CC BY
261
Наталья Михайловна Сураева1, Артем Владимирович Самойлов2
ПОЛУЧЕНИЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ТРАНСГЕННОЙ ПТИЦЫ
1 Д. б. н., ученый секретарь НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 Аспирант, НИИ пушного звероводства и кролиководства РАСХН (140143, РФ, Московская обл., Раменский р-н, п. Родники, ул. Трудовая, д. 6)
Адрес для переписки: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Сураева Наталья Михайловна;
e-mail: nsuraeva@yandex.ru
Рассмотрены подходы к получению рекомбинантных фармацевтических белков с использованием культуры прокариотических и эукариотических клеток, трансгенных растений и животных. По сравнению с млекопитающими трансгенная птица по ряду физиологических и биохимических параметров обладает рядом преимуществ как биореактор. Однако эффективная интеграция и экспрессия чужеродного гена возможна только с генной конструкции, обладающей набором необходимых элементов, при этом список таких элементов постоянно пополняется благодаря новым знаниям молекулярных механизмов генной регуляции. Значительные успехи в трансгенезе птицы были достигнуты при трансфекции и трансплантации культивируемых стволовых эмбриональных клеток. Получены соматические и половые трансгенные химеры, в белке яйца которых продуцировался белок человека. Другим перспективным и экономически более выгодным методом получения трансгенной птицы является технология переноса чужеродной ДНК с помощью сперматозоидов петуха; более того, обнаружены эндогенные механизмы встраивания экзогенной ДНК. Показано, что липосомы, а также такие переносчики, как моноклональные антитела, диметилсульфоксид и др., электропорация, микроинъекция комплекса ДНК с липосомами способствуют более эффективному хромосомному встраиванию генных конструкций в сперматозоиды.
Ключевые слова: фармацевтические белки, трансгенез, птица, сперматозоиды, стволовые клетки.
Онкология остро нуждается в гемопоэтических факторах роста, таких, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ), эритропоэтин и т. п., так как доказана эффективность использования ГКСФ человека (ГКСФ-ч) против различных форм лейкопении, вызванной химио- и радиотерапией при лечении онкологических заболеваний. ГКСФ-ч восстанавливает иммунную систему и обеспечивает возможность применения боле высоких доз препаратов при химиотерапии, что повышает эффективность лечения онкологических заболеваний. Технологии получения рекомбинантных белков открывают новый, более эффективный путь производства белковых фармацевтических препаратов.
Впервые использование белков в качестве фармацевтического препарата было апробировано в 20-е гг. прошлого столетия на инсулине, выделенном из поджелудочной железы свиньи. Через 60 лет был получен инсулин человека с помощью рекомбинантных бактерий. Этот инсулин оказался высокого качества и был адаптирован
© Сураева Н. М., Самойлов А. В., 2009 УДК 615.272.6:575.22:598.2
для всех групп пациентов, страдающих сахарным диабетом. Такими же превосходными качествами обладал и рекомбинантный гормон роста человека. Однако вскоре выяснилось, что способности бактерий синтезировать некоторые белки (особенно сложные) ограничены. При этом белковые нити могут необратимо ассоциировать друг с другом или неправильно ориентироваться, нарушая активный центр молекулы, состоящий из нескольких субъединиц. Бактерии также не способны провести ряд операций по созреванию белка: фосфорилирование, гликозилирование, карбоксилирование и др. Поэтому были предприняты значительные усилия по созданию других биологических систем, способных синтезировать фармацевтические белки необходимой структуры с низкой себестоимостью производства.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ — ПРОДУЦЕНТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ
В связи с тем что бактерии не могли удовлетворить запросам, которые предъявлялись к биологическим системам синтеза сложных белков, следующим объектом исследования были выбраны дрожжи, с помощью кото-
рых как эукариотических клеток с большим потенциалом к синтезу белковой массы предполагалось решить обсуждаемые проблемы. Однако синтетические возможности дрожжей также были ограничены. Получение рекомбинантных белков с использованием генетически модифицированных микроорганизмов не обеспечивает посттрансляционных модификаций, таких, как глико-зилирование, фолдинг белка, что приводит к снижению стабильности и физиологической активности получаемого белка. Более привлекательной оказалась система культивирования животных и человеческих клеток. Однако, несмотря на то что в культуре клеток млекопитающих происходят все необходимые посттрансляционные процессы в рекомбинантном белке, его концентрация очень низкая, а процесс культивирования дорогостоящ и обусловливает необходимость в высокотехнологичном оборудовании.
Растения также имеют ряд преимуществ как объект трансгенеза, обладая высоким синтетическим потенциалом, биологической безопасностью экзогенных белков и возможностью использования относительно простого и дешевого способа получения продуцентов. В настоящее время в промышленных объемах получены ферменты, используемые в диагностике и в исследовательских целях. Клетки растений, как и животные клетки, способны обеспечить полноценную упаковку рекомбинантного белка, однако и в этом случае имеются серьезные ограничения, связанные с неправильным гликозилирова-нием и проблемами очистки из-за присутствия неблагоприятных для человека протеаз или полифенольных примесей [1].
