CC BY
87
уДК 636: 57.089.3: 606
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА IN VITRO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕРМЫ, РАЗДЕЛЕННОЙ ПО ПОЛУ
Г.Н. СИНГИНА, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории (e-mail: g_singina@mail.ru)
Т.Е. ТАРАДАйНИК, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Е.Н. ШЕДОВА, научный сотрудник С.С. ДАНЧ, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник
Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. Использование in vitro эмбрионов известного пола для разведенияживотных способно существенным образом повысить рентабельность молочного и мясного скотоводства. Однако требуется детализация отдельных этапов технологии их получения. Мы провели исследование эмбрионального развития ооцитов коров in vitro в зависимости от способа подготовки спермы и присутствия гепарина в среде осеменения. Ооцит-кумулюсные комплексы выделяли из яичников коров и телок после их убоя и культивировали в течение 24 ч группами по 25-40 шт. в среде ТС199. Соломинки с замороженной спермой (разделенной и не разделенной по полу) размораживали и обрабатывали двумя способами: методом «swim-up» и центрифугированием в градиенте плотности перколла. Созревшие ооциты культивировали совместно оо сперматозоидами в среде Fert-Talp, содержащей 10 или 2 мкг/мл гепарина (только при оплодотворении спермой, разделенной по полу), в течение 18 ч, после чего их переносили в эмбриональную среду и культивировали до стадии бластоцисты. Было обнаружено, что доля дробления и развития бластоцист при использовании сексиро-ванного семени были ниже, чем при использовании обычного семени (57,2 ± 3,4 и 22,3 ± 2,3% против 75,9 ± 2,3 и 37,8 ± 2,1% соответственно). В обоих случаях результат зависел от способа подготовки спермы к оплодотворению. Обычное семя лучше сохраняло свою жизнеспособность при использовании метода «swim-up». Для спермы, разделенной по полу, оптимальным было центрифугирование в градиенте плотности перколла. Снижение концентрации гепарина в среде оплодотворения уменьшало долю дробления ооцитов, осемененных спермой, разделенной по полу, но не влияло на их способность кдальнейшему эмбриональному развитию. Рекомендовано использовать градиент плотности перколла при работе со спермой, разделенной по полу, для получения фракции активных сперматозоидов. Ключевые слова: оплодотворение in vitro; эмбрионы; сперма, разделенная по полу.
Для цитирования: Оценка эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro с использованием спермы, разделенной по полу/Г.Н. Сингина, Т.Е. Тарадайник, Е.Н. Шедова, С.С. Данч //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 12. С. 95-97.
Хорошо известно, что в молочном скотоводстве продуктивны только самки. Поэтому соотношение полов 50:50, имеющее место при естественном воспроизводстве, серьезным образом снижает прибыль данной индустрии по всему миру. Аналогичная ситуация наблюдается и в мясном скотоводстве, где выгоднее выращивать бычков.
Изобретение проточной цитометрии и использование ДНК в качестве маркерадля отбора спермы сделали возможность разведения животных нужного пола реальностью. При помощи проточной цитометрии можно обнаружить небольшую разницу в ДНК между X- и Y-сперматозоидами и разделить их по полу. При этом точность сортировки, в частности, у крупного рогатого скота выше 90% [1].
Тем не менее, коммерческие компании, реализующие разделенную по полу сперму, предупреждают пользователей о возможности снижения результативности искусствен-
ного осеменения при ее использовании, по сравнению с использованием обычного семени (чаще всего из-за низкой концентрации сперматозоидов в дозе), и рекомендуют для достижения оптимального результата осеменять только телок. Поэтому во многих странах в молочном и мясном скотоводстве потенциальной альтернативой искусственному осеменению, которая позволяет повысить эффективность использования разделенной по полу спермы, служит оплодотворение вне организма (оплодотворение in vitro) [2].
Для процедуры оплодотворения in vitro используют как ооциты, выделенные из яичников животных после их убоя [3-4], так и ооциты, аспирированные из ан-тральных фолликулов живых животных [5]. Полученные эмбрионы культивируют до стадии бластоцисты, после чего они либо свежими пересаживаются животным-реципиентам, либо замораживаются и хранятся в жидком азоте при -196°С до использования.
