CC BY
49
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616.98:578.825.1]-078.33:577.21.083.3
О. В. Уткин12, Т. А. Свинцова3, Г. А. Кравченко1, О. А. Шмелева1, Д. В. Новиков1,
А. А. Бабаев1, Д. М. Собчак3, А. В. Караулов4, В. В. Новиков1-2
ЭКСПРЕССИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ФОРМ ГЕНА CD95/FAS В КЛЕТКАХ КРОВИ ПРИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
1НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ФГБОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского (603006, г Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23); 2ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И. Н. Блохиной Роспотребнадзора (603950, г Нижний Новгород, ул. Грузинская, д. 44); 3ФГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава (603005, г Нижний Новгород, ул. Минина, д. 10/1); 4ФГБОУ ВПО Первый московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)
В периферической крови у пациентов с тяжелой и среднетяжелой формами герпес-вирусной инфекции (ГВИ) исследована частота встречаемости альтернативных форм мРНК, CD95/Fas, опосредующей апоптоз, определен уровень мРНК мембранной (mFas) и доминирующей растворимой (sFasTMDel) молекул CD95/Fas в сопоставлении с сывороточным содержанием суммарной и олигомерных фракций растворимой молекулы CD95/Fas. При инфицировании вирусом ветряной оспы (ВВО) или вирусом Эпштейна—Барр (ВЭБ) отношение между уровнем мРНК mFas и содержанием мРНК sFasTMDel уменьшалось. Инфицирование цитомегаловирусом (ЦМВ) сопровождалось повышением содержания мРНК mFas. Встречаемость альтернативных минорных форм мРНК CD95/Fas широко варьировала, свидетельствуя о возможном участии минорных форм в регуляции Fas-зависимого апоптоза. Соотношение уровня мРНК mFas и мРНК sFasTMDel достигало минимальных значений при тяжелом течении ГВИ. Сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas не коррелировал с уровнем мРНК CD95/ Fas, повышался при инфицировании ЦМВ и при ВЭБ-инфекции и не менялся при инфицировании ВВО.
Ключевые слова: апоптоз, рецепторы смерти, CD95/Fas, мРНК, герпес-вирусная инфекция
Utkin O.V., Svintsova T.A., Kravchenko G.A., Shmeleva O.A., NovikovD.V., BabayevA.A.,
SobchakD.M., KaraulovA.V., Novikov V.V.
GENE EXPRESSION CD95/FAS IN THE CELLS OF THE BLOOD IN HERPES-VIRUS INFECTION
In peripheral blood of patients with the frequency of alternative forms of mRNA CD95/Fas occurrence and the level of membrane (mFas) and soluble (sFasTMDel) CD95/Fas molecules mRNA in comparison with serum level of total and oligomeric fractions of soluble CD95/Fas molecule have been detected. At a chicken pox virus (CPV) infection or Epstein-Barr virus (EBV) infection the ratio of mRNA mFas level to mRNA sFasTMDel level decreased. Cytomegalovirus infection was accompanied by the raising of mRNA mFas level. The detection frequency of alternative minor forms of mRNA CD95/ Fas was varied widely, suggesting the possibility that the minor forms take part in regulation of Fas-dependent apoptosis. The ratio of mRNA mFas and mRNA sFasTMDel levels reached the minimum values at a heavy current of herpes-virus infection.
Serum level of total and oligomeric sCD95/sFas fractions did not correlate with level of mRNA CD95/Fas, which was elevated at cytomegalovirus infection and at EBV infection and did not change at CPV infection .
Key words: apoptosis, receptors of death, CD95/Fas, mRNA, herpes-virus infection
Представители семейства герпес-вирусов (Herpesviri-dae) широко распространены в разных регионах мира и представляют серьезную угрозу для людей с нарушениями иммунитета. Это делает актуальным всестороннее изучение молекулярных механизмов иммунного ответа при данной инфекции [1, 3].