И наконец, трансгенные животные обладают многими привлекательными свойствами в качестве продуцентов фармацевтических белков в отношении как невысоких затрат по их получению, так и возможности синтезировать сложные белки. Органы животных, например молочная железа [2; 3], белок яйца птицы [4], семенная плазма [5], жировые железы [6], кровь и лимфа личинок насекомых [7] и др., потенциально могут быть использованы для синтеза фармацевтических белков. Оказалось, что молочная железа является наиболее удобной системой, особенно в отношении стабильности синтезируемых белков. Были получены трансгенные кролики, свиньи, овцы, козы и коровы, в молоке которых синтезировались рекомбинантные белки.
В последние годы наиболее пристальное внимание исследователей направлено на разработку технологии получения рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы, которое стало возможным благодаря развитию новых методов введения чужеродных генов в половые клетки этих животных. Белок яйца содержит около 4 г протеинов, половина которых представлена овальбумином. Следовательно, с помощью овальбуми-нового промотора можно было бы получить почти 1 г рекомбинантного белка с 25% чистотой в стерильном естественным образом белке яйца. В отличие от крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов, в организме птиц и человека в качестве компонентов гликопротеинов используются остатки сиаловой кислоты одинаковой структуры. Однако существуют значительные различия по физиологии воспроизводства кур и млекопитающих.
Проблемы извлечения зиготы у птицы и ее большой размер создают трудности при инъекции чужеродных генов, в то время как сразу после снесения яйца эмбрион легко доступен, но уже состоит примерно из 60 000 клеток.
Первые попытки использовать эмбриональные клетки сразу после откладки яйца в качестве потенциальных клеток мишеней для внедрения чужеродной ДНК в половую линию птицы были обнадеживающими, но затем исследователей постигло разочарование. К успехам можно отнести разработку технологии создания половых химер кур при пересадке донорских клеток из неинкубирован-ного яйца [8; 9], затем из зародышевого серпа, крови и ранних гонад [10; 11]. Однако после трансфекции данных клеток не удавалось получить стабильную передачу трансгена в поколениях. Пожалуй, только с использованием репликативно-дефектного ретровирусного вектора в качестве переносчика экзогенных генов были получены несколько поколений трансгенной птицы, стабильно передающих экспрессирующий ген бактериальной Р-галактозидазы в соответствии с менделевским распределением [12], но уровень экспрессии оставался низким.
И только недавно благодаря достижениям в области молекулярной и клеточной биологии по созданию более эффективных генных векторов вирусного и невирусного происхождения, развитию технологии культивирования плюрипотентных стволовых эмбриональных клеточных линий, использованию сперматозоидов и половых органов в качестве объектов введения генов в яйцо трансгенных кур этот продуцент стал рассматриваться как одна из перспективных систем синтеза фармацевтических белков. Моноклональные антитела человека (МКАТ), полученные из яйца трансгенных кур, по своим физиологическим характеристикам не уступали аналогичным, полученным с помощью таких традиционных систем, как клетки яичника хомячка или мышиные миеломные клетки, за исключением различий в профилях №1шк^ олигосахаридов. В отличие от МКАТ трансгенных растений и млекопитающих, МКАТ, продуцируемые куриной системой, обладали повышенной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью, приемлемым периодом полураспада, несмотря на отсутствие остатка сиаловой кислоты, правильным гликозилирова-нием, превосходным связыванием, хорошим уровнем интернализации [4]. К тому же концентрация рекомбинантного белка также была высокой — в пределах 1—3 мг на яйцо, в связи с чем представлялось возможным использование этой технологии для коммерческого получения этого белка.
ГЕННЫЕ КОНСТРУКЦИИ
Первые эксперименты по получению трансгенных животных, проводимые в 80-е гг. прошлого столетия, показали, что генные конструкции, успешно экспрессируемые в культуре трансфецированных клеток в геноме животного, слабо активны. Более того, большинство из этих конструкций оказались неэкспрессирующими. Таким образом, получение экспрессирующего трансгена представляет собой довольно сложную задачу, и в настоящее время идеальный вектор еще не создан. Однако достигнут несомненный прогресс в области конструирования генных векторов, используемых для трансгене-
за клеток животных. Необходимо также отметить, что у животных-продуцентов (кролики, овцы, козы, коровы, куры) фармацевтические белки должны продуцироваться в определенных органах (молочная железа, яйцевод) и в нетоксичных для организма концентрациях.
Известно, что для создания экспрессирующей конструкции необходим набор элементов, которые взаимодействовали бы друг с другом, хотя механизм этого процесса до конца неизвестен [13]. К этим элементам относятся промотор, энхансеры, инсуляторы, интроны и транскрипционный терминатор. Промотор необходим как для инициации транскрипции, так и для специфической экспрессии. Энхансеры также усиливают тканеспецифичную активность, представляя собой локус от 0,5 до 10 тыс. пар нуклеотидов, расположенный перед промотором, в транскриционной области и после транскрипционного терминатора; они также могут быть вставлены в конструкцию в начало промоторного локуса. Более низкая экспрессия трансгена наблюдается при использовании 1) кДНК по сравнению с аналогичной геномной ДНК; 2) при интеграции нескольких копий, в присутствии плазмидных последовательностей; 3) при интеграции в молчащие области хромосом («эффект положения»). Все это необходимо учитывать при конструировании.
