Экспрессия СБ95^Л8 в клетках крови при раке толстой кишки Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА CD95/FAS... 23

УДК 616.345-006.6-071:575.117

О.В. Уткин1’2, Н.А. Сахарнов1, Н.Б. Преснякова2, Д.В. Новиков1, А.В. Алясова3,

В.В. Новиков ’2, А.Ю. Барышников4

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА CD95/FAS В КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ

1НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ФГБОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

2ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород

3 ФГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава, Нижний Новгород 4ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Контактная информация

Уткин Олег Владимирович, ведущий научный сотрудник

адрес: 603006, г. Нижний Новгород, ул. Ошарская, 8Д; тел: +7 (831) 419-90-64

e-mail: utkino2004@mail.ru

Статья поступила: 21.01.2013, принята к печати 01.02.2013

Резюме

Цель данного исследования - анализ экспрессии гена CD95/Fas в крови при РТК. С помощью метода ОТ-ПЦР показано, что во всех образцах крови здоровых волонтеров и больных РТК выявлялась мРНК мембранной формы (mFas) и мРНК доминирующей растворимой формы (sFasTMDel). У больных РТК встречаемость минорных форм мРНК CD95/Fas варьировала, но снижалась по сравнению с нормой вне зависимости от клинических особенностей заболевания. Используя разработанный нами мультиплексный вариант ОТ-ПЦР в реальном времени, показано, что уровень представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel разнонаправленно флуктуировал на разных стадиях РТК. У больных без метастазов изменения в уровнях мРНК mFas и мРНК sFasTMDel были более выражены, чем у больных с метастазами. Обнаружено, что уровень мРНК обоих вариантов CD95/Fas повышался по мере увеличения степени агрессивности опухоли. Значения этого показателя были самыми низкими при высокодифференцированной гистологической форме РТК и достигали самых высоких значений при низкодифференцированной гистологической форме заболевания. С помощью ИФА определяли сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций растворимого CD95/Fas (sCD95/sFas). Выявлено, что сывороточное содержание обеих фракций sCD95/sFas превышало значения нормы вне зависимости от клинических особенностей заболевания.

Ключевые слова: апоптоз, CD95/Fas, мРНК, уровень экспрессии, альтернативный сплайсинг, рак толстой кишки.

O.V. Utkin1’2, N.A. Sakharnov1, N.B. Presnyakova2, D.V. Novikov1, A.V. Alyasova3,

V.V. Novikov1’2, A.Y. Baryshnikov4

EXPRESSION OF CD95/FAS IN BLOOD CELLS AT COLORECTAL CANCER

institute of Molecular Biology and Regional Ecology N. I. Lobachevsky State University of Nizhni Novgorod - National Research University, Nizhny Novgorod

2I.N. Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod

3Nizhny Novgorod State Medical Academy, Nizhny Novgorod

4FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow

Abstract

The purpose of this researching is the analysis of CD95/Fas expression in blood at colorectal cancer. By PCR with reverse transcription was revealed that mRNA of membrane form (mFas) and mRNA of dominant soluble form (sFasTMDel) were detected in all samples of blood of healthy donors and colorectal patients. Frequency of occurrence of minor forms of CD95/Fas mRNA in samples of colorectal patients variated but it decreased in comparison with norm independently of clinical features of cancer. Using multiplex variant of real-time PCR with reverse transcription that we developed, was revealed that expression level of mFas mRNA and sFasTMDel mRNA differently fluctuated on different stages of colorectal cancer. Alterations in expression level of mFas mRNA and sFasTMDel mRNA were more pronounced in samples of patients withot metastasis than patients with metastasis. We detected that expression level of mRNA of both variants CD95/Fas increased according as malignancy degree of cancer increased. Values of this index were the lowest at high-differentiated histological form of colorectal cancer and were the highest at low-differentiated histological form of cancer. By immunoassay we detected serum level of summary and oligomeric fractions of soluble CD95/Fas (sCD95/sFas). Was revealed that serum level of both fractions sCD95/sFas exceeded the normal values independently of clinical features of cancer.

Key words: apoptosis, CD95/Fas, mRNA, expression level, alternative splicing, colorectal cancer.