В регуляции иммунного ответа и апоптоза принимает участие трансмембранный рецептор CD95/Fas. Особенностью экспрессии гена CD95/Fas является высокое разнообразие форм мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Среди них выделяют мембранную (mCD95/mFas), доминирующую растворимую (sFasExo-6Del/sFasTMDel) и несколько минорных растворимых форм, образующихся в результате делеций одного или нескольких экзонов [8, 16]. Как правило, mFas участвует в инициации апоптоза [7]. Функциональная направленность растворимых форм обусловлена их структурной организацией. Мономерная растворимая форма CD95/Fas (sCD95/ sFas) блокирует передачу сигнала смерти, а его олигомерная форма проявляет проапоптотическую активность [11, 18]. Минорные растворимые формы, как полагают, уча-
Караулов Александр Викторович — д-р мед. наук, проф., тел. 8(499)248-05-53, e-mail:karaulov@mtu-net.ru
ствуют в регуляции экспрессии доминирующей растворимой формы, а также блокируют апоптоз [8, 9]. Таким образом, изменение экспрессии гена CD95/Fas может сопровождаться возникновением разных по составу и уровню представленности мРНК спектров, а также флуктуацией сывороточного содержания отличающихся по структуре и функциям фракций sCD95/sFas. Такая ситуация в отношении мембранных и растворимых форм CD95/Fas вносит вклад в изменение баланса сигналов выживания/гибели уже на начальных этапах апоптоза, приводя к модуляции иммунного ответа, и может иметь клиническое значение.
Целью настоящей работы стала оценка экспрессии гена CD95/Fas в клетках периферической крови при герпес-вирусной инфекции (ГВИ) разной этиологии.
Материалы и методы. Обследованы 92 инфицированных герпес-вирусами пациента (33 мужчины и 59 женщин), поступивших на лечение в Городскую инфекционную больницу № 2 г. Нижнего Новгорода. Инфекцию, вызываемую вирусом ветряной оспы (ВВО), выявили у 45 больных, вирусом Эпштейна—Барр (ВЭБ) — у 29, цитомегаловирусом (ЦМВ) — у 10. У 84 пациентов отметили среднетяжелую форму заболевания, у 8 — тяжелую. Осложнения в виде реактивации заболевания и постгерпетической невралгии определили у 23 больных, 69 больных были успешно реабилитированы к
- 189 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2012
нормальной жизнедеятельности. В качестве положительного контроля использовали образцы цельной крови и сыворотки крови 59 здоровых лиц.
Выделение мРНК из клеток периферической крови проводили с использованием фенол-хлороформенной экстракции [12]. Спектр форм мРНК CD95/Fas изучали с помощью метода ОТ-ПЦР [4, 9]. Результаты ОТ-ПЦР оценивали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия.
Сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas определяли иммуноферментным методом. Для определения сывороточного уровня суммарной фракции sCD95/sFas использовали поликлональные антитела (АТ) к мононуклеарным клеткам периферической крови человека и конъюгированные с пероксидазой корня хрена моноклональные АТ ИКО-160 [19]. Олигомерную фракцию sCD95/sFas изучали с помощью очищенных моноклональных АТ ИКО-160 и конъюгированных с пероксидазой моноклональных АТ ИКО-160 [6].
Для дифференциальной детекции уровня представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel, а также мРНК референтного гена Ubc мы разработали метод мультиплексной амплификации мРНК mFas, sFasTMDel и Ubc в одной пробирке. Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл. Реакционная смесь содержала 2,5 мкл 10Х ПЦР-буфера ("Силекс", Москва), 2 мкл раствора дНТФ/dNTF ("Силекс", Москва), 0,5 мкл TaqF-полимеразы (ООО "ИнтерЛабСер-вис", Москва), по 0,5 мкл прямого и обратного праймеров для гена CD95/Fas и референтного гена Ubc (ЗАО "Синтол", Москва), по 0,5 мкл зондов для выявления кДНК mFas и sFasTMDel, а также для детекции кДНК Ubc (ЗАО "Синтол", Москва) и 14,5 мкл бидистиллированной H2O. В дальнейшем к 23 мкл реакционной смеси добавляли 2 мкл кДНК, полученной в ходе реакции обратной транскрипции, и помещали в анализатор нуклеиновых кислот "АНК-32" (ЗАО "Синтол", Москва). В работе применяли мультиплексный "TaqMan"-вариант ПЦР в реальном времени.