В 90-е гг. прошлого столетия разработана концепция об инсуляторах (LCR), к которым относят последовательности ДНК по границам группы генов, выполняющих совместную функцию, отделяющие эти гены от остальных частей хромосомы. LCR представляют собой многофункциональные системы, контролирующие активность энхансеров и влияющие на структуру хроматина. Добавление элемента 5'HS4 (инсуляторной последовательности с 5'-конца куриного Р-глобинового локуса) в генные конструкции значительно повысило уровень экспрессии встроенных генов у мышей [14] и кроликов [15]. Были добавлены две копии инсуляторной последовательности HS4 из куриного Р-актинового локуса в конструкцию с геном зеленого белка, позволившие получить потомков с экспрессией этого гена после инъекции в куриные эмбрионы трансфецированных первичных половых клеток (ППК) [16]. Саузерн-блот-анализ подтвердил, что экспрессия зеленого белка осуществлялась с трансгенной линии ППК.
Транскрипционная область гена также содержит несколько регуляторных элементов, ответственных за сплайсинг экзонов (созревание РНК), транспорт РНК в цитоплазму, ее специфичность и полураспад. Экспрессирующий вектор должен содержать хотя бы один интрон, который контролирует транспорт РНК в цитоплазму. Альтернативный сплайсинг — довольно часто встречающееся явление для РНК высших позвоночных, позволяющее контролировать генную экспрессию и увеличить разнообразие белков при ограниченном числе генов. Однако соединение интронов и кДНК может привести к альтернативному сплайсингу и препятствовать синтезу необходимого белка у трансгена. Одним из путей преодоления этого препятствия может быть мутация в этом месте конструкции.
В связи с тем что каждая группа организмов использует предпочтительно один из изокодонов, экспрессия трансгена значительно возрастает в случае использова-
ния гомологичного кодона. Например, для экспрессии трансгена в молоке мРНК белков молока, в яйце птицы — овальбумина или куриного Р-актина.
Секретируемый белок обязательно содержит сигнальный пептид, поэтому правильный выбор одного или нескольких таких пептидов обеспечит направленную доставку рекомбинантного белка в органеллу клетки и его эффективную наработку.
В случае если экзогенный белок состоит из нескольких субъединиц, используется прием соединения в одной конструкции нескольких кодирующих последовательностей или различных конструкций друг с другом.
Таким образом, при конструировании экспрессирующего трансгена необходимо учитывать целый комплекс возникающих проблем, число которых значительно увеличивается в зависимости от строения получаемого белка и его влияния на организм. Можно предположить, что неудачные попытки по трансгенезу (эписомное встраивание, отсутствие передачи трансгена в поколениях, перестройки и делеции участка интеграции плазмидной ДНК и др.), предпринятые в последние 10—15 лет по трансфекции куриных первичных эмбриональных клеток (бластодермальных и ППК), связаны с несовершенством и несовместимостью с геном реципиента используемых генных конструкций. Несомненный прогресс, достигнутый в изучении регуляции активности и экспрессии генов, в том числе благодаря трансгенным технологиям, вновь стимулировал интерес к куриным первичным эмбриональным культурам — наиболее привлекательным с экономической и исследовательской точек зрения объектам трансгенеза животного происхождения. Так, подбор специфичных регуляторных участков промотора позволил недавно получить экспрессию в половой линии кур путем in vivo трансфекции ДНК-липосомного комплекса 2-дневных куриных эмбрионов [17].
КУРИНЫЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
На протяжении почти двух десятилетий проводятся исследования по получению линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) кур, выделенных из бластодиска неинкубированного куриного яйца. По аналогии с мышиными клетками предполагалось использование этой технологии для получения трансгенной птицы.
Однако, в отличие от мышиных эмбриональных стволовых линий, ЭСК кур после двух пассажей начинали дифференцироваться и приобретать вид фибробластов с очень активным ростом или погибали несмотря на использование различных фидерных клеточных линий и добавление факторов роста. Были высказаны предположения о влиянии трипсина, смены среды, недостаточной концентрации клеток и ряда других факторов в качестве сигнала к дифференциации, однако каждый из них в отдельности все же не был определяющим [16]. При этом результат часто зависел от исследователя, принимающего решение о той или иной манипуляции с клетками на основе своего большого практического опыта [18]. В то же время покрытие лунок желатином, использование линии мышиных эмбриональных фибробластов в качестве фидера и добавление или продуцирование самими стволовыми клетками определенных факторов роста являлись необходимыми компонентами культивирова-
ния ЭСК. В качестве фактора роста чаще использовался фактор ингибирования лейкемии мыши ^№), который добавляли как коммерческий препарат или в составе кондиционированной среды, полученной после культивирования линии крысиных клеток печени. Однако в наших экспериментах коммерческий LIF поддерживал культуру не более 2 пассажей, а добавление таких факторов, как основной фактор роста фибробластов и фактор стволовых клеток, используемых при культивировании ППК, приводило к остановке трансформации бластодермальных клеток в ЭСК несмотря на присутствие LIF [19]. На основании изложенного можно предположить, что LIF не является определяющим фактором роста; скорее всего, сами стволовые клетки способны нарабатывать некий поддерживающий ростовой фактор, поэтому снижение их концентрации, смена среды, разрушение трипсином могут приводить к уменьшению его содержания и, как следствие, — к дифференциации.