Первый теленок после трансплантации эмбрионов, развившихся in vitro с использованием спермы, разделенной по полу, родился в 1993 г. [6]. Частота наступления стельности в этом случае была невысокой (33%), несмотря на то, что на каждого реципиента приходилось по два эмбриона. За последние годы эффективность технологии существенно повысилась, однако, в большинстве случаев, жизнеспособность in vitro эмбрионов, полученных с использованием семени, разделенного по полу, ниже, чем полученных с использованием обычного семени [2, 4].
Одной из основных причин снижения качества эмбрионов, развившихся in vitro после оплодотворения ооцитов коров спермой, разделенной по полу, служит то, что в процессе сортировки она подвергается воздействиям, которые влияют на целостность сперматозоидов, а также на их цитоскелет и морфологию [7]. Кроме того, качество спермы ухудшается и в процессе ее последующей крио-консервации [8]. Поэтому среди подходов, призванных повысить эффективность технологии, особое место занимает поиск факторов, повышающих оплодотворяющую способность сперматозоидов in vitro.
Цель нашего исследования заключалась в оптимизации условий подготовки разделенной по полу спермы быков к экстракорпоральному оплодотворению и оценке влияния гепарина в среде осеменения на эмбриональное развитие ооцитов коров in vitro.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории экспериментальной эмбриологии ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Применительно ко всем экспериментам, источником женских половых клеток служили яичники коров и телок (вне зависимости от породной принадлежности), отобранные после убоя и доставленные в лабораторию в течение 4-5 ч при 30-35°С. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) выделяли методом рассечения видимых фолликулов и промывали 3 раза в среде ТС-199, содержащей 5% феталь-ной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл гепарина, 0,2 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Для экспериментов отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные компактным кумулюсом. Культивирование ОКК осуществляли группами по 25-40 ооцитов в 500 мкл модифицированной среды ТС-199 [9] под слоем легкого минерального масла. Через 24 ч культивирования созревшие яйцеклетки пере-
носили в среду оплодотворения Fert-TALP, содержащую 10 мкг/мл гепарина и PHE (20 мкМ пенициламина, 10 мкМ гипотаурина и 1 мкМ эпинефрина) куда также добавлялась предварительно подготовленная сперма. Через 18-20 ч совместного культивирования ооциты отмывали от сперматозоидов и клеток кумулюса и переносили в среду CRaa [12] для развития эмбрионов. Долю дробления и развития ооцитов до стадии бластоцисты оценивали на 2-й и 7-й дни культивирования соответственно. Созревание, оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов происходило в условиях инкубатора при 39°С и 5% СО2 в воздухе.
В целом в экспериментах использовали два вида спермы: разделенная и не разделенная по полу. Соломинки с замороженной спермой размораживали в водяной бане при 37°С в течение 12 с. Использовали два различных способа подготовки спермы к оплодотворению. В первом случае ее обрабатывали методом «swim-up» [10] с использованием среды Sperm-TALP, содержащей 1 мМ пирувата натрия, 6 мг/мл БСА. Данный подход рутинно применяется нами для выделения фракции активных сперматозоидов при экстракорпоральном оплодотворении яйцеклеток коров и телок [11]. Для этого содержимое соломинок подслаивали по 220 мкл в пробирки, содержащие 1 мл среды Sperm-TALP, и помещали в инкубатор на 50 мин. В конце инкубации из пробирок отбирали 750 мкл верхнего слоя супернатанта с последующим его разбавлением свежей средой и центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Полученный после центрифугирования осадок вносили в среду с ооцитами до конечной концентрации 1,5 х 106 сперматозоидов на 1 мл. Во втором случае размороженное семя наслаивали на градиент плотности, образованный 90%-ным и 45 %-ным раствором перколла (по 0,5 мл каждой концентрации в 2 мл пробирках) и центрифугировали при 600 g в течение 10 мин. Полученный осадок однократно отмывали и использовали для оплодотворения как описано выше.
Эксперименты проводили в два этапа. На первом этапе была оценена эффективность двух различных способов подготовки спермы быков к оплодотворению («swim-up» и фракционирование в градиенте перколла) при получении эмбрионов in vitro. Оба метода использовали применительно как к разделенной так и не разделенной по полу сперме. Всего в четырех экспериментальных группах было использовано 433 ооцита.