Раздельную детекцию уровня представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel проводили с помощью модифицированного метода [5] с использованием прямого FasF (5'-AT-ggAATCATCAAggAATgC-3') и обратного праймеров FasR (5'-CTTTCTgTgCTTTCTgCATg-3'), а также специфических для каждой из форм мРНК CD95/Fas-олигонуклеотидных зондов mFasZ (5'Rox-AgATCTAACTTggggTggCTTTgTCTTC TT-BHQ2-3') [9] и sFasZ (5'-Fam-AgTgCAAAgAggAAgT-gAAgAgAAAggAA-3-BHQ1-3') при следующих температурных условиях: денатурация 94°C — 30 с, отжиг (гибридизация) 55°C — 40 с, элонгация 72°C — 45 с. Общее количество циклов для одного раунда ПЦР составило 50. Каждое измерение проводили в трех повторах. За уровень представленности мРНК принимали номер цикла амплификации, при котором был зарегистрирован экспоненциальный рост интенсивности флюоресценции — пороговый цикл (Ct). Для нормализации количества внесенной матрицы определяли уровень экспрессии референтного гена Ubc с использованием прямого UbcF (5'-CACAgCTAgTTCCgTCgCA-3') и обратного UbcR (5'-gAAgATCTgCATTgTCAAgT-3') праймеров, а также олигонуклеотидного зонда UbcZ (5'-R6G-ATTTgggTC-gCAgTTCTTgTTTgTggAT-BHQ1-3') при тех же температурных условиях, что и для гена CD95/Fas.
Для расчета относительного уровня экспрессии гена CD95/Fas использовали программу REST, находящуюся в свободном доступе в сети Интернет [17]. Уровень экспрессии исследуемых генов рассчитывали относительно контроля, принимая величину экспрессии гена в контроле за единицу. Дополнительно рассчитывался коэффициент (К), представляющий собой отношение уровня представленности мРНК mFas к уровню представленности мРНК sFasTMDel (К = RmFas/ RsFasTMDel). Значения коэффициента К у здоровых лиц принимали за 1.
Результаты статистически обрабатывали с помощью пакета программ Statistica v. 8.0. Сравнение относительных частот качественных признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия %. Для анализа взаимосвязи изучаемых качественных признаков применяли двусторонний тест точного критерия Фишера и критерий Мак-Немара. Для представления исследованных количественных показателей были использованы медиана, 25 и 75 процентили. Межгрупповой анализ количественных показателей проводили с помощью непараметрических критериев Манна—Уитни и Крускала—Уоллиса. Для анализа взаимосвязи изучаемых количественных признаков, а также количественных и качественных признаков между собой использовали критерий ранговой корреляции Спирмена. При анализе качественных и количественных признаков различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение. При ГВИ разной этиологии относительный уровень представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel в клетках периферической крови варьировал (рис. 1). При инфицировании ВВО относительный уровень представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel статистически значимо снижался по сравнению с таковым у здоровых лиц (р = 0,001 и p < 0,001 соответственно). ВЭБ-инфекция сопровождалась статистически значимым понижением уровня представленности только мРНК mFas (р = 0,004). Уровень представленности мРНК sFasTMDel не менялся. В противоположность ВВО-инфекции и ВЭБ-инфекции инфицирование ЦМВ не сопровождалось статистически значимыми изменениями в содержании мРНК mFas и мРНК sFasTMDel.
Значение коэффициента К при инфицировании ВВО составляло 0,26/0,35 = 0,7 отн. ед., при инфицировании ЦМВ — 1,16/0,99 = 1,2 отн. ед., а при ВЭБ-инфекции — 0,37/0,62 = 0,6 отн. ед. Т. е. при ВВО-инфекции и ВЭБ-инфекции значения данного коэффициента у инфицированных лиц были сходны и статистически значимо снижены (р = 0,001 и р < 0,001 соответственно) по сравнению с нормой, а при инфицировании ЦМВ имели тенденцию к повышению (р > 0,05).
В клетках крови у здоровых лиц и лиц, инфицированных герпес-вирусами, с различной частотой выявляли 6 вариантов мРНК исследуемой молекулы (mFas, sFasTMDel, FasExo4Del, FasExo3,4Del, FasExo4,6Del, FasExo3,4,6Del). У здоровых лиц обнаружили 3 спектра форм, в составе
ВВО ЦМВ ВЭБ
Рис. 1. Относительный уровень представленности мРНК mFas (!) и мРНК sFasTMDel (2) в клетках крови при герпесвирусной инфекции разной этиологии.