В 2006 г. группа исследователей из США опубликовала свои результаты о получении трансгенных химер [20]. Авторы также отмечали, что их первоначальные попытки культивирования ЭСК по стандартным методикам, описанным ранее, с использованием фидерных клеток и необходимых добавок к среде не увенчались успехом. Клетки после пассажа или погибали, или медленно делились. Поэтому авторы впервые для культивирования ЭСК попробовали использовать в качестве добавки к среде экстракт после гомогенизации 7-дневных эмбрионов кур и получили стабильный рост пассируемых клеток независимо от их количества. Однако половых трансгенных химер получить не удалось, хотя экзогенная ДНК была зафиксирована в сперме полученных химерных петухов.
Самые впечатляющие результаты получены только одной группой исследователей из США [4; 21], когда были продемонстрированы потенциальные возможности продукции МКАТ человека в яйце курицы как альтернатива технологии культуры клеток млекопитающих. Было показано, что трансгены размером от 45 до 150 тыс. пар нуклеотидов могут быть интегрированы в ЭСК. При использовании овальбуминового промотора удалось получить тканеспецифичную экспрессию до 1—3 мг белка на яйцо. Понадобилось 4 нед для получения трансфеци-рованных ЭСК и еще 4 нед для получения экспресси-рирующих трансгенных химер. Однако, как и в случае с млекопитающими, с помощью данной технологии половых химер получить не удалось. ЭСК сохраняли свою способность к данной функции не более 7 дней от начала культивирования [22]. При этом именно на 7-й день культивирования бластодермальные клетки приобретали характерный для стволовых клеток вид: небольшой размер, отсутствие жировых гранул, рост в виде плотных моно-слойных колоний на фидерном слое. Анализ срезов гонад на разных стадиях полового развития трансгенных химер не выявил наличия донорских половых клеток.
У мышей высокий уровень соматического химеризма коррелирует с половым, однако частичная стерилизация реципиентов путем облучения и удаления центральной части бластодиска (места локализации ППК) не привела к желаемым результатам. Более того, все полученные после удаления центральной части химеры оказались стерильными.
Следующая попытка получить трансгенных половых химер была основана на предположении, что различия в скорости деления культивируемых ЭСК и бластодермальных (одно деление в 24 и 1 ч соответственно) после трансплантации могут вызвать фатальное отставание первых в процессе дифференциации по сравнению с реципиент-ными ППК. Поэтому перед трансплантацией эмбрионы подвергались диапаузе путем хранения яиц при температуре 15 °С в течение нескольких дней. Однако эта мера, скорее всего, была недостаточной, и вновь были получены только соматические химеры. Действительно, у птицы бластодермальные клетки детерминируются в ППК через 18 ч после инкубации яйца, а у мышей ППК проявляются через 3 дня. Еще одно отличие от мышиных стволовых клеток было показано в отношении куриных ЭСК. При увеличении срока культивирования количество мышиных половых и соматических химер уменьшалось, тогда как выход куриных соматических химер оставался прежним даже после 200 дней культивирования ЭСК.
Кроме ЭСК в качестве источника эмбриональных клеток были использованы ППК птицы, выделенные из эмбриональной крови и зачатков гонад с использованием фидерного слоя и факторов роста.
В наших экспериментах в процессе культивирования стромальные клетки гонад были использованы в качестве фидерного слоя [19]. В течение суток они прикреплялись ко дну лунки, образуя монослой в виде фибробласто-подобных клеток, тогда как ППК сохраняли овальную форму, исходный размер и наличие гранул. Однако сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток в процессе культивирования не позволило использовать эту технологию для трансфекции ППК. В целях увеличения срока культивирования ППК мы предприняли успешные попытки культивирования на фидерном монослое клеток мышиных эмбриональных фибробластов. Данные клетки также были использованы в качестве фидерного слоя для трансфекции кровяных ППК и получения трансгенных половых химер [16]. Это была все та же группа исследователей, которой удалось получить МКАТ человека в яйце кур после трансфекции ЭСК. Следует отметить, что определенных факторов роста, продуцируемых фидерными клетками и необходимых для пролиферации и предотвращения дифференцировки ППК, пока обнаружить не удалось.
Однако, как выясняется в последнее время, использование технологии трансгенеза для производства тех или иных фармацевтических белков связано с преодолением механизма, защищающего половые клетки от генетических изменений, что сопряжено с низкими показателями интеграции плазмид. Этот механизм основан на подавлении с помощью белков Рі'ш и активности ріРНК мобильных элементов ДНК-транспозонов, вызывающих мутации в неконтролируемых участках ДНК [23]. Недавно опубликованы данные о 20-кратном увеличении числа трансфецированных клонов куриных ППК [24] с использованием интегразной системы фС31, катализирующей сайт-специфическую рекомбинацию между локусами айВ и айР, что вселяет надежду на создание путей направленного мутагенеза у птицы.