Введение Особенностью экспрессии гена CD95/Fas является

высокое разнообразие форм мРНК, образующихся в

В регуляции апоптотических процессов и им- результате альтернативного сплайсинга. Среди них

мунного ответа принимает участие представитель бел- выделяют мембранную (mFas), доминирующую рас-

кового семейства «рецепторов смерти» - CD95/Fas. творимую (sFasExo6Del/sFasTMDel) и несколько

минорных растворимых форм, образующихся в результате делеций одного или нескольких экзонов [6; 15]. Они выполняют разные функции в клетке. Как правило, мембранная форма СБ95/РаБ участвует в инициации апоптоза [1; 5]. Функциональная направленность растворимых форм обусловлена их структурной организацией. Мономерная растворимая форма СБ95/РаБ (БСБ95/БРа8) блокирует передачу сигнала смерти, а его олигомерная форма проявляет про-апоптотическую активность [9; 17]. Минорные растворимые формы участвуют в регуляции экспрессии доминирующей растворимой формы [6; 7]. Изменение экспрессии гена СВ95/¥а$ может сопровождаться возникновением разных по составу и уровню представленности мРНК спектров, а также флуктуацией сывороточного содержания отличающихся по структуре и функциям фракций БСБ95/БРаБ. Такая ситуация в отношении мембранных и растворимых форм СБ95/РаБ вносит вклад в изменение баланса сигналов выживания/гибели уже на начальных этапах апоптоза, приводя к модуляции иммунного ответа, и может играть важную роль в патогенезе онкологических заболеваний. Широкая распространенность и разнообразие клинических форм РТК делают актуальным всестороннее изучение молекулярных механизмов иммунного ответа при данном заболевании.

Целью настоящей работы явилась оценка экспрессии гена СВ95/¥а$ в образцах цельной крови у больных раком толстой кишки.

Материалы и методы

Материалом исследования явились образцы цельной периферической крови и образцы сыворотки крови 39 больных РТК с разными гистологическими формами опухоли (19 мужчин и 20 женщин), проходивших лечение в Нижегородском областном онкологическом диспансере. УДГФ РТК регистрировалась у 26 пациентов, НДГФ регистрировалась у 6 больных, ВДГФ - у 7 из 39 пациентов. У 9 из 39 больных была установлена I стадия заболевания, у 17 - II стадия, у 9 - III стадия, у 4 - IV стадия. Метастазы были зарегистрированы у 13 из 39 пациентов. В качестве контроля использовали образцы крови и сыворотки крови 59 здоровых волонтеров (45 женщин и 14 мужчин).

Выделение мРНК из клеток периферической крови проводили с использованием фенол-хлоро-форменной экстракции [10]. Оценку спектра форм мРНК СБ95/РаБ проводили с помощью разработанного ранее метода ОТ-ПЦР [2; 7]. Результаты ОТ-ПЦР оценивали методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем флуоресцентный краситель бромид этидия.

Оценку сывороточного содержания суммарной и олигомерной фракций БСБ95/БРаБ проводили иммуноферментным методом. Для определения сывороточного содержания суммарной фракции БСБ95/БРаБ использовали поликлональные антитела против мононуклеарных клеток периферической крови человека и конъюгированные с пероксидазой корня хрена МКА ИКО-160 [19]. Определение олигомерной фракции БСБ95/БРаБ проводили с помощью очищенных моноклональных антител ИКО-160 и конъюгированных с пероксидазой МКА ИКО-160 [4].

Для детекции уровня представленности мРНК тРаБ и мРНК БРаБТМОе1, а также мРНК референтного гена иЬс был разработан метод мультиплексной амплификации мрНк тРаБ, БРаБТМОе1 и иЬс в одной пробирке. Общий объем реакционной смеси

составлял 25 мкл. Реакционная смесь содержала 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера («Силекс», Москва), 2 мкл раствора дШФ/dNTF («Силекс», Москва), 0,5 мкл TaqF-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва), по 0,5 мкл прямого и обратного праймеров для гена CD95/Fas и референтного гена Ubc (ЗАО «Син-тол», Москва), по 0,5 мкл зондов для выявления кДНК mFas и sFasTMDel, а также для детекции кДНК Ubc (ЗАО «Синтол», Москва) и 14,5 мкл би-дистиллированной Н2О. В дальнейшем к 23 мкл реакционной смеси добавляли 2 мкл кДНК, полученной в ходе реакции обратной транскрипции, и помещали в анализатор нуклеиновых кислот «АНК-32» (ЗАО «Синтол», Москва). В работе применялся мультиплексный «TaqMan» вариант полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Раздельную детекцию уровня мРНК mFas и мРНК sFasTMDel проводили c помощью модифицированного метода [3] с использованием прямого и обратного праймеров , а также специфических для каждой из форм мРНК CD95/Fas олигонуклео-тидных зондов [7] и при следующих температурных условиях: денатурация 94 °С - 30 с, отжиг (гибридизация) 55 °С - 40 с, элонгация 72 °С -45 с. Общее количество циклов для одного раунда ПЦР составляло 50. Каждое измерение проводили в трех повторах. За уровень представленности мРНК принимали номер цикла амплификации, при котором был зарегистрирован экспоненциальный рост интенсивности флуоресценции - пороговый цикл (Ct). Для нормализации количества внесенной матрицы проводили определение уровня экспрессии референтного гена Ubc с использованием прямого и обратного праймеров, а также олиго-нуклеотидного зонда при тех же температурных условиях, что и для гена CD95/Fas.

