CC BY
135
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПЕТУХА... 53
УДК 615.2:577.112:591.463.1
А.В. Самойлов1, В.В. Мартиросян1, АЮ. Барышников2, НМ. Сураева2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПЕТУХА В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКОВ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ГГНУНИИПЗК им. В.А. Афанасьева РАСХН, Московская обл.
2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Самойлов Артем Владимирович, старший научный сотрудник лаборатории трансгенеза Адрес: 140143, Московская обл., Раменский р-н, п. Родники, ул. Трудовая, 6; тел. +7(495)548-92-32 e-mail: als [email protected]
Статья поступила 10.12.2010., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
Цель данного исследования - разработка и совершенствование биотехнологического метода получения продуцентов фармацевтических белков человека. Трансфекцию сперматозоидов проводили плазмидой, содержащей ген Г-КСФ человека, с помощью липосом «Lipofectine®». Определены оптимальные режимы подготовки сперматозоидов петуха для трансфекции, изучены индивидуальные различия между производителями по эффективности осеменения спермой после манипуляционных воздействий, продемонстрирована интеграция гена Г-КСФ человека в куриных эмбрионах.
Ключевые слова: фармацевтические белки, Г-КСФ, трансгенез, сперматозоиды, липосомы, куриные эмбрионы.
A.V Samoilov1, V.V. Martirosian1, A. Yu. Baryshnikov2, N.M. Surayeva2 THE USAGE LINKER
OF BASED CHICKEN SPERM-MEDIATED GENE TRANSFER FOR DEVELOPMENT AND STUDY OF METHODS OF THERAPEUTIC PROTEINS PRODUCTION
Animal and Rabbit Breeding Research Institute ofRAAS, Moscow Region
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
The aim of this study was to develop and to modify the biotechnological methods of pharmaceutical proteins livestock production. The transfection of sperm with human G-CSF gene was carried out with Liposomes «Lipofectine®». The parameters of the optimal chicken sperm transfection have been determined. We have studied the efficiency of sperm insemination after manipulations due to individual differences between producers. Here, we also demonstrate the integration of human GM-CSF gene in chicken embryos.
Key words: pharmaceutical proteins, GM-CSF, transgenesis, sperm cells, liposomes, chicken embryos.
Введение
Разработка технологии введения чужеродного гена путем переноса со спермой открывает широкие возможности по использованию яйца кур для продукции фармацевтических белков. К преимуществам использования трансгенной птицы по сравнению с известными технологиями получения таких белков относятся:
1) потенциальные возможности широко-масшабного производства за счет быстрого размножения исходных трансгенных особей,
2) высокий уровень экспрессии экзогенных белков и их правильное гликозилирова-ние и пострансляционные модификации в организме трансгенных кур,
3) низкая стоимость производства [2].
На рынке продуцентов лекарственных препаратов трансгенная птица получена только в нескольких лабораториях США и Великобритании, результаты исследований запатентованы.
Однако необходимо отметить, что большинство трансгенных продуцентов с высоким титром лекарственных белков были получены с использо-
ванием вирусных конструкций плазмид [5]. Таким образом, не исключен возможный риск нежелательной активации определенных генов организма, в том числе и онкогенов, в случае попадания вирусного агента вместе с экзогенным белком.
При разработке методов получения трансгенной птицы с использованием опосредованного переноса невирусных плазмид с помощью сперматозоидов было показано, что различные связывающие агенты (липосомы, МКА) значительно повышают эффективность хромосомного встраивания экзогенной ДНК [3; 4; 7].
Для успешного трансгенеза важно также подобрать оптимальные условия подготовки спермы для трансфекции и изучить индивидуальные различия производителей по эффективности осеменения после проведения манипуляционных воздействий. Такие исследования до настоящего времени не проводились.
Целью настоящего исследования являлось изучение комплекса вопросов, связанных с разработкой и усовершенствованием биотехнологических методов генетической трансформации птицы с помощью опосредованного переноса чужеродной ДНК с использованием сперматозоидов.
Материалы и методы
В опытах использовали кур кросса «Радонеж» и кросса «Птичное». Для получения спермы использован метод одновременного ручного массажа поясничной части спины и брюшной стенки в направлении к хвосту.
Оценка качества спермы
Для дальнейшей работы отобраны петухи с со спермой нормального молочно-белого или слегка желтоватого цвета, сливкообразной консистенции, без хлопьев; концентрация спермиев 4-5 млрд в 1 мл; активность спермиев не ниже 7 баллов (активность и подвижность спермиев определяли по числу сперматозоидов, имеющих поступательнопрямолинейное движение).
Сперматозоиды отмывали от семенной жидкости путем двух-трехкратного центрифугирования (220 или 450 g, 5 мин).
В работе использовали конструкцию вектора pIRES (Clontech, США). Данный вектор предназначен для экспрессии в эукариотических клетках, содержал CMV-промотор и эукариотический селективный ген устойчивости к неомицину/канамицину. В полилинкер вектора pIRES EGFP2 был проклони-рован ген Г-КСФ человека, любезно предоставленный С.И. Городецким (ИМБ РАН), по сайтам рестрикции BamHI-EcoRl. Размер исходной генной конструкции составил 6585 пар оснований.