Защитные механизмы в эмбриональных клетках проявились и на уровне экспрессии интегрированных генных
конструкций. Японские исследователи инфицировали ретровирусным вектором куриные эмбрионы и получили химеры с геном иммуноглобулина человека G1 [25]. Однако высокая и стабильная экспрессия экзогенного белка (более 5 мг/мл в белке яйца) была зафиксирована у особей в том случае, если инфекция проводилась через 50—55 ч инкубации яйца, и не определялась, если инъекция вектора осуществлялась в эмбрион неинкубиро-ванного яйца, хотя интеграция чужеродного белка у этих химер была показана. В результате скрещивания трансгенного петуха с нетрансгенной курицей число трансгенных потомков поколения Fi составило только 3,3%, а уровень экспрессии снизился до 0,2—1,5 мг/мл в белке яйца. Авторы предположили, что такой низкий процент трансгенных потомков связан с эмбриональной смертностью вследствие высокого уровня экспрессии экзогенного белка, который обеспечивает Р-актиновый промотор. В то же время дальнейшее снижение уровня продукции иммуноглобулина человека в поколении G2, вероятно, уже связано с регуляцией супрессии трансгена на уровне процессов развития половых клеток. Аналогичные явления наблюдались при получении трансгенных животных методом микроинъекции [26].
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКОВ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК
Впервые интернализация экзогенной ДНК сперматозоидами млекопитающих была показана группой B. G. Brackett [27] в 1971 г. Однако следующие работы в этом направлении появились только в 1989 г. [28], и с тех пор им уделяется пристальное внимание, так как трансгенез с использованием сперматозоидов не нуждается в больших финансовых затратах. За последние 20 лет использование спермиев в качестве векторов для переноса генных конструкций успешно осуществлено на рыбах [29], земноводных [30], птицах [31], млекопитающих [32]. Число сообщений об удачных попытках интеграции экзогенной ДНК и ее наследования в поколениях трансгенных животных неуклонно растет [33—36].
В настоящее время изучены молекулярные механизмы двух этапов в процессе передачи трансгена с использованием спермы: 1) присоединение экзогенной ДНК к мембране сперматозоида и ее интернализация; 2) доставка указанной ДНК к овоциту в момент оплодотворения [37].
Дальнейшая судьба доставленной ДНК представляется в виде двух вариантов: или она интегрируется в геном хозяина, или остается как структура вне хромосом. Оказалось, что липосомы, переносчики (МКАТ, диме-тилсульфоксид и др.) [38; 39], электропорация, микроинъекция комплекса ДНК с липосомами значительно повышают эффективность хромосомного встраивания плазмид. В то же время при инкубации экзогенной ДНК со сперматозоидом чаще всего встречается эписомное встраивание, и трансген не передается следующему поколению [40]. Положительно заряженные липосомы взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот, образуя положительно заряженный комплекс, который ассоциирует с отрицательно заряженной клеточной мембраной и способствует процессу интернализации плазмидной ДНК. При опосредо-
ванном переносе, в отличие от инкубации, не выявлены такие факты, как полное отсутствие встраивания ДНК в части экспериментов или зависимость эффективности встраивания плазмиды от индивидуальных производителей. Однако при сравнении 8 различных видов коммерческих липосом только два из них (DMRIE-C и SuperFect) были способны встраивать экзогенную ДНК при инъекции в семенники крыс [41]. При этом трансгенные цыплята были получены с использованием липофектанта DOTAP [42], а в наших экспериментах — с помощью липофектанта Lipofectine (неопубликованные данные) были зафиксированы куриные эмбрионы, у которых при полимеразной цепной реакции определялся ген ГКСФ-ч.
В литературе нам не встречались работы по инкубации плазмид со спермой петуха; наши попытки проведения подобных экспериментов с упомянутой выше плазмидой не привели к положительным результатам (неопубликованные данные). Возможно, что выявленные различия по характеру взаимодействий экзогенной ДНК со спермой при ее прямой инкубации и опосредованном переносе и последствия этих событий регулируются разными молекулярными механизмами. В этой связи интересны данные, подтверждающие наличие активности эндогенной обратной транскриптазы в мышиных сперматозоидах [43], которая участвует в процессе оплодотворения.
Вопрос о возможной аналогии процессов, происходящих при трансгенезе с использованием сперматозоидов, и активности обратной транскриптазы, использующей экзогенную РНК в качестве субстрата, был решен положительно. Действительно, после инкубации спермы с вектором РНК белка Р-галактозидазы были получены мозаичные потомки Fo и F1 [44]; более того, в последующих экспериментах замена экзогенной РНК на ДНК привела к аналогичным результатам [45]. Выявлены некоторые общие черты характера встраивания чужеродных последовательностей, например такие, как не более одной копии на геном, мозаичное распределение, существование и передача по наследству в неинтегрированной внехро-мосомной структуре, а также возможность хромосомной интеграции для очень небольшой части сперматозоидов. Однако механизм копирования и распространения этих внехромосомных структур до сих пор не выяснен.