Для расчета относительного уровня экспрессии гена CD95/Fas была использована программа REST [16]. Уровень экспрессии исследуемых генов рассчитывали относительно контроля, принимая величину экспрессии гена в контроле за единицу. Дополнительно рассчитывался коэффициент (К), представляющий собой отношение уровня представленности мРНК mFas к уровню представленности мРНК sFasTMDel (^RmFa/RsFasTMDei). Значения коэффициента К у здоровых волонтеров принимали за единицу.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 8.0. Для оценки встречаемости мРНК рассчитывали относительную и абсолютную частоты. Анализ различий относительных частот обнаружения мРНК в группах проводили с использованием критерия сравнения пропорций. Для оценки взаимосвязи изучаемых признаков между собой использовали двусторонний тест точного критерия Фишера и критерий Мак-Немара. Для представления исследованных количественных показателей были использованы медиана, 25 и 75 процентили. Межгрупповой анализ количественных показателей проводили с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса. Для анализа взаимосвязи изучаемых количественных признаков, а также количественных и качественных признаков между собой

* FasF (5’- ATggAATCATCAAggAATgC-3’)

** FasR (5’- CTTTCTgTgCTTTCTgCATg-3’)

***mFasZ (5’-Rox-AgATCTAACTTggggTggCTTTgTCTTCTT-BHQ2-3’) ****sFasZ (5’-Fam-AgTgCAAAgAggAAgTgAAgAgAAAggAA-3-BHQ1-3’)

...UbcF (5’-CACAgCTAgTTCCgTCgCA-3’)

...UbcR (5’-gAAgATCTgCATTgTCAAgT-3’)

*******UbcZ (5’-R6G-ATTTgggTCgCAgTTCTTgTTTgTggAT-BHQ1-3’)

использовали критерий ранговой корреляции Спирмена. При анализе качественных и количественных признаков различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Экспрессия СБ95/Еа8 в крови на разных стадиях РТК Проведенные исследования выявили, что относительный уровень мРНК шБає у больных РТК статистически значимо не изменялся в сравнении с контролем, однако наблюдалась тенденция к его снижению от первой к третьей стадии с последующей тенденцией к повышению на 4 стадии. Уровень мРНК єРаєТМОеІ был статистически значимо понижен на 2 стадии заболевания (р=0,003) и имел тенденцию к снижению на остальных стадиях (рис. 1).

I ст П ст Ш ст IV ст

10 --. 1~, ) П л .1 ~ (, Г1 .---

8

Й

I 6

к

І 4

а

о

& 2

Є

1 -2

*статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05);

Рис. 1. Уровень мРНК mFas и мРНК sFasTMDel в крови больных на разных стадиях РТК: уровень мРНК mFas и мРНК sFasTMDel здоровых волонтеров принят за 1 и изображен в виде горизонтальной линии.

Коэффициент К, представляющий собой отношение уровня мРНК mFas к уровню мРНК sFasTMDel, составил 1,26/0,42=3,0 отн. ед. на I стадии; 0,95/0,25=3,8 отн. ед. на II стадии;

0,80/0,48=1,7 отн. ед. на III стадии и 2,88/0,76=3,8 отн. ед. на IV стадии. На I и II стадиях РТК значения данного коэффициента у онкологических больных были статистически значимо повышены по сравнению с нормой (р<0,001), а на III и IV стадиях заболевания имели тенденцию к повышению.