На втором этапе в экспериментах участвовала только разделенная по полу сперма быков. Оценивали эмбриональное развитие ооцитов in vitro в зависимости от концентрации гепарина (10 и 2 мкг/мл) в среде их оплодотворения. Всего в двух экспериментальных группах использовали 221 ооцит.
Таблица 1. влияние способа подготовки разделенной и не разделенной по полу спермы быков на последующее оплодотворение и эмбриональное развитие яйцеклеток коров in vitro
Способ подготовки спермы
Число ооци-тов
Число экспериментов
Дробление,
%
«Swim-up» Фракционирование в градиенте перколла
«Swim-up» Фракционирование в градиенте перколла
Не разделенная по полу сперма
110 4 75,9 ± 2,3а 28,1 ± 2,6а
111 4 68,6 ± 1,6б 18,9 ± 1,3б Разделенная по полу сперма
108 3 44,5 ± 2,1в 3,7 ± 0,2в
104
3
57,2 ± 3,4г
Примечание. Дробление:аб;в г р < 0,05; ав; аг; б-вЯгр < 0,001.
Выход бластоцист от числа ооцитов:аб; в,г; б,вр < 0,05;ав; б,в; агр < 0,001.
Выход бластоцист от числа эмбрионов:аб р < 0,05;аг р < 0,01;ав; бв в,г р < 0,001.
Эксперименты были выполнены в 3-4 независимых повторностях. Данные, выраженные в процентах, обрабатывали методом однофакторного дисперсионного анализа при помощи компьютерной программы SigmaStat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали с использованием критерия Тьюки.
результаты и обсуждение. Оплодотворение представляет собой сложный процесс, который влечет за собой соединение спермы и яйцеклетки, восстановление соматического числа хромосом и начало развития эмбриона. Поэтому оптимизации этого этапа получения эмбрионов in vitro уделяется особое внимание. В ранних исследованиях методология при экстракорпоральном оплодотворении спермой, разделенной по полу, была аналогична используемой при оплодотворении обычным семенем. Однако практика показала, что это два различных объекта, и что для оплодотворения in vitro спермой, разделенной по полу, требуется детализация как условий подготовки самих сперматозоидов, так и собственно условий оплодотворения [13].
В нашей лаборатории долгое время успешно используется протокол, согласно которому обычная заморожено-оттаянная сперма быков перед совместной инкубацией с яйцеклетками обрабатывается методом «swim-up» [10, 11]. Однако в большинстве работ при экстракорпоральном оплодотворении спермой, разделенной по полу, для выделения активных сперматозоидов применяется фракционирование в градиенте плотности перколла [2, 4, 13]. Поэтому в первом эксперименте мы проводили сравнение этих двух подходов. Анализ данных показал, что альтернативный метод обработки обычного семени быков был менее эффективен (табл. 1). В случае использования разделения в градиенте плотности перколла доля дробления ооцитов снижалась на 7,3% (p < 0,05), по сравнению с процедурой «swim-up», а доля развития эмбрионов до стадии бластоцисты уменьшалась на 9,2% (p < 0,05). Эти результаты согласуются с ранее полученными данными других авторов, показавших отрицательное влияние центрифугирования в градиенте плотности перколла и фиколла на жизнеспособность мужских половых клеток при оплодотворении in vitro у крупного рогатого скота [14].
Иные результаты были получены при оплодотворении ооцитов спермой, разделенной по полу. В случае использования метода «swim-up» для получения фракции активных сперматозоидов доля дробления ооцитов и доля их развития до стадии бластоцисты, наоборот, снижались, по сравнению с использованием для этих целей центрифугирования в градиенте плотности перколла, на 12,7% и 8,9% (p < 0,05) соответственно. Кроме того, полученные нами
данные подтвердили результаты большинства работ [2, 4], что жизнеспособность in vitro эмбрионов, полученных с использованием спермы, разделенной по полу ниже, чем при использовании обычного семени.