Таким образом, можно предположить, что оба эти процесса (трансгенез, опосредованный спермой, и активность эндогенной обратной транскриптазы) являются частью общей системы, которая последовательно регулирует экспрессию и наследование генов; при этом, возможно, ретроэлементы играют не последнюю роль, тем более что их доля в геномной последовательности человека составляет 45%, а мышиной — 37% [46].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Возрастающие потребности медицины во все большем количестве рекомбинантных фармацевтических белков стимулировали развитие альтернативных систем для их производства, в том числе использование трансгенных животных в качестве биовекторов. Трансгенные птицы представляют особый интерес, обладая рядом преимуществ по сравнению с такими продуцентами, как овцы, козы, кролики, коровы, секретирующими экзо-
генный белок в молоко. Так как период получения терапевтических протеинов в белке яйца курицы от момента трансфекции значительно короче, а процедура получения потомков проще и дешевле, возможны получение токсичных для млекопитающих препаратов, более приближенный к человеческому профиль гликозилирования белков, стерильность продукта, сниженная иммуноген-ность и стабильность белков, высокий выход экзогенного белка.
Среди наиболее перспективных методов выведения трансгенной птицы в настоящее время выделяют технологии культивирования эмбриональных клеток и использование сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК. Однако в культивируемых эмбриональных клетках были обнаружены молекулярные механизмы, защищающие геном от интеграции и экспрессии чужеродных генов, на преодоление которых направляются усилия генных инженеров. В сперматозоидах, наоборот, существуют эндогенные механизмы встраивания экзогенной ДНК, но чаще не в хромосому, а в виде эписом. Необходимо отметить, что эти исследования не только были направлены на разработку эффективных технологий трансгенеза, но и внесли свой вклад в вопрос изучения механизмов регулирования экспрессии и наследования генов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ma S., Jevnikar A. M. Transgenic rise for allergy immunotherapy // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2003. — Уо1. 23. — P. 559—565.
2. Houdebine L. M. The methods to generate transgenic animals and to control transgene expression // J. Biotechnol. — 2002. — Vol. 98. — P. 145—160.
3. Создание трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор / Прокофьев М. И., Городецкий С. И., Мезина М. Н., Юткин Е. В., Ко-соруков В. С., Букреев Ю. М., Антипова Т. А., Пинюгина М. В., Карелина Т. К., Звездин А. В., Краевой С. А. // Сельскохозяйственная биология. — 2003. — № 6. — C. 49—54.
4. Production of monoclonal antibody in eggs of chimeric chicken / Zhu L., van de Lavoir M. C., Leighton P., Albanese J., Beenhouwer D. O., Cardarelli P. M., Cuison S., Deng D. F., Deshpande S., Diamond J. H., Green L., Halk E. L., Heyer B. S., Kay R. M., Kerchner A., Leighton P. A., Mather C. M., Morrison S. L., Nikolov Z. L., Passmore D. B., Pradas-Monne A., Preston B. T., Rangan V. S., Shi M., Srinivasan M., White S. G., Winters-Digiacinto P., Wong S., Zhou W., Etches R. // Nat. Biotechnol. — 2005. — Vol. 23. — P. 1159—1169.
5. Making recombinant proteins in animals—different systems, different applications / Dyck M. K., Lacroix D., Porhier F., Sirard M. A. // Trends Biotechnol. — 2003. — Vol. 21. — P. 394—399.
6. Biosynthesis and cocoonexport of recombinant globular protein in transgenic silkworms / Royer C., Jalabert A., Da Rocha M., Grenier A. M., Mauchamp B., Couble P., Chavancy G. // Transgenic Res. — 2005. — Vol. 14. — P. 463—472.
7. Stable expression of human Growth Hormone over 50 generation in transgenic insect larvae / Markaki M., Drabek D., Livadaras I., Craig R. K. // Transgenic Res. — 2007. — Vol. 16. — P. 99—107.
8. Producing of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells / Petitte J. N., Clark M. E., Liu G., Ver-rinder Gibbins F. M., Etches R. // Development. — 1990. — Vol. 108. — P. 185—189.
9. Изучение эффективности различных способов трансфекции репортерного гена в эмбриональные клетки кур / Сураева Н. М., Бырышников А. Ю., Фисинин В. И., Прокофьев М. И. // Известия РАН. — 2008. — № 1. — С. 18—23.
10. A method to obtain avian germline chimeras using isolated primordial germ cells / Yasuda Y., Tajima A., Fujimoto T., Kuwana T. // J. Repr. Fert. — 1992. — Vol. 96. — P. 521—528.
11. Producing of germline chimeras by transfer of primordial germ
cells in the domestic chicken / Tajima A., Naito M., Yasuda Y., Kuwana T. // Theriogenology. — 1993. — Vol. 40. — P. 509—519.
12. Development of transgenic chickens expressing bacterial p-galactosidase / Mozdziak P. E., Borwornpinyo S., McCoy D. W., Petitte J. N. // Developmental Dynamics. — 2003. — Vol. 226. — P. 439—445.
13. Houndebine L. M., Attal J., Violotte J. L. Vector design for transgene expression, in Transgenic Animal Technology, Second Edition (Pinkert C. A., ed.) // Academic Press. — 2002. — P. 419—458.
14. The insulator effect of 5HS4 region from the p-globin chicken locus on the rabbit WAP gene promoter activity in transgenic mice / Ri-val-Gervier S., Pantano T., Viglietta C., Maeder C., Prince S., Attal J., Jolivet G., Houndebine L. M. // Transgenic Res. — 2003. — Vol. 12. — P. 723—730.
15. Association of the 5'HS4 sequence of the chicken beta-globin locus control region with human EF1 alpha gene promoter induces ubiquitous and high expression of human CD55 and CD59 cDNAs in transgenic rabbits / Taboit-Dameron F., Malassagne B., Viglietta C., Puissant C., Leroux-Coyau M., Chereau C., Attal J., Weill B., Houndebine L. M. // Transgenic Res. — 1999. — Vol. 8. — P. 223—235.
16. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells / van de Lavoir M. C., Diamond J. H., Leighton P. A., Mather-Love C., Heyer B. S., Bradshaw R., Kerchner A., Hooi L. T., Gessaro T., Swanberg S., Delany M. E., Etches R. // Nature. — 2006. — Vol. 441. — P. 766—769.
17. Minematsu T., Harumi T., Naito M. Germ cell-specific expression of GFP gene induced by chicken vasa homologue (Cvh) promoter in early chicken embryos // Mol. Reprod. Dev. — 2008. — Vol. 75, N 10. — P. 1515—1522.
18. Van de Lavoir M. C. and Mather-Love C. Avain embryonic stem cells // Methods in enzymology. — 2006. — Vol. 418. — P. 38—64.
19. Получение, характеристика и долгосрочное культивирование примордиальных половых и бластодермальных клеток кур / Сураева Н. М., Воротеляк Е. А., Прокофьев М. И., Самойлов А. В., Васильев А. В., Барышников А. Ю. // Доклады РАН. — 2008. — Т. 423, № 3. — C. 408—410.
20. Progress toward the culture and transformation of chicken blastodermal cells / Wang Y., Brooks C. F., Jones S. A., Olliff L. K., Morgan M., Speksnijder G. L., Foley C., Harvey A. J. // Stem Cells. — 2006. — Vol. 24. — P. 1638—1645.
21. High-grade transgenic somatic chimeras from chicken embryonic stem cells / Van de Lavoir M. C., Mather-Love C., Leighton P., Diamond J. H., Heyer B. S., Roberts R., Zhu L., Winters-Digiacinto P., Kerchner A., Gessaro T., Swanberg S., Delany M. E., Etches R. // Mechanisms of Development. — 2006. — Vol. 123. — P. 31—41.
22. Long-term culture and characterization of avian embryonic stem cells with morphogenetic potentialities / Pain B., Clark M., Shen M., Na-kazawa H., Sakurai M., Samarut J., Etches R. // Development. — 1996. — Vol. 122. — P. 2339—2348.
23. O'Donnell K. A., Boeke J. D. Mighty Piwis defend the germline against genome intruders // Cells. — 2007. — Vol. 129. — P. 37—44.
24. Genetic modification of primordial germ cells by gene trapping, gene targeting, and фС31 integrase / Leighton P. A., van de Lavoir M. C., Diamond J. H., Xia C., Etches R. // Mol. Reprod. Dev. — 2008. — Vol. 75. — P. 1163—1175.
25. High-level expression of single-chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated chickens by using a retroviral vector / Kamihira M., Ono K., Esaka K., Nishijima K., Kiga-ki R., Komatsu H., Yamashita T., Kyogoku K., Iijima S. // J. Virology. — 2005. — Vol. 79, N 17. — P. 10 864—10 874.
26. Multiple effects of genetic background on variegated transgene expression in mice / Opsahi M. L., McClenaghan M., Springbett A., Reid S., Lathe R., Colman A., Whitelaw C. B. // Genetics. — 2002. — Vol. 160. — P. 1107—1112.
27. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization / Brackett B. G., Barabska W., Sa-wicki W., Koprouski H. // Proc. Natl. Acad. USA. — 1971. — Vol. 68. — P. 353—357.
28. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice / Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V. M., Dolci S., Farace M. G., Spadafora C. // Cell. — 1989. — Vol. 57. — P. 717—723.
29. Khoo Y. W. Sperm-mediated gene transfer studies on zebrafish in Singapore // Mol. Reprod. Dev. — 2000. — Vol. 75. — P. 278—280.
30. Jonak J. Sperm-mediated preparation of transgenic Xenopus lae-vis and transgenic DNA to the next generation // Mol. Reprod. Dev. — 2000. — Vol. 56. — P. 298—300.
31. Nakanishi A., Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods // Mol. Reprod. Dev. — 1993. — Vol. 36. — P. 258—261.
32. Sperm-mediated gene transfer: Production of pigs transgenic for a human regulator of complement activation / Lavitrano M., Forni M., Varzi V., Pucci L., Bacci M. L., Di S. C., Fioretti D., Zoraqi G., Moiolo B., Rossi M., Lazzereschi D., Stoppacciaro A., Seren E., Alfani D., Cortesi-ni R., Frati L. // Transplant. Proc. — 1997. — Vol. 29. — P. 3508—3509.
33. Production of transgenic rats and mice by the testis-mediated gene transfer / Chang K. T., Ikeda A., Hayashi K., Furuhata Y., Nishi-hara M., Ohta A., Ogawa S., Takahashi M. // J. Reprod. Dev. — 1999. — Vol. 45. — P. 29—36.
34. Transient transmission of a transgene in mouse offspring following in vivo transfection of male germ cells / Celebi C., Auvray P., Benveg-nu T., Plusquellec D., Jegou B., Guillaudeux T. // Mol. Reprod. Dev. — 2002. — Vol. 62. — P. 477—482.
35. A novel method to transfer gene in vivo system / He X., Qi B., Liu G., Yu W., Chen Q. // Prog. Biochem. Biophys. — 2006. — Vol. 33. — P. 685—690.
36. Use of sperm plasmid DNA lipofection combined with REMI (restriction enzyme-mediated insertion) for production of transgenic chickens expressing eGFP (enhanced green fluorescent protein) or human follicle-stimulating hormone / Harel-Markowitz E., Gurevich M., Shore L. S., Katz A., Stram Y., Shemesh M. // J. Biol. Reprod. — 2009. — Vol. 80, N 5. — P. 1046—1052.
37. The interaction of sperm cells with exogenous DNA: A role of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules / Lavitra-no M., Maione B., Forte E., Francolini M., Sperandio S., Testi R., Spadafora C. // Exp. Cell Res. — 1997. — Vol. 233. — P. 56—62.
38. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer / Chang K., Qian J., Jiang M. S., Liu Y. H., Wu M. C., Chen C. D., Lai C. K., Lo H. L., Hsiao C. T., Brown L., Bo-
len J., Huang H. I., Ho P. Y., Shih P. Y., Yao C. W., Lin W. J., Chen C. H., Wu F. Y., Lin Y. J., Xu J., Wang K. // BMC Biotechnol. — 2002. — Vol. 2. — P. 5—10.
39. Expression of porcine growth hormone gene in transgenic rabbits as reported by green fluorescent protein / Wang Y. J., Lin A. X., Zhang Z. C., Chen Y. E. // Anim. Biotechnol. — 2001. — Vol. 12. — P. 101—110.
40. Wu Z., Li Z., Yang J. Transient transgene transmission to piglets by intrauterine insemination of spermatozoa incubated with DNA fragments // Mol. Reprod. Dev. — 2008. — Vol. 75. — P. 26—32.
41. Detection of transgenic in progeny at different developmental stages following testis-mediated gene transfer / Yonezawa T., Furuhata Y., Hirabayashi K., Suzuki M., Takahashi M., Nishihara M. // Mol. Reprod. Dev. — 2001. — Vol. 60. — P. 196—201.
42. Cock spermatozoa serve as the gene vector for generation of transgenic chicken (Gallus gallus) / Yang C. C., Chang H. S., Lin C. J., Hsu C. C., Cheung J. I., Hwu L., Cheng W. T. K. // Asian-Aust. J. Anim. — 2004. — Vol. 17, N 7. — P. 885—891.
43. Reverse transcriptase activity in mature spermatozoa of mouse / Glordano R., Magnano A. R., Zaccagnini G., Pittoggi C. // J. Cell Biol. — 2000. — Vol. 148. — P. 1107—1113.
44. Sperm endogenous reverse transcriptase as mediator of new genetic information / Sciamanna I., Barbei L., Martire A., Pittogi C., Be-raidi R., Giordano R., Magnano A. R., Hogdson C., Spadafora C. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. — Vol. 312. — P. 1039—1046.
45. Generation of biologically active retro-genes upon interaction of mouse spermatozoa with exogenous DNA / Pittoggi C., Beraldi R., Sciamanna I., Barberi L., Giordano R., Magnano A. R., Torosantucci L., Pescarmo-na E., Spadafora C. // Mol. Reprod. Dev. — 2006. — Vol. 73. — P. 1239—1246.
46. Mobile elements and mammalian genome avolution / Deini-nger P. L., Moran J. V., Baizer M. A., Kazazian H. H. // Cur. Opin. Genet. Dev. — 2003. — Vol. 13. — P. 651—658.
Поступила 20.04.2009
Natalia Mikhailovna Surayeva1, Artem Vladimirovich Samoilov2
PRODUCTION OF PHARMACEUTICAL PROTEINS USING TRANSGENIC POULTRY
1 PhD, DSc, Scientific Secretary, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478)
2 Postgraduate Student, Fur Animal and Rabbit Breeding Research Institute, RAAS (6, ul. Trudovaya, p. Rodniki, Ramensky Community, Moscow Region, Russian Federation, 140143)
Address for correspondence: Surayeva Natalia Mikhailovna, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478)
e-mail: nsuraeva@yandex.ru
The paper addresses approaches to production of recombinant pharmaceutical proteins using prokaryotic and eukaryotic cell culture, transgenic plants and animals. As compared to mammals, transgenic poultry has certain advantage in some physiological and biochemical parameters as a bioreactor. However, effective integration and expression of foreign genes may be achieved only from a gene construction with a set of needed elements, the list of such elements being continuously growing due to new knowledge of molecular mechanisms of gene regulation. A considerable advance in poultry transgenesis is associated with transfection and transplantation of cultured embryonic stem cells. Somatic and sex transgenic chimeras have been generated that produce human protein in eggs. Another promising and more cost-effective approach of transgenic poultry production is associated with use of cock spermatozoa to transfer foreign DNA; moreover, endogenous mechanisms of exogenous DNA incorporation have been discovered. Liposomes and other vehicles such as monoclonal antibodies, DMSO and others, electroporation, microinjection of DNA complex with liposomes promote more effective chromosome incorporation of gene constructions into sperm cells.
Key words: pharmaceutical proteins, transgenesis, poultry, sperm cells, stem cells.