В крови здоровых волонтеров и больных РТК с различной частотой выявлялись 6 вариантов мРНК CD95/Fas (mFas, sFasTMDel, FasExo4Del, FasExo3,4Del, FasExo4,6Del, FasExo3,4,6Del). У всех здоровых волонтеров и больных РТК детектировалась мРНК mFas и мРНК sFasTMDel. Встречаемость минорных форм мРНК CD95/Fas варьировала как у здоровых волонтеров, так и у больных лиц (табл. 1).

В целом, на всех стадиях рака толстой кишки мРНК минорных форм CD95/Fas выявлялась реже по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05). На II стадии РТК мРНК FasExo3,4Del, FasExo4,6Del и FasExo3,4,6Del выявлялись статистически значимо чаще, чем мРНК FasExo4Del (р=0,005, р=0,020 и р=0,002, соответственно). На III стадии заболевания мРНК FasExo3,4,6Del выявлялась чаще, чем мРНК FasExo4Del (р=0,027).

Выявленные особенности транскриптома клеток крови сопоставляли с сывороточным содержанием суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas (табл. 2). Показано, что на всех стадиях РТК сывороточное содержание sCD95/sFas статистически значимо превышало норму в 1,6-2,0 раза для суммарной фракции и в 2,1-2,8 раза для олигомерной фракции (р<0,05).

Корреляционный анализ не выявил статистически значимой связи между уровнем представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel в крови и сывороточным уровнем суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas.

Экспрессия СБ95/Еа8

при наличии или отсутствии метастазов

При метастазировании опухоли уровень представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel в крови статистически значимо не отличался от соответствующих показателей у здоровых волонтеров (рис. 2). Вместе с тем, уровень мРНК mFas имел тенденцию к повышению, а уровень мРНК sFasTMDel имел обратную тенденцию.

Нет мегастазов Есть метастазы

10,----. И 1.-------,--------------

8

! & ■

о

sx 2

□ Median [ 125°/b'75°/b

I Min-Max

^статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05);

Рис. 2. Уровень мРНК mFas и мРНК sFasTMDel при наличии или отсутствии метастазов: уровень мРНК mFas и мРНК sFasTMDel здоровых волонтеров принят за 1.

Отсутствие метастазов характеризовалось нормальным уровнем мРНК mFas и сниженным уровнем мРНК sFasTMDel (р=0,002). У больных с метастазами уровни мРНК mFas и sFasTMDel не менялись. Вне зависимости от наличия или отсутствия метастазов коэффициент К превышал норму (р<0,001). При наличии метастазов значение коэффициента составляло 1,19/0,56=2,1 отн. ед., а при отсутствии метастазов оно составляло величину 1,05/0,30=3,5 отн. ед. То есть при отсутствии метастазов у больных РТК коэффициент К был в 1,7 раза выше, чем у больных с метастазами (р>0,05).

Встречаемость минорных форм мРНК CD95/Fas варьировала у больных РТК при наличии и отсутствии метастазов (табл. 3). При метастазах с наибольшей частотой в крови детектировалась одна минорная форма мРНК, а без метастазов - три минорные формы мРНК. У пациентов с метастазами частота выявления мРНК FasExo3,4,6Del была статистически значимо выше, чем частота обнаружения мРНК FasExo4Del (р=0,005).

Таблица 1

Встречаемость минорных форм мРНК С'Э95/Р;^ в крови на разных стадиях РТК__________________________

Стадия Миної зные формы

РаєЕхо4Ве1 РаєЕхо3,4Бе РазЕхо4,6Бе1 РазЕхо3,4,6Бе1

I 0/9* 4/9* 2/9* 6/9*

II 1/17* 9/17*,** 7/17*,** 10/17***

III 1/9* 3/9* 2/9* 6/9*,**

IV 1/4* * 3 * /4 4/ * /4 4/

Здоровые волонтеры 24/59 29/59 59/59 57/59

*статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05); **статистически значимые различия по сравнению с Ра8Ехо4Бе1 (р<0,05)

Таблица 2

Сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций 8СБ95^Ра8 на разных стадиях РТК (Ц/ш!)___

Фракция 8СБ95^Ра8 Здоровые волонтеры Стадия

I II III IV

Суммарная 204,2 (128,0; 345,9) 330,6 (317,0; 340,2)* 371,0 (321,0; 430,0)* 408,0 (381,0; 764,0)* 327,3 (283,3; 340,0)*

Олигомерная 83,1 (69,3; 129) 175,1 (164,3; 222,3)* 222,1 (164,3; 355,5)* 214,3 (187,2; 234,6)* 229,6 (169,4; 273,4)*

* статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05)

Таблица 3

Частота выявления минорных форм мРНК С'Э95/Р;^ в крови больных РТК при наличии и отсутствии метастазов

Метастазы Минорные формы

РазЕхо4Бе1 РазЕхо3,4Бе1 РазЕхо4,6Бе1 РазЕхо3,4,6Бе1

есть 2/13* 6/13* 6/13* 10/13***

нет 1/26* 13/26*,** 9/26*,** 16/26А** ***

Здоровые волонтеры 24/59 29/59 59/59 57/59

*статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05); **статистически значимые различия по сравнению с Ра$Ехо4Бе1 (р<0,05); ***статистически значимые различия по сравнению с Ра$Ехо4,6Бе1 (р<0,05)

Таблица 4

Сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций 5СР95/вРа5 у больных с метастазами и без метастазов (Ц/ш!)

Фракция 8СБ95^Ра8 Здоровые волонтеры Метастазы

Есть Нет

Суммарный 204,2 (128,0; 345,9) 381,0 (319,5; 563,0)* 338,6 (317,0; 430,0)*

Олигомерный 83,1 (69,3; 129) 227,5 (187,2; 234,6)* 204,6 (164,3; 277,3)*

*статистически значимые различия по сравнению со здо ювыми волонтерами (р<0,05)

Таблица 5

Частота выявления минорных форм мРНК С'Э95/Р;^ при разных гистологических формах опухоли___________

Гистологическая форма Минорные мРНК

РазЕхо4Бе1 РазЕхо3,4Бе1 РазЕхо4,6Бе1 РазЕхо3,4,6Бе1

Низкодифференцированная 0/6* 0/6* 0/6* 1/6*

Умереннодифференцированная 4/26* 16/26*** 12/26*,** 22/26^*^***

Высокодифференцированная 0/7* 3/7* 3/7* 3/7*,***

Здоровые волонтеры 24/59 29/59 59/59 57/59

*статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05); **статистически значимые различия по сравнению с Ра$Ехо4Бе1 (р<0,05); ***статистически значимые различия между гистологическими формами рака (р<0,05)

Таблица 6

Сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций 8СБ95^Ра8 при разных гистологических формах опухоли (Ц/ш!)________________________________________'_________________________________________________

Фракция 8СБ95^Ра8 Здоровые волонтеры Опухоль

Высоко-дифференци- рованная Умеренно-дифференци- рованнная Низко-дифференци- рованная

Суммарная 204,2 (128,0; 345,9) 383,9 (305,1; 654,2)* 381,6 (294,6; 525,6)* 390,6 (256,1; 489,1)*

Олигомерная 83,1 (69,3; 129) 275,9 (225,8; 619,2)* 217,7 (186,7; 319,4)* 251,8 (168,2; 291,9)*

*статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05)

В отношении других минорных форм мРНК СБ95/РаБ подобные различия отсутствовали. У больных без метастазов частота выявления мРНК РаБЕхо3,4,6Бе1 была статистически значимо выше, чем частота обнаружения мРНК РаБЕхо4,6Бе1 (р=0,040). Кроме того, чаще обнаруживалась мРНК РаБЕхо3,4Бе1, РаБЕхо4,6Бе1 и РаБЕхо3,4,6Бе1, чем мРНК РаБЕхо4Бе1 (р<0,001). При сравнении встречаемости мРНК минорных форм СБ95/РаБ в крови между группами пациентов с наличием или отсутствием метастазов статистически значимых различий обнаружено не было. По сравнению со здоровыми волонтерами у больных РТК вне зависимости от наличия или отсутствия метастазов мРНК всех минорных форм СБ95/РаБ выявлялась реже (р<0,05).

Выявленные изменения в экспрессии гена СВ95/¥а$ в крови больных РТК сопровождались статистически значимым повышением сывороточного содержания суммарной и олигомерной фракций БСБ95/БРаБ (табл. 4). У больных с метастазами значения данных показателей превышали норму в 1,9 раза и в 2,7 раза, соответственно, а при отсутствии метастазов - в 1,7 раза и в 2,5 раза, соответственно.

Корреляционный анализ не выявил статистически значимой взаимосвязи между уровнем представленности мРНК шРаБ и мРНК БРаБТМОе1 в крови больных, имеющих и не имеющих метастазы, и сывороточным уровнем суммарной и олигомерной фракций БСБ95/БРаБ.