Здесь и на рис. 2—3: * — статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р < 0,05); значения уровня представленности мРНК CD95/Fas здоровых волонтеров приняты за 1 и изображены в виде горизонтальной линии.
- 190 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Таблица 1
Частота детекции минорных форм мРНК CD95/Fas при герпесвирусной инфекции (%)
Группа n Минорная форма мРНК
FasExo4Del FasExo3,4Del FasExo4,6Del FasExo3,4,6Del
Инфицированные ВВО 45 68,9*, ** 64,4 46,6* о *
ЦМВ-инфицированные 10 80* 70 * О с-- * о 00
ВЭБ-инфицированные 29 55,1*** 62,1*** 72,4* 86,2
Тяжелое течение заболевания 8 80* 70 * о с-- * о 00
Среднетяжелое течение заболевания 84 67,6* 63,9 62,8* 76,1*
С осложнениями 23 46,3 63,0 41* 60,7*
Без осложнений 69 75,3* 68,0* 70,8* 81,3*
Здоровые волонтеры 59 41 49 100 97
Примечание. * статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р < 0,05), ** статистически значимые различия по сравнению с частотой встречаемости мРНК FasExo4,6Del (р < 0,05), *** статистически значимые различия по сравнению с частотой встречаемости мРНК FasExo3,4,6Del (р < 0,05).
которых выявляли 6 ("полный" спектр), 5 или 4 варианта мРНК CD95/Fas. При ГВИ "полный" спектр форм мРНК CD95/Fas отметили у 27 из 92 пациентов. При инфицировании ВВО все 6 форм мРНК CD95/Fas обнаружили у 12 из 45 пациентов, при ВЭБ-инфекции — у 7 из 29, а при инфицировании ЦМВ — у 5 из 10.
У 65 из 92 инфицированных лиц спектр форм мРНК CD95/Fas отличался высокой гетерогенностью и насчитывал 27 вариантов.
В клетках крови мРНК mFas и мРНК sFasTMDel детектировали у всех здоровых лиц. Матричную РНК mFas также встречали у всех больных, а мРНК sFasTMDel — у 81 из 92. Встречаемость минорных форм мРНК CD95/Fas варьировала как у здоровых лиц, так и у больных (табл. 1).
При инфицировании ВВО мРНК FasExo4Del выявляли чаще, чем мРНК FasExo4,6Del (р = 0,037). В отношении других минорных форм статистически значимых различий не обнаружили. При ВЭБ-инфекции мРНК FasExo3,4,6Del детектировали чаще, чем мРНК FasExo-4Del и FasExo3,4Del (р = 0,012 и р = 0,041 соответственно). Матричную РНК FasExo3,4,6Del выявляли чаще при ВЭБ-инфекции, чем при инфицировании ВВО (р = 0,039). При инфицировании ВВО и ЦМВ мРНК FasExo4Del де-тестировали чаще, а мРНК FasExo3,4,6Del выявляли реже, чем у здоровых лиц. По сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц мРНК FasExo4,6Del отмечали реже во всех группах больных (р < 0,001).
Выявленные особенности транскриптома клеток крови лиц, инфицированных герпес-вирусами, сопоставляли с содержанием суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas в сыворотке крови (табл. 2).
При инфицировании ЦМВ и ВЭБ-инфекции сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas статистически значимо превышало норму (р < 0,05). При этом корреляции между уровнем представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel в клетках крови и сывороточным уровнем sCD95/sFas не обнаружили.
У пациентов с тяжелой формой ГВИ уровень мРНК mFas статистически значимо снижался по сравнению с таковым у здоровых лиц (р < 0,001) (рис. 2). При среднетяжелом течении заболевания статистически значимо снижалось содержание мРНК mFas и мРНК sFasTMDel (р < 0,001 и р = 0,003 соответственно). Следует отметить, что при тяжелом течении ГВИ снижение относительного уровня представленности мРНК mFas было более выраженным, чем при среднетяжелом.