Плазмидную ДНК в количестве 40 мкг растворяли в 250 мкл среды OPTI-MEM («Invitrogen», США), добавляли 40 мкл «Lipofectin®» («Invitrogen», США) и инкубировали 40 мин при комнатной температуре. Одновременно готовили смесь рестриктазы SalI с липофектином на среде OPTI-MEM; для этого 150 ед. (4 мкл) рестриктазы смешивали со 150 мкл среды OPTI-MEM и добавляли 40 мкл «Lipofectine®», смесь также инкубировали 40 мин. Смешивали растворы ДНК и рестриктазы, добавляли к осевшим сперматозоидам после второго центрифугирования, перемешивали и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. В опытах была использована смешанная сперма от 3 петухов.
Осеменение кур
Осеменение производилось с применением шприца с укороченным катетером, который вводился в яйцепровод на глубину 4-5 см с последующим впрыскиванием дозы спермы. После осеменения проводили сбор яиц, инкубировали 7 суток, извлекали эмбрионы и анализировали методом ПЦР. Эмбрионы гомогенизировали с 500 мкл PBS (ООО «НПО ПанЭко», Россия, Москва) и отбирали 100 мкл гомогенизата для выделения ДНК.
ДНК из гомогенизата выделяли с помощью наборов «Универсальной пробоподготовки» (ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия, Москва). Выделенную ДНК либо сразу использовали для постановки ПЦР, либо хранили при температуре -20 °С.
ПЦР проводилась с применением наборов для постановки пЦр GenPak® PCR Core (ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия, Москва). На основании генетической карты плазмиды pIRES2 с помощью компьютерной программы Vector NTI 9.0.0. были подобраны праймеры для проведения ПЦР-анализа. Для определения наличия гена ГКСФ человека были подобраны следующие праймеры, кодирующие участок гена в 730 пар олигонуклиотидов:
Gcsf-dir 5' CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG 3'
Gcsf-rev 5' GCC TGC AGG AGC CCC TGG TAG AGG 3';
Для определения наличия CMV-промотора были подобраны следующие праймеры, кодирующие участок гена в 305 пар олигонуклиотидов:
CMV-dir 5'GCC AAG TAC GCC CCC TAT TGA CG 3' СMV-rev 5'CGT ACA CGC CTA CCG CCC ATT TGC 3'
Синтез праймеров осуществлялся ООО «Си-бЭнзим-М», (Россия, Новосибирск).
Результаты и обсуждение
Необходимым этапом при получении трансгенной птицы является использование унифицированных образцов спермы хорошего качества. В птицеводстве с этой целью используются среды-разбавители, позволяющие сохранить свойства спермы и получать разбавленные дозы спермы одной концентрации. Нами был выбран разбавитель, разработанный и произведенный на базе НИИ Птицеводства. Показано, что основные показатели разбавленной спермы сохраняются при комнатной температуре в течение 5 час. после получения биоматериала, и даже после суточного хранения. Аналогичные показатели отмечались нами и при использовании в качестве разбавителя среды ОPTI-MEM. Оказалось, что сразу же после эякуляции у сперматозоидов из-за разницы температуры тела и окружающей среды, возникает температурный шок, проявляющийся в виде снижения подвижности, который не влиял на оплодотворяющую способность спермы. С целью удаления семенной жидкости из образцов семени нами были оценены два режима центрифугирования - при 220 и 450 g на протяжении 5 мин. - с последующим разбавлением сперматозоидов после их осаждения разбавителем, а также подобран количественный состав сперматозоидов, удовлетворяющий условия проведения экспериментов. Наилучшие показатели по осеменению кур были получены в случае однократного и трехкратного центрифугирования спермы при 220 g на протяжении 5 мин. в дозе 500 млн., что дало 82 и 50 % оплодотворенных яиц соответственно. Далее нами изучены индивидуальные различия способности к осеменению спермы петухов после трехкратного центрифугирования сперматозоидов.
Существенных различий между производителями выявлено не было. Процент оплодотворенных яиц варьировал 36-40. Однако при осеменении кур смешанной спермой этот показатель был выше (63%), поэтому в дальнейших экспериментах использовалась смешанная сперма от трех производителей. Необходимо отметить, что в современном птицеводстве при проведении искусственного осеменения куриц также применяется смешанная сперма [1]. Также были изучены индивидуальные различия куриц по их способности к эффективному осеменению. Куриц осеменяли смешанной спермой в дозе 500 млн. сперматозоидов при трехкратном центрифугировании при 220 g. Для участия в дальнейших экспериментах по трансгенезу, нами были отобраны курицы, которые откладывали 81, 62 и 52% оплодотворенных яиц, что являлось выше среднего показателя
Таким образом, нами впервые изучены индивидуальные различия производителей по эффективности осеменения после проведения манипуляционных воздействий, связанных с подготовкой сперматозоидов к трансфекции, и отобраны петухи и курицы для дальнейших экспериментов по трансгенезу.
Известно, что у мышей и свиней при инкубации экзогенной ДНК со сперматозоидами чаще всего встречалось эписомное встраивание, отсутствие встраивания или трансген не передавался следующему поколению [6; 8].
Показатель п объектов Процент от числа
Снесенных яиц Полученных эмбрионов
Получено яиц 51 100
Получено эмбрионов 29 57 100
|| В том числе: |
Развились нормально 29 57 100
Из них трансгенных 1 2,0 3,4
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Возможно, что выявленные различия в характере взаимодействий экзогенной ДНК при ее непосредственной инкубации со спермой и опосредованном переносе, а также и дальнейшие последствия этих событий регулируются разными молекулярными механизмами.
В литературных источниках нам не встречались работы по инкубации плазмид со спермой петуха без опосредованного переноса. В наших экспериментах на птице также не удалось зафиксировать интеграцию ДНК этим методом, т.к. после осеменения трех куриц спермой, инкубированной в присутствии плазмидной ДНК, и содержащей ген Г-КСФ человека без использования липосом, было собрано 18 яиц, получено 12 эмбрионов, ни один из которых не был трансгенным.
В связи с опубликованными данными о положительном влиянии липосом на процесс связывания ДНК со сперматозоидами [4; 7] нами изучен препарат на основе липосом - «Ьіроїесііпе®» (ІпуЩ^еп). Ранее на примере инъекции в семенники крыс было показано, что не любой коммерческий препарат комплексов липосом с геном способен встраивать экзогенную ДНК [8]. Нами выбран препарат «ЬіроГесОпе®» (Іпуі-йг^еп), который еще не был изучен при трансгенезе птицы. Проведено семь осеменений куриц трансфе-цированной спермой с тестированием семисуточных эмбрионов на присутствие чужеродного гена. Было собрано 51 яйцо, из которых получено 29 эмбрионов, один из которых оказался трансгенным (табл., рис., трек № 6). При этом длина гибридизируемого фрагмента гена соответствовала ожидаемой.
Таблица
Получение трансгенных эмбрионов после осеменения кур спермой петухов, трансфецированной геном Г-КСФ
Рис. ПЦР-анализ ДНК эмбрионов птицы:
1 - положительный контроль - плазмида с ч-Г-КСФ;
2-10 - ДНК эмбрионов, полученных в результате эксперимента;
11; 12 - отрицательные контроли нетрансгенных куриц;
13 - отрицательный контроль выделения ДНК.
Выводы
Оптимальным способом отделения сперматозоидов петуха от семенной жидкости является центрифугирование эякулята при 220 g в течение 5 мин. Оптимальное число сперматозоидов, используемых для трансфекции чужеродным геном, составляет 500 млн. на дозу. Наблюдаются значительные индивидуальные различия между курицами по эффективности осеменения спермой после манипуляционных воздействий. Процент оплодотворенных яйц составил в среднем 47 % с колебаниями от 19 до 81 % у отдельных особей.
3. Методом ПЦР продемонстрирована интеграция гена ГКСФ человека у куриных эмбрионов.
Авторы статьи выражают искреннюю благодарность фирме ООО «Биолайн Фармторг», в лице Генерального директора Тищенко А.Н., за всестороннюю поддержку при проведении исследований.
Литература
1. Давтян А.Д. Воспроизводство и искусственное осеменение сельскохозяйственной птицы. - Сергиев Посад: ВНИТИП, 1999. - 240 с.
2. Сураева НМ, Самойлов А.В. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы // Вестник РОНЦ. - 2009. - №4. - С. 19-25.
3. Chang K., Qian J, Jiang M.S. et al. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer // BMC Biotechnol. - 2002. - 2. - P. 5-10.
4. Harel-Markowitz E., Gurevich M., Shore L.S. et al. Use of sperm plasmid DNA lipofection combined with REMI (restriction enzyme-mediated insertion) for production of transgenic chickens expressing eGFP (enhanced green fluorescent protein) or human follicle-stimulating hormone // Biol.Reprod. 2009. - 80(5). - P. 1046-52.
5. Kamihira M., Ono K., Esaka K. et al. High-level expression of single-chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated chickens by using a retroviral vector // J. Virology. - 2005. -79(17). - P. 10864-74.
6. Wu Z, Li Z., Yang J. Transient transgene transmission to piglets by intrauterine insemination of spermatozoa incubated with DNA fragments // Mol. Repr. Dev. - 2008. - 75. - P. 26-32.
7. Yang C.C, ChangH.S., Lin C.J. et al. Cock spermatozoa serve as the gene vector for generation of transgenic chicken (Gallus gallus) // Asian-Aust. J. Anim. - 2004. - 17(7) - P. 885-91.
8. Yonezawa T., Furuhata Y, Hirabayashi K. et al. Detection of transgenic in progeny at different developmental stages following testis-mediated gene transfer // Mol. Repr. Dev. - 2001. - 60. - P. 196-201.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ НМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