Экспрессия CD95/Fas в крови больных при разных гистологических формах опухоли У больных с ВДГФ РТК относительный уровень представленности мРНК шРаБ и мРНК БРаБТМОе1 был статистически значимо снижен по сравнению со здоровыми волонтерами (р=0,025 и р=0,015 соответственно; рис. 3). При УДГФ уровень мРНК шРаБ имел тенденцию к повышению, а уровень мРНК БРаБТМБе1 был статистически значимо снижен (р=0,014). При НДГФ РТК статистически значимых различий обнаружено не было.

ВДГФ УДГФ НДГФ

^статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р<0,05);

Рис. 3. Уровень мРНК шРаБ и мРНК БРаБТМОе1 при разных гистологических формах опухоли: уровень мРНК шРаБ и мРНК БРаБТМОе1 здоровых волонтеров принят за 1.

Коэффициент К превышал норму при всех гистологических формах опухоли (р<0,001). При ВДГФ он соответствовал величине, равной 0,31/0,16=1,9 отн.

ед; при УДГФ он был равен 1,34/0,41=3,3 отн. ед.; при НДГФ - 1,88/0,59=3,2 отн. ед. То есть у больных с низкодифференцированной и умереннодифференцированной формами опухоли коэффициент К превышал норму более, чем в три раза.

Встречаемость минорных мРНК СБ95/РаБ колебалась в широких пределах, однако различия при НДГФ и ВДГФ не были статистически значимы (табл. 5). При УДГФ частота выявления мРНК РаБЕхо3,4Бе1, РаБЕхо4,6Бе1 и РаБЕхо3,4,6Бе1 была статистически значимо выше, чем частота выявления мРНК РаБЕхо4Бе1 (р<0,001, р=0,009 и р<0,001, соответственно). Частота обнаружения мРНК

РаБЕхо3,4,6Бе1 была статистически значимо выше, чем частота выявления мРНК РаБЕхо4,6Бе1 (р=0,007).

Межгрупповой анализ встречаемости минорных мРНК СБ95/РаБ выявил статистически значимые различия в частоте выявления мРНК РаБЕхо3,4,6Бе1 при УДГФ и НДГФ (р=0,024). По сравнению со здоровыми волонтерами у больных РТК вне зависимости от гистологической формы опухоли все минорные мРНК выявлялась реже (р<0,05). Самой низкой частотой выявления минорных мРНК характеризовалась низкодифференцированная форма.

Сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракций БСБ95/БРаБ при всех гистологических формах опухоли статистически значимо превышало норму (р<0,05) (табл. 6). При ВДГФ значения данных показателей превышали норму в 1,9 раза и в 3,3 раза, соответственно, при УДГФ - в 1,9 раза и в 2,6 раза, соответственно, а при НДГФ - в 1,9 раза и в 3 раза соответственно.

Корреляционный анализ не выявил статистически значимой взаимосвязи между уровнем представленности мРНК шРаБ и мРНК БРаБТМОе1 и сывороточным содержанием суммарной и олигомерной фракций БСБ95/БРаБ при разной степени дифференцировки опухоли.

Согласно литературным данным нормальные эпителиальные клетки толстой кишки экспрессируют СБ95/РаБ [18]. В линиях клеток РТК SW480, SW620 и НТ29 детектируется мРНК СБ95/РаБ и продукт ее трансляции, выявляемый на мембране опухолевых клеток на низком уровне [14; 21]. У больных РТК также наблюдается снижение экспрессии СБ95/РаБ на мембране опухолевых клеток, что снижает их восприимчивость к индукции апоп-тоза. Показано, что наиболее выраженное снижение экспрессии СБ95/РаБ наблюдается на более поздних стадиях РТК [12]. С другой стороны, на мембране лимфоцитов, инфильтрирующих опухолевый очаг, экспрессия СБ95/РаБ повышается. Следует отметить, что не обнаружено взаимосвязи между экспрессией СБ95/РаБ в опухолевых клетках и стадией РТК, наличием метастазов, гистологическим типом опухоли [18].

Известно, что в норме активация иммуно-компетентных клеток сопровождается изменением экспрессии гена СВ95/¥а$ [1; 13]. Это выражается в увеличении количества мРНК шРаБ и ее белкового продукта, участвующего в инициации РаБ-зависимого апоптоза, а также в снижении количества мРНК растворимых форм СБ95/РаБ, продукты трансляции которых потенциально могут препятствовать передаче апоптотического сигнала. Следовательно, анализ экспрессии гена СВ95/¥а$ может быть использован для оценки функционального состояния клеток иммунной системы.