Коэффициент К у лиц с тяжелой и среднетяжелой формами ГВИ был статистически значимо снижен и составлял 0,14/0,32 = 0,4 и 0,38/0,50 = 0,8 отн. ед.
(р < 0,001 и Ш = 0,009 соответственно). Кроме того, при тяжелом течении заболевания коэффициент К был в 2 раза ниже, чем при среднетяжелом (р > 0,05).
"Полный" спектр мРНК CD95/Fas обнаружили у 2 из 8 пациентов с тяжелой формой ГВИ и у 25 из 84 пациентов со среднетяжелой. Матричную РНК mFas выявляли в клетках крови у всех обследованных пациентов, а мРНК sFasTMDel детектировали в клетках крови у 6 из 8 с тяжелой формой ГВИ и у 75 из 84 со среднетяжелой. Вне зависимости от тяжести
течения статистически значимых различий в частоте выявления мРНК минорных форм CD95/Fas не выявили (см. табл. 1). При тяжелой и среднетяжелой формах течения ГВИ мРНК FasExo4Del детектировали чаще, чем у здоровых лиц (р = 0,042 и р = 0,002 соответственно). По сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц частота выявления мРНК FasExo4,6Del и мРНК FasExo3,4,6Del статистически значимо снижалась как при тяжелой, так и среднетяжелой формах течения инфекционного процесса (р < 0,001 и р < 0,001, а также р = 0,043 и р < 0,001 соответственно).
Вне зависимости от тяжести течения герпесвирусной инфекции сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas соответствовало норме (см. табл. 2). Кроме того, не выявили статистически значимой корреляции между уровнем представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel в клетках крови и сывороточным уровнем sCD95/sFas.
При осложненном течении ГВИ относительный уровень представленности мРНК mFas был статистически значимо снижен по сравнению с таковым у здоровых лиц (р < 0,001) (рис. 3). Уровень представленности мРНК sFasTMDel имел лишь тенденцию к снижению. При отсутствии осложнений относительный уровень представленности мРНК mFas и мРНК sFasTMDel был статистически значимо снижен по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц (р = 0,01 и р = 0,01 соответственно). В обоих случаях регистрировали снижение коэффициента К. При наличии осложнений значение коэффициента составило 0,22/0,56 = 0,4 отн. ед. (р < 0,001), а при отсут-
Таблица 2
Сывороточное содержание sCD95/sFas при герпесвирусной инфекции (U/ml)
Группа
Сывороточное содержание
суммарный sCD95
олигомерный sCD95
Инфицированные ВВО ЦМВ-инфицированные ВЭБ-инфицированные Тяжелая форма заболевания Среднетяжелая форма заболевания С осложнениями Без осложнений Здоровые волонтеры
Примечание. * — статистически выми волонтерами (р < 0,05).
328.2 (274,3; 414,5) 533,0 (278,6; 424,5)*
523.9 (274,3; 414,5)*
343.3 (273,3; 675,1)
381.4 (289,7; 530,4) 356,6 (294,6; 414,5)
383.9 (285,6; 543,5)
374.5 (286,4; 432,1) значимые различия по
213.3 (174,1; 289,1)
544.4 (186,3; 297,1)*
549.7 (174,1; 289,1)* 194,1 (161,1; 215,9)
245.8 (194,1; 405,9) 192,0 (174,0; 225,8)
254.4 (207,9; 440,3)
250.4 (198,3; 301,4) сравнению со здоро-
- 191 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2012
а б
Рис. 2. Относительный уровень представленности мРНК mFas (1) и мРНК sFasTMDel (2) в клетках крови при среднетяжелой (а) и тяжелой (б) формах герпесвирусной инфекции.
а б
п Median 25-75% ~~г~ Min-Max
Рис. 3. Относительный уровень представленности мРНК mFas (1) и мРНК sFasTMDel (2) в клетках крови при отсутствии (а) или наличии (б) осложнений герпесвирусной инфекции.
ствии осложнений — 0,41/0,46 = 0,9 отн. ед., приближаясь к норме (р > 0,05).
