CC BY
24
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Аутоиммунные заболевания Autoimmune diseases
моноцитах периферической крови проводилось методом двухцветной проточной цитофлуориметрии с использованием диагностических наборов HyCultbiotechnology (Нидерланды). Для удаления эритроцитов пробоподго-товку проводили с использованием лизирующего раствора OptiLiseC фирмы Immunotex (Франция). Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре BECKMAN COULTER EPICS XL-II (США), используя стандартные протоколы. Определение аллельных вариантов генов проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом тест-системами ГосНИИгенетика (Москва). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.
Было установлено, что у пациентов I и II групп по сравнению с контрольной группой отмечались выраженные изменения показателей врожденного иммунитета в виде статистически значимого повышения экспрессии CD14+CD282+ на моноцитах (72,4±8,1% и 60,8±4,4% против 30,7±10,8% соответственно, р < 0,05). При анализе частоты полиморфизма генов TLR-2 обнаружено, что в I группе по сравнению с контрольной и II группой частота генотипа Arg/Arg встречалась достоверно чаще (68,7% против 25,6 и 24,5% соответственно, р < 0,05), следовательно, у носителей аллеля Arg гена TLR-2 риск развития микроангиопатии при сахарном диабете выше, а генотип Arg753Gly, вероятно, имеет протективный эффект.
Таким образом, увеличение экспрессии TLR-2, наличие полиморфизма кодирующих генов, могут приводить к каскаду внутриклеточных сигнальных событий, с последующей стимуляцией транскрипции многих провос-палительных регуляторных субстанций, которые, в свою очередь, способствуют развитию диабетической микро-ангиопатии.
ВЫЯВЛЕНИЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ЦЕЛИАКИИ ПРИ РАЗНЫХ ГЕНОТИПАХ
Малкова А.М., Будкова А.И.
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Целиакия — хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся поражением эпителия тонкой кишки в результате иммунного ответа организма на дезаминированный глиадин. Согласно рекомендациям ESPGHAN 2012 диагноз целиакия подтверждается с помощью серологической диагностики специфичных антител, гистологического исследования тонкой кишки, выявления HLA DQ2/ DQ8 генотипов.
Цель. Определить достоверность встречаемости серологических маркеров целиакии при разных генотипах.
Материалы и методы. В качестве материала для исследования использовались образцы венозной крови 105 обследуемых лиц. Антитела к человеческой тканевой трансглутаминазе 2 типа и дезаминированному пептиду глиадину IgG определялись методом ИФА, антитела к эн-домизию IgA методом нРИФ.
Для определения генотипа HLA DQ2/DQ8 обследуемых применялся метод ПЦР real time.
Результаты. Из 105 обследуемых у 56 % (59/105) были выявлены специфичные для целиакии HLA- DQ генотипы. Среди них преобладают аллельные формы HLA-DQ2.5; HLA-DQ2.2 - 25% (13/59). Частота генотипа HLA-DQ2.5, как и HLA-DQ8 составила 23,1% (12/59), HLA-DQ8;HLA-DQ2.2 9,6% (5/59). Повышенные титры специфичных антител чаще всего наблюдаются при генотипе HLA-DQ2.5 - 25% (3/12).
Достоверно встречаемость повышенных титров специфичных антител выше у лиц с положительным генотипом.
Заключение. Исследование показало, что наиболее часто встречаемыми генотипами среди обследуемых являются аллельные формы HLA-DQ2.5; HLA-DQ2.2 , HLA-DQ8 и HLA-DQ2.5. При этом у лиц с генотипом HLA-DQ2.5 серологические маркеры целиакии выявляются чаще всего.
Поскольку была выявлена статистически значимая разница при анализе результатов серологической диагностики на антитела к тканевой трансглютаминазе, эндомизию и генотипирования, можно говорить об оправданности использования тестов на выявление повышенных титров именно этих антител для диагностики целиакии.