Известно, что сперматозоид не может сразу оплодотворить яйцеклетку, он приобретает эту способность в процессе капацитации, при которой происходит реорганизация мембранных белков и липидов, изменяется подвижность и происходит акро-
Развитие до стадии бла стоцисты, % от числа
ооцитов эмбрионов
12,6 ± 1,1г
37,8 ± 2,1а 28,1 ± 2,6б 8,4 ± 0,4в 22,3 ± 2,3г
Таблица 2. влияние различных концентраций гепарина в среде оплодотворения при использовании спермы, разделенной по полу, на дальнейшее эмбриональное развитие ооцитов in vitro
Концентрация гепарина Число ооцитов Число экспериментов Дробление, % Развитие до стадии бластоцисты
% от числа ооцитов I % от числа эмбрионов
10 мкг/мл 105 4 59,2 ± 3,4а 12,3 ± 0,8 21,2 ± 2,0 2 мкг/мл 116 4 49,5 ± 1,9б 10,0 ± 1,1 20,5 ± 2,8
Примечание: а бр < 0,05 сомная реакция. При получении эмбрионов in vitro для стимулирования данных изменений в мужских половых клетках чаще всего используется гепарин [15]. Однако в литературе есть сообщения, что процесс сортировки спермы по полу может вызывать в ней частичную капацитацию, и поэтому требуется детализация концентраций данного вещества в среде оплодотворения [13].
В данной работе, оплодотворение яйцеклеток спермой, разделенной по полу, происходило как в среде, содержащей традиционно используемую нами концентрацию гепарина - 10 мкг/мл, так и более низкую концентрацию -2 мкг/мл. Анализ результатов показал, что данное изменение неоднозначно влияло на результаты оплодотворения (табл. 2). Несмотря на то, что наблюдалось снижение доли дробления ооцитов на 9,7% (p < 0,05), в доле развившихся эмбрионов различий между двумя концентрациями гепарина выявлено не было. Ранее Сюй (Xu) с соавторами
описал нестабильность влияния гепарина на сперму разных быков при их контакте in vitro с яйцеклетками коров [2]. Следовательно, можно предположить существование индивидуальной чувствительности половых клеток быков к данному типу обработки.
выводы. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что сперма, разделенная по полу, имеет более низкую оплодотворяющую способность in vitro, чем обычная сперма. Использование для получения фракции активных сперматозоидов центрифугирования в градиенте плотности перколла хотя и более оптимальный метод подготовки спермы, разделенной по полу, к оплодотворению in vitro (согласно полученным данным), но он не обеспечивает получения количества жизнеспособных эмбрионов, адекватного обычной сперме. Следовательно, требуется дальнейшая детализация отдельных этапов технологии их получения.
Литература.
1. Garner D.L., Seidel Jr.G.E. History of commercializing sexed semen for cattle // Theriogenology. 2008. Vol. 69. Рр. 886-895.
2. Xu J., Chaubal S.A., Du F. Optimizing IVF with sexed sperm in cattle// Theriogenology. 2009. Vol. 71. Pp. 39-47.
3. In vitro production of Holstein embryos using sex-sorted sperm and oocytes from selected cull cows/R.D. Wilson, K.A. Weigel, P.M. Fricke, J.J. Rutledge, M.L. Leibfried-Rutledge, D.L. Matthews, V.R. Schutzkus//J. DairySci. 2005. Vol. 88. Pp. 776-782.
4. Developmental potential of vitrified Holstein cattle embryos fertilized in vitro with sex-sorted sperm / J. Xu, Z. Guo, L. Su, et al. // J. Dairy Sci. 2006. Vol. 89. Pp. 2510-2518.
5. Pierson R.A., Adams G.P. Remote assessment of ovarian response and follicular status using visual analysis of ultrasound images // Theriogenology. 1999. Vol. 51. Pp. 47-57.
6. Production of bovine calves following separation of X- and Y-chromosome bearing sperm and in vitro fertilization / D.G. Cran, L.A. Johnson, N.G. Miller, D. Cochrane, C. Polge//Vet. Rec. 1993. Vol. 132. Pp. 40-41.
7. Effects of sex-sorted spermatozoa on the efficiency of in vitro fertilization and ultrastructure of in vitro produced bovine blastocysts / G.A. Palma, N.S. Olivier, C. Neumuller, F. Sinowatz//Anat. Histol. Embryol. 2008. Vol. 37. Pp. 67-73.
8. Cryopreservation of flow-sorted bovine spermatozoa / J.L. Schenk, T.K. Suh, D.G. Cran, Jr.G.E. Seidel// Theriogenology. 1999. Vol. 52. Pp. 1375-1391.
9. Сингина Г.Н., Овчинников А.А., Тарадайник Т.Е. Факторы, влияющие на развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro //Аграрный вестник Урала. 2011. № 9. С. 17-18.
10. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen / J.J. Parrish, J.L. Susko-Parrish, M.L. Leibfried-Rutledge, E.S. Critser, W.H. Eyestone, N.L. First// Theriogenology. 1986. Vol. 25. Pp. 591-600.
11. Сингина Г.Н., Тарадайник Т.Е., Тарадайник Н.П. Оценка эффективности получения эмбрионов in vitro с использованием ооцитов коров и телок// Проблема биологии продуктивных животных. 2011. № 4. С. 132-133.
12. Rosenkrans C.F.Jr., First N.L. Effect of free amino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovine zygotes in vitro // J. Anim. Sci. 1994. Vol. 72. Pp. 434-437.
13. Analysis of bovine sexed sperm for IVF from sorting to the embryo / P. Blondin, M. Beaulieu, V. Fournier, N. Morin, L. Crawford, P. Madan, W.A. King // Theriogenology. 2009. Vol. 71. Pp. 30-38.
14. Parrish J.J., Krogenaes A., Susko-Parrish J.L. Effect of bovine sperm separation by eitherswim-up or Percoll method on success of in vitro fertilization and early embryonic development // Theriogenology. 1995. Vol. 44. Pp. 859-869.
15. Parrish J.J. Bovine in vitro fertilization: In vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin // Theriogenology. 2014. Vol. 81. Pp. 67-73.
evaluation of efficiency for in vitro embryo production using sex-sorted sperm in cattle
G.N. Singina, T.E. Taradajnik, E.N. Shedova, S.S. Danch
L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podolsky r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
Summary. Using sex - preselected in vitro embryos for animal breeding can significantly increase the profitability of dairy and beef cattle production. However there is a need to improve some stages of this technology. We examined the embryonic development of cow oocytes in vitro depending on the sperm preparation and presence of heparin in fertilization medium. Oocyte-cumulus complexes were isolated from ovaries of butchered cows and heifers and cultured in groups of 25-40 complexes in the medium TC199 for 24 h. Frozen unsorted and sex-sorted sperm samples were thawed and separated by either a swim-up or Percoll gradient procedure. Mature oocytes were co-incubated during 18 h with prepared sperm in the medium Fert-Talp supplemented with 10 or 2 microg/ml (only for sex-sorted sperm) of heparine, after then them were replaced in embryos medium and cultured until the blastocyst state. It was revealed the lower fraction of cleavage and blastocyst rate with using sex-sorted sperm compared with those derived with unsorted sperm (57.2 ± 3.4 and 22.3 ± 2.3% vs 75.9 ± 2.3 and 37.8 ± 2.1 % respectively). The result of fertilization in both cases depended on the sperm preparation method. Swim-up treatment was better for unsorted sperm and Percoll gradient procedure was better for sex-sorted sperm. The decrease in the heparine concentration in the fertilization medium reduced the fraction of oocyte cleavage, inseminated by the sex-selected sperm, but did not influence their ability to further embryonic development. It was recommended to use Percoll gradient procedure for preparation of sex-sorted sperm to obtain the fraction of active spermatozoa. Keywords: in vitro fertilization, embryos, sex-sorted sperm.
Author Details: G.N. Singina, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: g_singina@mail.ru); T.E. Taradajnik, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow; E.N. Shedova, research fellow; S.S. Danch, Cand. Sc. (Agr.), leading research fellow.
For citation: Singina G.N., Taradajnik T.E., Shedova E.N., Danch S.S. Evaluation of Efficiency for In Vitro Embryo Production Using Sex-Sorted Sperm in Cattle. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. Vol. 29. No 12. Pp. 95-97 (in Russ.).