"Полный" спектр форм мРНК CD95/Fas выявили у 6 из 23 пациентов с осложненным течением ГВИ и у 21 из 69 с отсутствием осложнений. Статистически значимых различий в частоте встречаемости отдельных форм мРНК CD95/Fas у больных с осложнениями и без них не наблюдали (см. табл. 1). При наличии осложнений ГВИ мРНК FasExo4,6Del и мРНК FasExo3,4,6Del детектировали реже, чем у здоровых лиц (р < 0,001). По сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц у лиц без осложнений ГВИ мРНК FasExo4Del и мРНК FasExo3,4Del выявляли чаще, а мРНК FasExo4,6Del и мРНК FasExo3,4,6Del — реже ( < 0,05). Сывороточный уровень sCD95/sFas не менялся как при наличии, так и отсутствии осложнений ГВИ (см. табл. 2).
Известно, что активация Т- и В-лимфоцитов сопровождается усилением экспрессии мембранной формы молекулы Fas, участвующей в инициации Fas-зависимого апоптоза [2]. Показано также, что при активации моно-нуклеарных клеток крови повышается количество мРНК mFas, и снижается содержание мРНК sFasTMDel и минорных форм мРНК sFas, образующихся путем альтернативного сплайсинга [15]. Т. е. функциональное состояние
клеток крови ассоциировано с профилем экспрессии гена CD95/Fas.
Ряд авторов показал, что ГВИ разной этиологии приводит к повышению экспрессии CD95/Fas на мембране иммунокомпетентных клеток. При инфицировании ВЭБ наблюдалось повышение экспрессии CD95/Fas на мембране CD4-позитивных Т-клеток, что рассматривалось в качестве возможной причины развития иммуносупрессии in vivo [21]. ВЭБ-инфекция также приводила к гиперэкспрессии CD95/Fas на поверхности В-лимфоцитов, что провоцировало их гибель путем апоптоза лиганднезави-симым путем [13]. Также показано, что инфицирование мононуклеарных клеток периферической крови ВВО и ЦМВ приводило к повышению экспрессии CD95/Fas на мембране CD4- и CDS-положительных лимфоцитов. Наряду с этим возрастала и чувствительность этих клеток к апоптозу [14].
В данной работе мы показали, что при инфицировании ВВО или ВЭБ количество мРНК sFasTMDel превалирует над содержанием мРНК mFas, что приводит к падению коэффициента К. При этом инфицирование ВЭБ характеризовалось снижением только уровня мРНК mFas, а инфицирование ВВО — снижением уровня мРНК mFas и мРНК sFasTMDel. Инфицирование ЦМВ, наоборот, сопровождалось повышением содержания мРНК mFas, мРНК sFasTMDel и коэффициента К.
Вероятно, в ряде случаев не существует прямой взаимосвязи между уровнем представленности мРНК и экспрессией рецептора на мембране клеток, что объясняет кажущееся несоответствие между полученными нами данными о снижении уровня представленности мРНК mFas при инфицировании ВВО и ВЭБ с данными литературы, свидетельствующими о повышении экспрессии CD95/Fas на мембране иммунокомпетентных клеток, инфицированных герпес-вирусами.
Встречаемость минорных форм мРНК CD95/Fas широко варьировала и являлась лабильным показателем. Однако в зависимости от этиологии инфекционного агента некоторые минорные формы мРНК выявляли с наибольшей частотой. Так, при инфицировании ВВО преобладала мРНК формы FasExo4Del, при ВЭБ-инфекции — мРНК FasExo3,4,6Del, а при инфицировании ЦМВ мРНК минорных форм CD95/Fas отмечали с одинаковой частотой. По сравнению с нормой отдельные минорные варианты мРНК CD95/Fas также обнаруживали с большей или меньшей частотой. При инфицировании ВВО и ЦМВ мРНК FasExo4Del детектировали чаще, а мРНК FasExo4,6Del — реже во всех этиологических группах ГВИ. При инфицировании ВВО и ЦМВ частота обнаружения мРНК FasExo3,4,6Del также снижалась. Возможно, что конкретные минорные формы играют важную регуляторную роль в модуляции апоптоза в зависимости от природы инфекционного агента. Выявленные изменения в спектрах и уровне мРНК CD95/Fas в клетках крови не сопровождались изменением сывороточного уровня суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas при инфицировании ВВО, однако при инфицировании ЦМВ и ВЭБ-инфекции он повышался. Результаты соответствуют данным литературы, согласно которым ВЭБ-инфекция сопровождается повышением сывороточного содержания суммарного sCD95/ sFas [20]. В отношении ЦМВ-инфекции данные литературы противоречивы. Ряд авторов связывает повышение сывороточного уровня суммарного sCD95/sFas у пациентов с трансплантатами печени с инфицированием ЦМВ [22]. В то же время известны данные об отсутствии изменений в содержании суммарной фракции sCD95/sFas у лиц, инфицированных ЦМВ [10]. Данные об изменениях в сывороточном содержании суммарной фракции sCD95/sFas при ВВО-инфекции, а также олигомерной фракции при инфицировании ВВО, ВЭБ и ЦМВ в доступной литера-
- 192 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
туре отсутствуют. Можно предположить, что повышение сывороточного уровня sCD95/sFas может быть использовано вирусом для ухода от воздействия со стороны иммунной системы организма-хозяина. Вероятно, в основе такого механизма лежит бифункциональная роль sCD95/ sFas, заключающаяся в ингибировании апоптоза инфицированных вирусом клеток за счет мономерной формы белка и цитотоксической активности олигомерного варианта белка, инициирующего апоптоз иммунокомпетентных клеток организма-хозяина.
Соотношение уровня мРНК mFas и содержания мРНК sFasTMDel достигало минимальных значений при тяжелом течении ГВИ. При среднетяжелой форме такое снижение было менее выраженным. Вне зависимости от тяжести течения ГВИ встречаемость мРНК FasExo4Del повышалась, а встречаемость мРНК FasExo4,6Del и мРНК FasExo3,4,6Del снижалась. У больных без осложнений уровень представленности мРНК mFas и мРНК sFasT-MDel, а также коэффициент К соответствовали норме, а при наличии осложнений обнаруживали их снижение в 2,5 раза по сравнению с нормой. Кроме того, при наличии осложнений мРНК FasExo4,6Del и мРНК FasExo3,4,6Del выявляли реже, чем у здоровых лиц. При отсутствии осложнений мРНК FasExo4,6Del и мРНК FasExo3,4,6Del также обнаруживали с меньшей частотой, а мРНК FasExo-4Del и мРНК FasExo3,4Del детектировали с большей частотой по сравнению с нормой. Таким образом, тяжелое течение ГВИ и наличие осложнений характеризуются падением количества мРНК CD95/Fas, коэффициента К и снижением частоты выявления отдельных вариантов мРНК CD95/Fas. Оно не ассоциировано с изменениями в сывороточном содержании суммарных и олигомерных фракций sCD95/sFas.
Можно заключить, что при герпес-вирусных заболеваниях разной этиологии происходят изменения в спектрах и количестве мРНК CD95/Fas в клетках крови, а также изменения в сывороточном содержании суммарной и олигомерной фракций sCD95/sFas. В целом они направлены на модуляцию сигнальных событий апоптоза и сдерживание противовирусного иммунного ответа, что может быть звеном патогенеза, которое обеспечивает пожизненное сохранение герпес-вирусов и их циркуляцию в организме хозяина. Полученные результаты могут быть использованы в мониторинге течения ГВИ.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009—2013 гг. и РФФИ (проект № 11-04-97088р_поволжье_а).
ЛИТЕРАТУРА
1. Баринский И. Ф., Гребенюк В. Н., Каспаров А. А., Шубладзе А. К. Герпес (этиология, диагностика, лечение). — М., 1986.
2. Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. Иммунологические проблемы апоптоза. — М., 2002.
3. Коломиец А. Г. Генерализованная герпетическая инфекция: факты и концепция. — Минск, 1992.
4. Новиков Д. В., Новиков В. В. Новый метод детекции мРНК мембранной и доминирующей растворимой формы Fas-протеина // Материалы II Московского международного конгресса "Биотехнология: Состояние и перспективы развития". — М., 2003. — С. 71—72.
5. НовиковД. В., ЛебедевМ. Ю., Уткин О. В. и др. Метод сравнительной оценки экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas антигена с использованием ПЦР в реальном времени // Материалы III Московского
международного конгресса "Биотехнология: Состояние и перспективы развития". — М., 2005. — С. 195—195.
6. Птицына Ю. С., Кравченко Г. А., Новиков В. В. и др. Уровень сывороточного CD95 олигомера у наркоманов, больных хроническим вирусным гепатитом С // Вестн. Нижегородского ГУ Сер.: Биология. — 2004. — Вып. 3. — С. 211—213.
7. Рыжов С. В., Новиков В. В. Молекулярные механизмы апо-птотических процессов // Рос. биотер. журн. — 2002. — Т. 1. — С. 5—11.
8. Уткин О. В., Новиков В. В. Регуляция апоптоза с помощью альтернативного сплайсинга матричной РНК // Рос. биотер. журн. — 2007. — Т. 6. — С. 13—20.
9. Уткин О. В., ЛебедевМ. Ю., НовиковД. В. и др. Спектр мРНК Fas-антигена мононуклеарных клеток крови и сывороточное содержание растворимого Fas у тяжелообожженных больных // Иммунология. — 2008. — Т. 29, № 6. — С. 362—365.
10. Шломина И. А., Вязьмина Е. С., Новиков В. В. и др. Определение уровня растворимых CD38-, CD50-, CD95-антигенов и растворимого гетеродимера "Р2-микрогаобулин-НЬЛ антигены I класса" при цитомегаловирусной инфекции и гриппе // Вестн. Нижегородского ГУ им. Н. И. Лобачевского. Сер.: Биология. — 2001. — Вып. 1. — № 2. — С. 225—230.
11. Cheng J., Zhou I., Liu C. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by soluble from of the Fas molecule // Science. — 1994. — Vol. 263. — P. 1759—1762.
12. Chomszynskii P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyonate — phenol-chloroform extraction // Analyt. Biochem. — 1987. — Vol. 162. — P. 156—159.
13. Clorennec C. L., Ouk T.-S., Ibtissam Y.-M. et al. Molecular basis of cytotoxicity of Epstein-Barr Virus (EBV) Latent Membrane Protein 1 (LMP1) in EBV Latency IiI B cells: LMP1 induces Type II ligand-Independent autoactivation of CD95/Fas with caspase 8-mediated apoptosis // J. Virol. — 2008. — Vol. 82, N 13. — P. 6721—6733.
14. ItoM., WatanabeM., Ihara T. et al. Fas antigen and bcl-2 expression on lymphocytes cultured with cytomegalovirus and varicella-zoster virus antigen // Cell. Immunol. — 1995. — Vol. 160, N 2. — P. 173—177.
15. Liu C., Cheng J., Mountz J. D. Differential expression of human Fas mRNA species upon peripheral blood mononuclear cell activation // J. Biochem. — 1995. — Vol. 310. — P. 957—963.
16. Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-terminal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. — 1996. — Vol. 156. — P. 4622—4630.
17. Pfaffl M. W., Horgan G. W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR // Nucl. Acids Res. — 2002. — Vol. 30, N 9. — P 1—10.
18. Proussakova O. V., Rabaya N. A., Moshnikova A. B. et al. Oligomerization of Soluble Fas Antigen Induces Its Cytotoxicity // J. Biol. Chem. — 2002. — Vol. 278. — P. 36 236—36 241.
19. Ptitsyna Yu. S., Bornyakova L. A., Baryshnikov A. Yu. et al. A soluble form of Fas/Apo-1 (CD95) antigen in the serum of viral hepatitis patients // Int. J. Immunorehab. — 1999. — Vol. 4. — P. 110—111.
20. Sato T., Hirasawa A., Kawabuchi Y. et al. Cellular expressions and serum concentrations of Fas ligand and Fas receptor in patients with infectious mononucleosis // Int. J. Hematol. — 2000. — Vol. 72, N 3. — P. 329—336.
21. Tanner J. E., Alfieri C. Epstein-Barr virus induces Fas (CD95) in T cells and Fas ligand in B cells leading to T-cell apoptosis // Blood. — 1999. — Vol. 94, N 10. — P. 3439—3447.
22. Wang Y, Liu Y, Zhang Y. et al. The role of the CD95, CD38 and TGFbeta1 during active human cytomegalovirus infection in liver transplantation // Cytokine. — 2006. — Vol. 35. — P. 193—199.
Поступила 10.02.12
- 193 -