В настоящей работе нами показано, что уровень мРНК РаБ/СБ95 в крови больных на всех ста-

28 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА CD95/FAS...

диях РТК находился в пределах нормы. Уровень мРНК БРаБТМОе1 имел устойчивую тенденцию к снижению, что отражалось в повышении на всех стадиях заболевания коэффициента К, представляющего собой отношение уровня мРНК шРаБ к уровню мРНК БРаБТМОе1. Коэффициент К был повышен как у больных с метастазами так и без них. Отличительной чертой больных РТК без метастазов явилось статистически значимое снижение уровня мРНК БРаБТМОе1 .

Больные с гистологически высокодифференцированной опухолью имели пониженный уровень обоих вариантов мРНК. Обнаружено, что по мере уменьшения степени дифференцировке опухоли уровень мРНК шБаБ и БРаБТМОе1 нормализовался. В то же время коэффициент К имел тенденцию к увеличению. У больных с низкодифференцированной и умереннодифференцированной формами опухоли коэффициент К был почти в два раза выше, чем у больных с высокодифференцированной гистологической формой опухоли.

Рак толстой кишки сопровождался снижением частоты выявления минорных форм мРНК РаБ/СБ95 в крови вне зависимости от стадии заболевания, наличия метастазов и гистологической формы опухоли. Минорная форма мРНК РаБ/СБ95 с делецией 4 экзона (РаБЕхо4Бе1) обнаруживалась реже других минорных форм.

Чаще всего регистрировалось присутствие минорной формы с делециями 3; 4; 6 экзонов (РаБЕхо3,4,6Бе1). Самой низкой частотой выявления минорных форм характеризовались больные с низкодифференцированной опухолью. Заметим, что у больных с метастазами чаще всего выявлялась всего одна минорная форма в отличие от больных без метастазов, у которых в большинстве случаев детектировалось по три минорных варианта мРНК РаБ/СБ95. Как больные с низкодифференцированными опухолями, так и больные с метастазами имели самые высокие значения коэффициента К. То есть снижение количества выявляемых минорных форм в целом было ассоциировано с увеличением коэффициента К, отражающего соотношение уровня мРНК шБаБ и уровня мРНК БРаБТМОе1. Выявленные особенности, вероятно, связаны с механизмами регуляции работы гена СВ95/¥а$ в крови при раке толстой кишки.

Наряду с мембранным белком продуктом гена СВ95?¥а8 является растворимый белок, образующийся за счет альтернативного сплайсинга мРНК или посттрансляционной модификации мембранного белка путем протеолитического шеддин-га. Данные литературы, касающиеся суммарной фракции БСБ95/БРаБ, противоречивы.

С одной стороны, они соответствуют полученным нами результатам о повышении сывороточного содержания БСБ95/БРаБ [8; 11], с другой стороны в одном из исследований описано снижение сывороточного уровня БСБ95/БРаБ у больных раком толстой кишки с метастазами [20].

Повышение сывороточного содержания было зарегистрировано нами не только для суммарной, но и для олигомерной фракции растворимых молекул СБ95/РаБ. В сравнении с нормой содержание олигомерной фракции повышалось в большей степени, чем суммарной.

Это указывает на смещение равновесия между количественным содержанием олигомерной и мономерной фракций БСБ95/БРаБ в сторону олигомерной фракции, проявляющей проапоптотические свойства в отношении РаБЬ-положительных клеток.

Заключение

Таким образом, при раке толстой кишки в периферической крови больных обнаружены изменения в экспрессии гена ¥а$/СВ95, проявляющиеся в вариации спектров альтернативных форм мРНК, уровней их представленности в клетках и в увеличении сывороточного содержания суммарной и олигомерной фракций растворимого белка РаБ/СБ95. Повышенное в несколько раз соотношение мРНК мембранной формы и доминирующей растворимой формы указывает на изменение РаБ/СБ95-ассоциированного активационного статуса клеток периферической крови. По мере увеличения степени агрессивности опухоли такие изменения были более выражены.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг и Российского фонда фундаментальных исследований (проект №11-04-97088р_поволжье_а)

Литература

1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: «Эдиториал УРСС», 2002. - 320 с.

