характеристика эмбрионов на разных стадиях развития после добавления к семени чДНК pCMVlacZ
Инкубация Исследовано эмбрионов, шт. Число бластомеров
2 4 8 16
шт. % шт. % шт. % шт. %
Без чДНК (контроль) 99 0 0 0 0 13 13,1 86 86,9
В присутствии чДНК
(опыт) 205 19 9,3 31 15,1 51 24,5 104 50,7
Таблица 4. Результаты оценки эмбрионов в связи с добавлением к семени чДНК
Инкубация Исследовано эмбрионов, шт. Дегенериро- ванные
шт. I %
Без чДНК (контроль) 99 0 0
В присутствии чДНК
(опыт) 205 68 33 + 3***
*** р<0,001
танное средство устранения этих факторов как причин эмбриональной смертности. Однако технологическая обработка семени снижает, а, возможно, даже устраняет нуклеазную активность плазмы.
Во-первых, семя многократно разбавляется синтетической средой, в которой уменьшается концентрация ферментов.
Во-вторых, разбавляющие среды, как правило, содержат компоненты (цитратный, сульфатный, ЭДТА и др. анионы), деионизирующие щелочноземельные металлы (Са++, Мд++), блокирующие активные центры нуклеаз.
В-третьих, технология обработки семени предусматривает охлаждение до разных уровней: комнатная температура, 0 0С и -196 0С (жидкий азот), что также в той или иной мере блокирует активность нуклеаз [18].
Выводы. Полученные результаты дали вполне однозначный ответ - так называемая экстрагенетическая информация способна связываться со сперматозоидами при криоконсервации семени. Это практически не изменяет оплодотворяющую способность сперматозоидов, но существенно снижает эмбриональную выживаемость.
Литература.
1. Милованов В.К. Пути интенсификации воспроизводства сельскохозяйственных животных //Животноводство. - 1984. -№ 7. - С. 19-21.
2. Кононов В.П., Багиров В.А. О некоторых причинах эмбриональной смертности у животных //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1996. - № 6. - С. 37-38.
3. Соколовская И.И. Некоторые причины и меры предотвращения эмбриональной смертности. //Доклады советских ученых к Пятому международному конгрессу по биологии воспроизведения и искусственному осеменению животных. - М., 1964. - С. 122-126.
4. Brackett B., Baranska W., Sawicki W., Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1971. - 68 (2). - Р.353-357.
5. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V., Dolci S., Farace M., Spadafora C. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs genetic transformation of mice. // Cell. - 1989. - V. 57. - P. 717-723.
6. Perez A., Solano R., Castro F.O., Lleonart R., de Armas R., Martinez R., AquilarA., Herrera L., de la Fuente J. Sperm cells mediated gene transfer in cattle. // Biotechnological Aplicada. - 1991. - V. 8(1). - P. 90-94.
7. Francolini M., Lavitrano M., Lamia C.L., French D., Frati L., Cotelli F., Spadafora C. Evidence for nuclear inter- nalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells. // Mol. Reprod. Dev. - 1990. - V. 34. - P. 133-139.
8. Багиров В.А., Кононов В.П. Сперматозоиды как векторы для переноса чужеродного генетического материала.//Со-временные проблемы воспроизводства стада сельскохозяйственных животных и задачи кадрового обеспечения. - Быково, 1996. - С.21-22.
9. Castro F., Hernandez O., Uliver C., Solano R., Milanes C., AquilarA., Perez A., de Armas R., Herrera L., de la Fuente J. Introduction of foreign DNA into the spermato- zoa of farm animals. // Theriogenology. - 1990. - V. 34 (6). - P. 1099-1110.
10. Gandolfi F., Lavitrano M., Camaioni A., Spadafora C., Siracusa G., Lauria A. The use of sperm-mediated gene transfer for the generation of transgenic pigs. // J. Rep- rod. Fert. Abstr. - 1989. - V. 4. - P. 21.
11. Hochi S., Ninomiya T., Mizuno A., Honma M., Yuki A. Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs by spermatozoa. // Animal Biotech. - 1990. - V. 1(1). - P. 21-31.
12. Кузнецова И.В., Щит И.Ю., Кузнецов А.В. О ДНКазной активности спермы различных видов животных в связи с особенностями их оплодотворения. // Сельскохозяйственная биология. - 1999. - №2. - С. 77-79.
13. Thorey I.S., Meneses J.J., Neznanov N.S., Kulesh D.A., Pedersen R.A., Oshima R.G. Embryonic expression of human keratin 18 and K-18- в-galactozidase fusion genes in transgenic mice. //Develop. Biol. - 1993. - V. 160. - P. 519-534.
14. Bagirov V.A. Exogenous DNA as the reason of embryonic mortality at animalsy/Материалы международной научнопрактической конференции «Роль и значение искусственного осеменения сельскохозяйственных животных XX и XXI веков». -Дубровицы, 2004. - С.217-222.
15. Nelson W.G., Kastan M.B. DNA strand breaks, the DNA template alteration that triggers p53-dependent DNA damage response pathways. // Mol Cell Biol. - 1994. - 14. - Р.1815-1823.
16. Багиров В.А. Возможность проникновения экстрагенетической информации в сперматозоиды при криоконсервации семени. // II-международная конференция «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». - Боровск, 1995. - С. 169170.
17. Polakovski K.L., Kopta M. Seminal plasma In: Biochemistry of Mammalian Reproduction. /Egs Zanefeld L.J.D., Chatterton R.T., N.-Y.: J.Wiley and Sons, P 89-117.
18. Bagirov V.A., Kononov V.P. The possibility of exogenous DNA penetration into spermatozoa at semen cryopreservation. // Book of Abstracts of the 51th Annual Meeting of the EAAP. - The Hagua. Netherland, 2000. - Р.19.
EXTRAGENETIC INFORMATION AS A FACTOR OF EMBRYONIC MORTALITY OF ANIMALS V.A. Bagirov, V.P. Kononov, P.M. Klenovitsky, B.S. Iolchiev, IL.K. Ernst]
Summary. Among factors affecting the level of animal reproduction embryonic losses hold a specific place. They can reach almost a half of all fertilized oocytes, especially with the insemination with cryopreservated sperm. The aim of the investigation was to determine the possibility of foreign DNA (fDNA) transfection by spermatozoa to rabbit oocytes. The reporter gene pCMVlacZ was used as fDNA that allows identifying rather accurately the transfection of fDNA by spermatozoa to oocytes and the following expression by the reaction of the enzyme p-galactosidase with the substrate X-gal. The gene construction was added to sperm chilled to 0 °C in an amount of 1 |jg DNA per 1 million spermatozoa as 0.01% solution in Tris-EDTA buffer. In control samples the same volume of Tris-EDTA buffer was used. Twelve per cent of embryos obtained from semen incubated with fDNA had the positive reaction on p-galactosidase. There was not a significant influence on the conception. In the control group 86.9 % of embryos were at the stage of 16 blastomeres, 13.1 % - at the stage of 8 blastomeres. When the sperm frozen with fDNA was used, only 50.7 % of embryos reached the stage of 16 blastomeres, 24.9 % - the stage of 8 blastomeres, 15.1 % - the stage of 4 blastomeres, 9.3 % - the stage of 1-2 cells. The presence of fDNA during the sperm freezing led to a large number of degenerated embryos (33±3 %), which indicates the high embryonic mortality. As this is not noticed at the control in our view this situation is caused by extragenetic information in the gene pCMVlacZ. Subject to this the defense against foreign genetic information is necessary to decrease embryonic losses during artificial insemination.
Key words: sperm, cryopreservation, embryo mortality, exogenic DNA.