ЭКСПРЕССИЯ АКТИВАЦИОННЫХ МАРКЕРОВ Т-ХЕЛПЕРАМИ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИМИ Т-КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДЕТЕЙ С АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ МИТОГЕНОМ IN VITRO
Пашнина И.А.
Областная детская клиническая больница № 1, Екатеринбург, Россия
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия
Исследование экспрессии маркеров активации лимфоцитов широко используется для оценки функционального состояния этих клеток. При этом стимуляция митогенами in vitro позволяет исследовать общую реактивность той или иной клеточной популяции. Наиболее удобными объектами исследования при стимуляции являются рецепторы лимфоцитов, экспрессия которых увеличивается за короткий промежуток времени, в частности CD25, CD38, CD69. Увеличение экспрессии этих молекул можно зафиксировать с помощью проточной цитометрии уже через 4-24 часа после индукции. Целью настоящей работы явилось исследование спонтанной и стимулированной экспрессии CD25, CD38, CD69 у детей с аутоиммунными (ревматическими) заболеваниями соединительной ткани.
Обследованы дети 6-17 лет с ревматическими заболеваниями в стадии активности: ювенильным идиопа-тическим артритом (ЮИА, n = 75), ювенильной склеродермией (ЮСД, n = 16), системной красной волчанкой (СКВ, n = 15), а также условно здоровые дети (контроль, n = 32). Образцы цельной периферической крови разводили глутаминсодержащей средой RPMI-1640 (Пан-Эко, Россия) в соотношении 1:9 и инкубировали при 37 °С, 5% СО2 в течение 4-х часов (оценка экспрессии CD69) или 4-х часов (оценка экспрессии CD25, CD38) без стимулятора
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
и при стимуляции фитогемагглютинином (ФГА, Sigma) в конечной концентрации 20 мкг/мл. Подсчет количества CD25, CD38- и СD69-позитивных Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD3+CD4+) и цитотоксических Т-клеток (CD3+CD8+) проведен методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, USA). Для статистического анализа данных использовали непараметрический критерий Манна—Уитни.
Выявлено, что после инкубации без стимулятора количество CD69-позитивных Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток у детей с аутоиммунной патологией не отличалось от условно здоровых детей. При индукции ФГА доля клеток, экспрессировавших CD69, во всех субпопуляциях при всех заболеваниях была ниже, чем в контрольной группе (p < 0,05). Количество CD38-позитивных клеток среди CD3+, CD3+CD4+ и CD3+CD8+ у всех детей с ревматическими заболеваниями было снижено по сравнению с контролем, как в спонтанном варианте, так и при стимуляции митогеном (p < 0,05). Количество цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрес-сировавших CD25, в группах больных не отличалось от контрольного уровня при обоих вариантах инкубации. Спонтанное и стимулированное количество CD3+CD25+ и CD3+CD4+CD25+ у больных с ЮИА и ЮСД было значительно ниже, чем у условно здоровых детей (p < 0,05), у больных с СКВ различия наблюдались на уровне тенденции (p < 0,1).
Таким образом, количество CD3+CD4+CD25+ и CD3+CD8+CD25+ при воздействии мутагена изменялось несхожим образом. Следует отметить, что большинство CD25-позитивных Т-хелперов составляют популяцию регуляторных Т-клеток, обладающих су-прессорными свойствами (Sakaguchi S., 2011), тогда как CD3+CD8+CD25+ могут быть в большей степени представлены активированными эффекторами. Ранее нами было показано, что изменение количества регуляторных Т-клеток CD3+CD4+CD25+CD127low/neg и активированных Т-хелперов CD3+CD4+CD25+CD127+, в совокупности составляющих субпопуляцию CD25-позитивных Т-хелперов, подчиняется различным закономерностям (Пашнина И.А., 2014). Учитывая функциональную разнородность субпопуляции CD3+CD25+, представляется целесообразным оценивать экспрессию CD25 отдельно на Т-хелперах (с разделением на регуляторные Т-клетки и активированные Т-хелперы) и цитотоксических Т-клетках. При этом общие закономерности изменения экспрессии CD38 и CD69 на Т-хелперах и цитотоксиче-ских Т-клетках совпадали, что может указывать на возможность определения совокупной экспрессии этих маркеров на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro у детей с аутоиммунной патологией соединительной ткани. Однако для подтверждения этого заключения необходимо понимание функциональной роли CD38- и CD69-позитивных Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, которая, несмотря на многочисленные публикации по этой теме, остается пока спорной.
Автор выражает искреннюю благодарность врачам Областной детской клинической больницы № 1 Козловой Е.С. и Скоробогатовой О.В. за подбор пациентов для исследования.
РОЛЬ МЕТАБОЛИЗМА ПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ В ПРОГНОЗЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ВЗК У ДЕТЕЙ
Петричук С.В.1, Мирошкина Л.В. 1, Курбатова О.В.2, Закиров Р.Ш.1, Радыгина Т.В.1, Самохина И.В.1, Цимбалова Е.Г.1
1ФГБНУ «Научный центр здоровья детей», Москва, Россия
2 ФГБНУ «Научный центр акушерства, гинекологии
и перинатологии» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
3 ФГБОУВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет» им. Н.Н. Пирогова, Москва, Россия
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) — хронические, рецидивирующие не инфекционные заболевания ЖКТ, приводящие к необратимому нарушению его структуры и функции. Развитие хронического воспаления при ВЗК происходит в результате срыва толерантности иммунной системы к микробиоте кишечника под действием триггерных факторов. Выявление высоких концентрации TNFa в биоптатах кишечника пациентов с ВЗК позволило разработать патогенетическую стратегию лечения — биологическую терапию (БТ), включающую применение моноклональных антител, блокирующих TNFa. Применение БТ при ВЗК позволило увеличить долю пациентов, достигающих стабильной ремиссии, однако, в виду потери ответа к препарату у трети пациентов не наблюдается стойкого эффекта от БТ. Показано, что эффективность БТ определяется исходным уровнем TNFa в плазме крови, а также содержанием ТЫ7-лимфоцитов (ТЫ7-лф), активированных Т-хелперов (act-Th) и регуляторных Т-клеток (Treg). Известно, что эффекторные функции лимфоцитов (пролиферация, дифференцировка) напрямую зависят от интенсивности их метаболизма.
Цель. Оценить диагностическую значимость показателей метаболической активности популяций лимфоцитов в прогнозе эффективности инфликсимаба.
Материалы и методы. Обследовано 136 детей в возрасте 10-18 лет с ВЗК (БК-87 пациентов, ЯК-49 пациентов). Пациенты наблюдались в динамике заболевания: до назначения БТ и через 1 год БТ. В зависимости от эффективности БТ пациенты были распределены на 2 группы: со стойким положительным эффектом (группа 1, n = 44) и с нестойким эффектом БТ (группа 2, n = 92). Интенсивность энергообмена популяций лф оценивали по активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) — фермента цикла Кребса и II этапа дыхательной цепи митохондрий. Определение активности СДГ в основных и малых популяциях лимфоцитов периферической крови проводили на проточном цитометре CYTOMICS FC500 иммуноцитохими-ческим методом. Статистическая обработка выполнена с помощью пакета Statistica 6.0, ROC-анализ выполнялся с использованием программы SPSS 16.0
Результаты. До назначения БТ активность СДГ в популяциях Т-лф, Т-хелперах, В-лф и Treg у пациентов в группе 1 была достоверно выше, чем в группе 2, причем наибольшие отличия наблюдались в популяции Treg (AUC = 0,820). Через год БТ у пациентов группы 1 высокая активность СДГ сохранялась только в популяциях Т-хелперов и в Treg. ROC-анализ данных выявил, что активность СДГ в популяциях Treg-лф, Т-хелперах и В1-