2. Новиков Д.В., Новиков В.В. Новый метод детекции мРНК мембранной и доминирующей растворимой формы Fas-протеина // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», Москва. - 2003. - С. 71-2.

3. Новиков Д.В., ЛебедевМ.Ю., Уткин О.В. и др. Метод сравнительной оценки экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas антигена с использованием ПЦР в реальном времени // Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», Москва. - 2005. - С. 195.

4. Птицына Ю.С., Кравченко Г.А., Новиков В.В. и др. Уровень сывороточного CD95 олигомера у наркоманов, больных хроническим вирусным гепатитом С // Вестн. ННГУ, сер. Биол. - 2004. - Вып. 3. -

С. 211-3.

5. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Российский био-терапевтический журнал. - 2002. - Т. 1, №3 - С. 27-33.

6. Уткин О.В., Новиков В.В. Регуляция апоптоза с помощью альтернативного сплайсинга матричной РНК // Российский биотерапевтический журнал - 2007. - Т. 6, № 2. - С. 13-20.

7. Уткин О.В., Лебедев М.Ю., Новиков Д.В. и др. Спектр мРНК Fas-антигена мононуклеарных клеток крови и сывороточное содержание растворимого Fas у тяжелообожженных больных // Иммунол. -

2008. - Т. 29 - С. 362-5.

8. Abbasova S.G., Vysotskii M.M., Ovchinnikova L.K. et al. Cancer and soluble FAS // Bull Exp. Biol. Med. -

2009. - 148(4). - Р. 638-42.

9. Cheng J., Zhou I., Liu C. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by soluble form of the Fas molecule // Science. - 1994. - 263. - P. 1759-62.

10. Chomszynskii P., Sacchi N. Single - step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyonate - phe-nol-chloroform extraction // Analytical biochem. - 1987. - 162. - P. 156-9.

11. Kushlinskii N.E., Britvin T.A., Abbasova S.G. et al. Soluble Fas antigen in the serum of patients with colon cancer // Bull. Exp. Biol. Med. - 2001. - 131(4). - P. 361-3.

12. Kykalos S., Mathaiou S., Karayiannakis A.J. et al. Tissue Expression of the Proteins Fas and Fas Ligand in Colorectal Cancer and Liver Metastases // J. Gastrointest. Cancer. - 2011. - Jan 27. Abstract.

13. Liu C., Cheng J., Mountz J.D. Differential expression of human Fas mRNA species upon peripheral blood mononuclear cell activation // J. Biochem. - 1995. - 310. - P. 957-63.

14. O’Connell J., O'Sullivan G.C., Collins J.K., Shanahan F. The Fas counterattack: Fas-mediated T cell killing by colon cancer cells expressing Fas ligand // J. Exp. Med. - 1996. - 184(3). - P.1075-82.

15. Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-terminal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. - 1996. - 156. - P. 4622-30.

16. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR // Nucl. Acids Res. - 2002. - 30(9). -P. 1-10.

17. Proussakova O.V., Rabaya N.A., Moshnikova A.B. et al. Oligomerization of Soluble Fas Antigen Induces Its Cytotoxicity // J. Biol. Chem. - 2003. - 278. - P. 36236-41.

18. Pryczynicz А., Guzinska-Ustymowicz K, Kemona А. Fas/FasL expression in colorectal cancer // An immu-nohistochemical study Folia Histochemica et Cytobiologica. - 2010. - 48(3). - P. 425-9.

19. Ptitsyna Yu.S., Bornyakova L A., Baryshnikov A.Yu. et al. A soluble form of Fas/Apo-1 (CD95) antigen in the serum of viral hepatitis patients // Int. J. Immunorehab. - 1999. - 4. - P. 110-1.

20. Yildiz R., Benekli M, Buyukberber S. et al. The effect of bevacizumab on serum soluble FAS/FASL and TRAIL and its receptors (DR4 and DR5) in metastatic colorectal cancer // J. Cancer Res. Clin. Oncol. -

2010. - 136(10). - P. 1471-6.

21. Zhu Q, Liu J.Y., Yang C.M. et al. Influence of antitumor drugs on the expression of Fas system in SW480 colon cancer cells // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 2006. - 18(10). - P. 1071-7.

Список сокращений

ВДГФ - высокодифференцированная гистологическая форма

НДГФ - низкодифференцированная гистологическая форма

РТК - рак толстой кишки

УДГФ - умереннодифференцированная гистологическая форма

НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН