CC BY
35
УДК Б1Б.523:Б1Б.988:578.825
ИНФОРМАТИВНОСТЬ ОЦЕНКИ СПЕКТРОВ ФОРМ МАТРИЧНЫХ РНК РЕЦЕПТОРА CD95/FAS ПРИ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
О.В. Уткин12, О.А. Червякова2, Г.А. Кравченко2, Т.А. Свинцова3,
Д.М. Собчак3, О.В. Корочкина3, В.В. Новиков12,
1OrVH «Hi/іжегоролский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. ИИ Блохиной»,
2ГОУ ВПО «Hижегородский государственный университет им. НИ. Лобачевского»,
3ГОУ ВПО «Hижегородская государственная медицинская академия»
Уткин Олег Владимирович - e-mail: [email protected]
Данная работа посвящена характеристике спектров форм мРНК CD95/Fas в иммунокомпетентных клетках крови при герпесвирусной инфекции разной этиологии. Выявлено, что минорные формы мРНК CD95/Fas встречаются приблизительно с одинаковой частотой при герпесвирусной инфекции, вызванной ВВО, ЦМВ и ВЭБ. Не обнаружено зависимости экспрессии спектров форм мРНК CD95/Fas с тяжестью заболевания. Выявлено, что «полный» спектр форм мРНК CD95/Fas детектировался в клетках крови у пациентов с хроническим или латентным течением герпесвирусной инфекции. Показано уменьшение числа форм мРНК CD95/Fas в клетках крови у пациентов с первичной герпесвирусной инфекцией и при реактивации инфекционного процесса.
Ключевые слова: герпесвирусная инфекция, апоптоз, CD95/Fas, сплайсинг.
This work is devoted to characteristics of spectrum of forms mRNA CD95/Fas in immunocompetent blood cells at herpesvirus infection of different etiology. Has been revealed, that minor forms of mRNA CD95/Fas occurred approximately with the same frequency at herpesvirus infection caused VZV, CMV and EBV. We didn't revealed any dependence between expression of spectrum of forms mRNA CD95/ Fas and infection difficulty. We showed, that «full» spectrum of forms mRNA CD95/Fas has been detected in blood cells in patients with chronical or latent course of herpesvirus infection. Has been shown decreasing of amount of forms mRNA CD95/Fas in blood cells in patients with primary herpesvirus infection and at reactivation of infectious process.
Key words: herpesvirus infection, apoptosis, CD95/Fas, splicing.
Семейство герпесвирусов (Herpesviridae) насчитывает более сотни представителей, из которых для человека патогенны 8 типов. Они широко распространены среди населения в различных регионах мира и представляют серьезную угрозу для людей с нарушениями функционирования иммунной системы. В этом случае часто развиваются генерализованные формы заболеваний с поражением различных органов и систем, нередко заканчивающиеся летальным исходом. Развитие герпесвирусной инфекции часто сопровождается возникновением иммунодефицитных состояний и онкологических заболеваний, обусловленных репродукцией вируса в иммунокомпетентных клетках организма-хозяина и их трансформацией [1, 2].
Программируемая гибель клеток (апоптоз) является важным защитным механизмом, направленным на элиминацию вирус-инфицированных клеток. Герпесвирусы используют разнообразные стратегии, позволяющие модулировать сигнальные пути апоптоза и ускользать из-под иммунологического контроля со стороны организма-хозяина [3, 4, 5].
Одним из вариантов триггерных событий апоптоза является взаимодействие рецептора CD95/Fas со своим лигандом.
Рецептор CD95/Fas широко представлен на мембране иммунокомпетентных и других типов клеток [6]. Для него обнаружено множество вариантов, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Среди них выделяют мембранные и растворимые молекулы, выполняющие разные функции в клетке [7, 8, 9]. В составе пула растворимых форм CD95/Fas определены доминирующая и минорные варианты (содержатся в клетках в относительно высокой концентрации и следовых количествах, соответственно). Предполагают, что минорные формы участвуют в регуляции экспрессии доминирующей формы. Мембранные формы CD95/Fas, как правило, участвуют в передаче цитотоксиче-ского сигнала внутрь клетки, инициируя апоптоз [10]. Функциональная направленность растворимых форм обусловлена их структурной организацией. Например, мономерная растворимая форма CD95/Fas блокирует передачу сигнала смерти, а его олигомерная форма проявляет проа-поптотическую активность [11]. Для CD95/Fas показано изменение профиля экспрессии мембранных и растворимых вариантов матричных РНК (мРНК) в зависимости от функционального статуса клеток. Выявлено, что нестимулированные
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
мононуклеарные клетки периферической крови здоровых волонтеров экспрессируют мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм CD95/Fas на одном уровне. Минорные варианты мРНК CD95/Fas экспрессируются в клетках на низком уровне и в различных сочетаниях. Активация клеток сопровождается уменьшением числа минорных растворимых вариантов и повышением уровня экспрессии мембранной формы молекулы [10]. Данные о спектрах форм мРНК CD95/Fas в иммунокомпетентных клетках крови и об информативности их оценки при герпесвирусной инфекции в литературе отсутствуют.
Целью работы явилась характеристика спектров форм мРНК CD95/Fas в иммунокомпетентных клетках крови при герпесвирусной инфекции разной этиологии.
Материалы и методы
Обследован 61 пациент (23 мужчины и 38 женщин), инфицированный представителями семейства Herpesviridae, поступивших на лечение в Городскую инфекционную больницу № 2 Нижнего Новгорода. Инфекция, вызываемая вирусом ветряной оспы (ВВО), регистрировалась у 31 пациента, цитомегаловирусом (ЦМВ) - у 9 пациентов, вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) - у 21 пациента. Материалом исследования послужила периферическая кровь инфицированных лиц. Объектом исследования явилась мРНК опосредующего апоптоз CD95/Fas рецептора.
Выделение мРНК из клеток проводили с использованием фенол-хлороформенной экстракции. Оценку спектра форм мРНК рецептора CD95/Fas проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Реакцию обратной транскрипции ^ проводили с использованием праймера GR-20 (5'-GGATTTAAGGTTGGAGATT-3') и обратной транскриптазы M-MuLV («Promega», USA). После реакции обратной транскрипции пробу разводили в 50 мкл воды, свободной от нуклеаз. 2 мкл полученной смеси использовали в ПЦР.
Первый раунд проводили по программе: 35 циклов (94°С - 30", 55°С - 30", 72°С - 40"). Для этого использовали комбинацию праймеров GR-20/0F (0F:5'-CGGAGGATTGCTCAAC AACC-3'). После окончания первого раунда 2 мкл продукта реакции переносили в реакционную смесь для второго раунда амплификации в качестве матрицы, чтобы детектировать растворимые и мембранную формы мРНК CD95/Fas. Для этого были использованы 1F/B (1F:5'-ATCCT GGGCATCTGGACCCT-3'; В:5'-TTCCTTTCTCTTCACTTCC-3') и 1F/A (A:5'-TTCCTTTCTCTTCACCCAA-3') комбинации праймеров, соответственно. Второй раунд проводили по программе: 30 циклов (94°С - 30", 55°С - 30", 72° - 30"). Результаты ОТ-ПЦР оценивали методом электрофореза в 1.5% агароз-w ном геле.
Для определения нуклеотидной последовательности
фрагменты кДНК вырезали из агарозного геля с последующей элюцией с использованием набора DNA Extraction Kit («Fermentas», Латвия) согласно рекомендациям производителя. Реакцию терминирования дидезоксинуклеозидтри-фосфатами, меченными флюоресцентными красителями, проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», USA). К 5 мкл ДНК добавляли 1 мкл BigDye Terminator, 2 мкл буфера и 0.5 мкл праймера, инкубировали при 94°С в течение 5 мин и проводили 25 циклов ПЦР по следующей программе: 94°С - 10",
50°С - 10", 62° - 4’. Реакционную смесь переосаждали изопропанолом, разводили в 20 мкл деионизованного форма-мида и прогревали при 94°С в течение 5 мин. Затем проводили анализ первичной нуклеотидной последовательности одноцепочечной ДНК с использованием генетического анализатора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 6.0 с использованием точного критерия Фишера.
Результаты исследования
В иммунокомпетентных клетках периферической крови пациентов с герпесвирусной инфекцией выявлено 20 различных спектров форм мРНК CD95/Fas. В составе спектров выявлялись мРНК мембранной (mFas), доминирующей растворимой (FasExo6Del/FasTMDel) и четырех минорных форм, образующихся в результате единичных или комбинированных делеций экзонов (кодирующих участков) в процессе альтернативного сплайсинга (FasExo4Del; FasExo3,4Del; FasExo4,6Del; FasExo3,4,6Del). Эти 6 форм мРНК CD95/Fas в различных сочетаниях ранее были обнаружены нами и зарубежными исследователями в клетках крови здоровых волонтеров [7, 10, 12]. Вероятно, они участвуют в модуляции сигнальных событий апоптоза как в нормальных, так и инфицированных вирусом клетках.
При герпесвирусной инфекции мРНК mFas была обнаружена в 100% (61/61) случаев, а мРНК FasTMDel в 87% образцов (53/61). Частота встречаемости мРНК минорных вариантов CD95/Fas варьировала. Взаимосвязь отсутствия экспрессии мРНК FasTMDel с наличием в клетках крови разных вариантов мРНК минорных форм CD95/Fas выявить не удалось. Таким образом, вопрос об участии минорных форм CD95/Fas в регуляции экспрессии доминирующего варианта молекулы при герпесвирусной инфекции остается открытым.
Выявлено, что минорные формы мРНК CD95/Fas встречаются приблизительно с одинаковой частотой при герпесвирусной инфекции, вызванной ВВО, ЦМВ и ВЭБ (как указано в таблице). Можно предположить, что эти минорные варианты CD95/Fas в равной степени могут участвовать в модуляции сигнальных событий апоптоза при герпесвирусной инфекции.
ТАБЛИЦА.
Частота встречаемости минорных форм мРНК CD95/Fas при герпесвирусной инфекции
Инфекция FasExo4Del, % FasExo3,4Del, % FasExo4,6Del, % FasExo3,4,6Del, %
ВВО 64,5 67,7 51,6 64,5
ЦМВ 77,8 66,7 66,7 66,7
ВЭБ 66,7 61,9 61,9 66,7
Примечание: * - различия статистически незначимы.
Не обнаружено зависимости экспрессии спектров форм мРНК CD95/Fas и отдельных минорных вариантов мРНК с тяжестью заболевания. «Полный» спектр, включающий 6 вариантов мРНК CD95/Fas, детектировался в 21% (13/61) исследованных образцов крови у пациентов с хроническим или латентным течением герпесвирусной инфекции. В 51% (31/61) образцов крови у пациентов с первичной герпесвирусной инфекцией спектр форм мРНК CD95/Fas характеризовался отсутствием хотя бы одного из минорных вариантов
молекулы. Реактивация инфекционного процесса (переход к
литической форме) наблюдалась в 28% случаев (17/61) и сопровождалась наиболее выраженным уменьшением числа минорных форм мРНК CD95/Fas вплоть до их полного исчезновения.
Заключение
Таким образом, разные варианты течения герпесвирусной инфекции обусловливают модуляцию функционального статуса иммунокомпетентных клеток крови, что сопровождается изменением профиля экспрессии рецептора CD95/ Fas. Анализ спектров форм мРНК CD95/Fas является информативным для оценки функционального состояния иммунокомпетентных клеток при герпесвирусной инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баринский И.Ф., Гребенюк В.Н., Каспаров А.А., Шубладзе А.К. Герпес (этиология, диагностика, лечение). М. 1986. 272 с.
2.Коломиец А.Г. Генерализованная герпетическая инфекция: факты и концепция. Минск. 1992. 183 с.
3.Benedict C.A., Norris P.S., Ware C.F. To kill or be killed: viral evasion of apoptosis. Nature Immunology. 2002. № 3. Р. 1013-1018.
4. Hay S., Kannourakis G. A time to kill: viral manipulation of the cell death program. J. Genetic Virology. 2002. № 83. Р. 1547-1564.
5.O'Brien V. Viruses and apoptosis. J. Genetic Virology. 1998. № 79. Р. 1833-1845.
6. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических
процессов. Российский биотерапевтический журнал. 2002. № 1. С. 5-11.
7. Уткин О.В., Новиков В.В. Регуляция апоптоза с помощью альтернативного сплайсинга матричной РНК. Российский биотерапевтический журнал. 2007. № 6. С. 13-20.
8. Cheng J., Zhou I., Liu C. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by soluble form of the Fas molecule. Science. 1994. № 263. Р. 1759-1762.
9.Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-terminal domain shared by Fas/ Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro. J. Immunology. 1996. № 156. Р. 4622-4630.
10.Liu C., Cheng J., Mountz J.D. Differential expression of human Fas mRNA species upon peripheral blood mononuclear cell activation. J. Biochemistry. 1995. № 310. Р. 957-963.
11. Proussakova O.V., Rabaya N.A., Moshnikova A.B. et al. Oligomerization of Soluble Fas Antigen Induces Its Cytotoxicity. J. Biological Chemistry. 2003. № 278. Р. 36236-36241.
12. Уткин О.В., Лебедев М.Ю., Новиков Д.В. и др. Спектр мРНК Fas-антигена мононуклеарных клеток крови и сывороточное содержание растворимого Fas у тяжелообожженных больных. Иммунология. 2008. № 29. С. 362-365.
Ш
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
