31Экспериментальные модели для оценки моноклональных антител при
заболеваниях органов дыхания
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор, ORCID 0000-00033176-6386, В.Г. Макаров, доктор медицинских наук, заместитель директора по науке, ORCID 0000-0002-2447-7888 Санкт-Петербургский институт фармации 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п.
Кузьмоловский, ул. Заводская, 3, к. 245 E-mail: [email protected]
Резюме. В настоящее время отмечается рост заболеваемости болезнями легких с развитием резистентности к глюкокортикостероидам. В связи с этим ученые обратили внимание на использование моноклональных антител (МАТ) для расширения возможностей лечения бронхиальной астмы (БА), хронической обструктивной болезни легких и других заболеваний. Исследования о применении МАТ при заболеваниях органов дыхания появились совсем недавно; их очень мало, хотя они обладают огромным потенциалом в лечении таких пациентов.
Для оценки новых МАТ и внедрения их в клиническую практику для лечения болезней органов дыхания необходимы углубленные экспериментальные исследования на животных. При этом важнейшее значение приобретают адекватные поставленным задачам модели. Моделирование заболеваний органов дыхания у животных проводится путем внутрибрюшинного или подкожного введения овальбумина с последующим его интраназальным введением или распылением (БА), а также путем воздействия сигаретного дыма (ХОБЛ). Дозы вводимого овальбумина варьируют в зависимости от вида используемых животных от 10 мкг у мышей до 10 мг у кроликов. Для интраназального введения и для распыления в специальных камерах используют 1-4% аэрозоль овальбумина.
Чаще, особенно для предварительной оценки лекарственных средств, в том числе и МАТ, при моделировании болезней органов дыхания используются мыши диких пород - C57BL/6 и BALB/c. Однако для подтверждения полученных на мышах данных большинство исследователей рекомендуют использовать более крупных и близких человеку животных (морских свинок, кроликов, мини-свиней, обезьян). При изучении влияния МАТ на состояние дыхательных путей, наряду с такими стандартными для МАТ путями введения, как внутривенный и подкожный, важно исследование ингаляционного пути.
Для оценки эффективности исследуемых МАТ при заболеваниях дыхательных путей рекомендуется анализировать такие показатели, как: резистентность бронхов и трахеи, содержание эозинофилов в крови и
лаваже легких, содержание воспалительных медиаторов и цитокинов (CD4+ и CD25+, IL-5, TNF-a, NF-kB, NO, IL-8, IL-2, IL-6, IL-13 и других), а также кортикостерона в плазме крови, гистамина в лаваже легких, гистологической картины трахеи и бронхов.
Ключевые слова: моноклональные антитела, заболевания органов дыхания, экспериментальные модели.
Для цитирования: Макарова М.Н., Макаров В.Г. Экспериментальные модели для оценки моноклональных антител при заболеваниях органов дыхания. Лабораторные животные для научных исследований. 2019; 4 https://doi.org/10/29926/2618723X-2019-04-05
Preclinical study of monoclonal antibodies (MAT). Report 1: experimental models for the assessment of MAT in respiratory diseases
M. Makarova, V. Makarov
St. Petersburg Institute of Pharmacy 188663, Russia, Leningradskaya region, Vsevolozhskiy district, Kuzmolovskiy, st. Zavodskaya, 3. b. 245
Abstract. Currently, there are more and more patients with lung diseases who develop resistance to corticosteroids. In this regard, the scientists drew attention to the possibility of using monoclonal antibodies (MAB) to enhance the treatment of bronchial asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and other diseases. Studies on the use of MAT in respiratory diseases have appeared recently and are quite rare, although they have great potential in the treatment of such patients.
In-depth experimental studies on animals are needed to evaluate new MAB and introduce them into clinical practice of treatment of respiratory diseases. At the same time, models adequate to the tasks are of paramount importance. Modeling of respiratory diseases in animals is carried out by intraperitoneal or subcutaneous administration of ovalbumin followed by its intranasal administration or spraying (bronchial asthma), as well as by exposure to cigarette smoke (COPD). Doses of ovalbumin vary depending on the type of animals used from 10 mcg in mice to 10 mg in rabbits. For intranasal administration and for spraying in special chambers, 1-4% ovalbumin aerosol is used.
Most often, especially for the preliminary assessment of drugs, including MAB, when modeling respiratory diseases, wild species mice are used - C57BL/6 and BALB/c. However, to confirm the data obtained in mice, most researchers recommend using larger and closer to humans animals (Guinea pigs, rabbits, mini-pigs, monkeys). When studying the effect of MAB on the state of the respiratory tract, along with such standard routes of administration for MAB, as intravenous and subcutaneous, it is important to study the inhalation pathway.
To assess the effectiveness of the studied MAB in respiratory diseases, it is recommended to use such indicators: resistance of the bronchi and trachea, the
content of eosinophils in blood and lung lavage, the content of inflammatory mediators and cytokines (CD4+ and CD25+, IL-5, TNF-a, NF-KB, NO, IL-8, IL-2, IL-6, IL-13 and others), as well as corticosterone in blood plasma, histamine in lung lavage, histological picture of the trachea and bronchi.
Key words: monoclonal antibody, diseases of the respiratory system, experimental model
For citation: Makarova M., Makarov V. Preclinical study of monoclonal antibodies (MAT). Report 1: experimental models for the assessment of MAT in respiratory diseases. Laboratory Animals for Science. 2019; 4 https://doi.org/10/29926/2618723X-2019-04-05
Введение
Использование моноклональных антител (МАТ) для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний давно и широко известно. Вместе с тем исследования об их применении при заболеваниях органов дыхания появились недавно; они довольно редки, хотя, как было показано на конференции «Терапевтические моноклональные антитела к респираторным заболеваниям: Современные проблемы и перспективы» во Франции 31 марта 2016 г., МАТ обладают огромным потенциалом в лечении пациентов с заболеваниями легких [1]. Особенно актуальным является возможность использования МАТ у пациентов с резистентностью к системным и/или ингаляционным кортикостероидам. Кроме того, применение МАТ расширяет возможности для лечения таких больных, позволяя снизить дозы кортикостероидов.
Внедрение любых лекарственных препаратов в клиническую практику начинается с экспериментальных исследований in vitro и in vivo. При этом важнейшее значение имеет выбор адекватных поставленным задачам моделей эксперимента как in vitro, так и на животных.
Цель настоящего обзора - анализ оценки новых МАТ и особенностей моделирования заболеваний органов дыхания у животных. Особое внимание уделялось видам животных, наиболее подходящим для конкретных задач и этапов исследования МАТ, а также методам оценки эффективности изучаемых лекарственных средств.
Моноклональные антитела и их использование для лечения
болезней легких
Моноклональные антитела (МАТ) - это иммуноглобулины, производимые путем клонирования гибридомными клетками клеток, возникших из одной клетки [2]. Первыми МАТ, которые вошли в клинику, были мышиные (полученные только из мыши), но их высокая иммуногенность вызывала выраженную непереносимость и существенно ограничивала их использование. Рекомбинантные ДНК-технологии
позволили заменить мышиные последовательности в МАТ на соответствующие человеческие аналоги. В настоящее время все антитела являются либо гуманизированными (часть участков мышиного антитела заменена на участки человека) либо полностью человеческими антителами IgG [3]. МАТ используются для подавления иммунитета при трансплантации органов, лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний, профилактике инфекционных заболеваний [2, 4, 5]. В 2015 г. было известно >100 МАТ на различных стадиях исследования и использования при различных заболеваниях, кроме вышеуказанных, при сердечно-сосудистых, неврологических и других заболеваниях. Исследования в отношении заболеваний органов дыхания начались совсем недавно, их совсем мало [1].
Как отмечают F. Marqués-García, E. Marcos-Vadillo [6], у некоторых пациентов с заболеваниями легких, лечение кортикостероидами может быть неэффективным или у них может развиваться резистентность к ингаляционным кортикостероидам. Поэтому для лечения таких тяжелых заболеваний легких, как бронхиальная астма (БА), идиопатический легочный фиброз и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), все чаще используются МАТ, нацеленные на связывание с различными цитокинами, включая интерлейкины (IL)-13 и IL5 [1]. Применение МАТ расширяет возможности для лечения таких больных.
Первым МАТ, одобренным FDA (U. S. Food and Drug Administration) для лечения БА в 2003 г., был омализумаб [6]. В настоящее время для лечения тяжелой БА, наряду с омализумабом, который является анти-IgE агентом, используются меполизумаб и реслизумаб, которые связываются непосредственно с IL-5 и предотвращают его соединение с рецептором IL-5 (IL-5R), а также бенрализумаб, который соединяется с А-субъединицей IL-5R на эозинофилах и базофилах, предотвращая связывание IL-5, и дупилумаб, который был специально разработан для ингибирования сигнализации IL-4 и IL-13 [1, 2, 3]. Последние МАТ одобрены для лечения заболеваний легких в 2015-2018 гг., в том числе и для больных ХОБЛ.
Большинство МАТ, предназначенных для лечения заболеваний легких, вводят подкожно (омализумаб, бенрализумаб, дупилумаб), некоторые - внутривенно (меполизумаб, реслизумаб), обычно 1 раз в 2-3 недели. Вместе с тем для МАТ, используемых для лечения болезней легких, существенный интерес представляет ингаляционный путь введения, который в настоящее время только начали изучать. По сравнению с подкожным и внутривенным введением, ингаляция МАТ может обеспечить более быстрое действие при более низких дозах, чем системное лечение, и может быть целесообразна для более широкого круга пациентов [3]. Указанное позволит уменьшить токсичность, связанную с системным воздействием, улучшить переносимость, что приведет к устойчивым высоким уровням накопления молекул, сохраняющих МАТ.
До сих пор нерешены такие вопросы, как причины, влияющие на подкожную биодоступность, прогнозирование иммуногенности, влияние молекулярных свойств МАТ (заряд, гидрофобность, гликозилирование) и их взаимозависимости. Кроме того, не проводились исследования лекарственного взаимодействия МАТ с другими средствами, используемыми при лечении заболеваний легких [3]. Вместе с тем применение МАТ может сопровождаться различными побочными, далеко не безопасными, эффектами. Поэтому весьма актуально создание адекватных моделей для исследования МАТ при болезнях органов дыхания.
Экспериментальные модели для оценки МАТ при заболеваниях
органов дыхания
Доклинические исследования МАТ на животных, как и любых лекарственных препаратов, необходимы до начала их использования у людей. Причем МАТ человека могут быть протестированы не только на приматах при наличии достаточной перекрестной реактивности, но и на мышах, морских свинках, крысах, кроликах [7, 8]. Так, в последнее время благодаря созданию мышей с гуманизированной иммунной системой и нокаутных мышей, у которых мышиный белок заменен человеческим аналогом, например, фактор некроза опухоли (TNF), CD20 и другие, исследования по оценке МАТ стали гораздо доступнее и дешевле [1]. Эти новые гуманизированные мыши позволяют in vivo исследовать эффективность, фармакокинетику и, что важно, новые пути введения, такие как ингаляционный, особо важный для лечения болезней легких. Это позволит существенно снизить затраты на доклинические исследования и уменьшить стоимость препаратов МАТ, которая в настоящее время составляет десятки тысяч рублей за 1 дозу препарата.
Модели на животных имеют решающее значение в оценке влияния МАТ; при этом выбор вида животного зависит от конкретного научного вопроса и модели, которая способна лучше всего имитировать болезнь человека [1]. При этом за основу моделей заболеваний дыхательных путей следует брать современные наиболее эффективные и адекватные модели. Как указывалось выше, мыши все чаще используются в качестве модели для изучения патогенеза БА и ХОБЛ, а также для поиска новых методов лечения [1]. Так, наибольшее число доклинических исследований по БА проведено именно на мышах, причем преимущественно диких пород - C57BL/6 и BALB/c; несколько реже используются крысы линии Wistar, морские свинки и кролики [9]. По мнению S.D. Keir и соавт. [10], для моделирования БА и последующих процедур с животными хорошо подходят кролики, у которых развивается выраженный бронхоспазм, воспаление дыхательных путей и гиперчувствительность бронхов; при этом они достаточно велики для постоянного отбора проб крови и легких в течение всего эксперимента. Обезьяны, наиболее близкие по анатомии и физиологии человеку,
используются крайне редко как по этическим соображениям, так и вследствие высокой их стоимости. В связи с этим большинство исследователей, рекомендуя модели на грызунах, для повышения точности исследований предлагают изучать как можно большее число показателей состояния животных, а не только несколько аллергологических проб [1].
Для моделирования БА в эксперименте наиболее часто применяется внутрибрюшинное, реже - подкожное, введение овальбумина в течение 714 дней с последующим интраназальным введением или распылением через несколько дней аэрозоля овальбумина с периодичностью 1-2 раза в неделю, обычно 3-5 раз по 20-30 мин в день [9]. Для внутрибрюшинного и подкожного введения применяют от 10 до 100 мкг у мышей, 1 мг - у крыс, от 1 до 20 мг - у морских свинок, 10 мг - у кроликов. Интраназально и для распыления в специальных камерах используют 1-4% аэрозоль овальбумина. Кроме овальбумина иногда используют пылевых клещей, хлопковую пыль и другие аллергены.
В настоящее время «золотым стандартом» для исследования ХОБЛ является мышиная модель, при этом мыши подвергаются воздействию сигаретного дыма в течение 6 мес [11]. Так, например, G. Desoubeaux и соавт. [1] указывают следующие преимущества таких моделей:
• развитие патологии сходной с таковой у человека (воспаление легких, фиброз мелких дыхательных путей и расширение воздушного пространства);
• геномом мышей можно манипулировать, чтобы удалять или чрезмерно экспрессировать отдельные гены;
• высокая скорость размножения;
• низкая стоимость ухода и исследования.
Однако имеются и недостатки подобных моделей для изучения ХОБЛ на мышах: существенные отличия от анатомии и иммунологии человека, отсутствие гиперсекреции слизи, имеющей важное значение в патогенезе хронического бронхита у человека, а также сложности в заборе крови и ткани легких на протяжении длительного эксперимента [1]. Поэтому ряд исследователей выявленные на грызунах особенности рекомендуют подтверждать на нечеловекообразных обезьянах [12].
Таким образом, мышей можно и нужно использовать на начальных этапах исследования МАТ для предварительной оценки их действия при моделировании заболеваний органов дыхания. Однако окончательные экспериментальные исследования МАТ следует проводить на более крупных и близких человеку животных (морские свинки, кролики, мини-свиньи, обезьяны). При этом необходимо изучение различных путей введения: подкожного, внутривенного и ингаляционного. При оценке эффективности МАТ следует учитывать, что период полувыведения МАТ, введенных внутривенно, составляет около 3 нед [1].
Показатели, используемые для оценки заболеваний легких у
животных
Критерии эффективности исследуемых лекарственных средств при экспериментальном моделировании БА: оценка резистентности бронхов и трахеи в ответ на введение метахолина или гистамина, эозинофилии в крови и лаваже легких, воспалительных медиаторов и цитокинов (при развитии БА уменьшается число клеток CD4+ и CD25+, а ^-5, ЮТа, №-кВ, N0, ^8, ГЬ2, ГЬ6, ГЬ13, а некоторых других - увеличивается). Кроме того, при развитии БА увеличивается содержание кортикостерона в плазме крови, а также гистамина в лаваже легких. Гистологическая картина БА характеризуется отеком, утолщением мембраны, нарушением целостности эпителия и воспалительной клеточной инфильтрацией слизистой трахеи и бронхов, метаплазией бокаловидных клеток, гипертрофией эпителия, субэпителиальным фиброзом и гиперплазией гладкой мускулатуры [9].
Заключение
Согласно анализу литературы по моделированию в эксперименте на животных заболеваний дыхательных путей (БА, ХОБЛ) для оценки лечебного влияния моноклональных антител. Наиболее важен выбор современных, эффективных и адекватных исследуемому заболеванию моделей.
Для моделирования заболеваний органов дыхания у животных используют внутрибрюшинное и подкожное введение овальбумина с последующим его интраназальным введением или распылением (БА) или воздействие сигаретного дыма (ХОБЛ). При этом дозы овальбумина варьируют в зависимости от вида животных от 10 мкг у мышей до 10 мг у кроликов.
Несмотря на то, что модели болезней органов дыхания на мышах имеют определенные недостатки (различия с человеком в анатомии, физиологии и иммунологии, сложности отбора проб крови и ткани легких в динамике и др.), мыши все-таки чаще используются для поиска средств лечения этих заболеваний, в том числе и МАТ. Причем широко применяются наиболее дешевые мыши диких пород - С57БЬ/6 и БЛЬБ/е. Однако, если мышей можно использовать на начальных этапах исследования МАТ для предварительной оценки их действия на организм, то подтвердить полученные на мышах данные следует на более крупных и близких человеку животных - морских свинок, кроликах, мини-свиньях, обезьянах. Важным при изучении влияния МАТ на состояние дыхательных путей, наряду с такими стандартными для МАТ путями введения, как внутривенный и подкожный, является оценка ингаляционного пути. Для повышения точности результатов исследований МАТ, в особенности на грызунах, рекомендуется изучить максимальное число показателей состояния организма. Так, для оценки эффективности исследуемых МАТ
при заболеваниях дыхательных путей, наряду с показателями резистентности бронхов и трахеи, содержание эозинофилов в крови и лаваже легких, отдельных медиаторов и цитокинов, необходимо углубленное изучение гистологической картины бронхолегочного аппарата.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Литература
1. Desoubeaux G., Reichert J.M., Sleeman M., Reckamp K.L., Ryffel B., Adamczewski J.P., Sweeney T.D., Vanbever R., Diot P., Owen C.A., Page C., Lerondel S., Le Pape A., Heuze-Vourc'h N. Therapeutic monoclonal antibodies for respiratory diseases: Current challenges and perspectives, March 31 - April 1, 2016, Tours, France. MAbs. 2016 Aug-Sep;8(6):999-1009. DOI: 10.1080/19420862.2016.1196521.
2. Левинсон У. Медицинская микробиология и иммунология [Электронный ресурс]. Перевод с англ. Под ред. проф. В. Б. Белобородова. - Эл. изд. - Электрон. текстовые дан. (1 файл pdf : 1184 с.). - М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. [Levinson U. Meditsinskaya mikrobiologiya i immunologiya [Elektronnyi resurs]. U. Levinson ; per. s angl. pod red. d-ra med. nauk, prof. V. B. Beloborodova. - El. izd. - Elektron. tekstovye dan. (1 fail pdf : 1184 s.). - M. : BINOM. Laboratoriya znanii, 2015 (in Russ)].
3. Matera M.G., Calzetta L., Rogliani P., Cazzola M. Monoclonal antibodies for severe asthma: Pharmacokinetic profiles. Respir. Med. 2019 Jul;153:3-13. DOI: 10.1016/j.rmed.2019.05.005.
4. Чмутин Е.Ф., Иванов П.К., Гриневич А.С. Разработка терапевтических моноклональных антител для онкологии: Достижения и перспективы. Российский биотерапевтический журнал, 2009; 3. Том 8: 2736. [Chmutin E.F., Ivanov P.K., Grinevich A.S. Razrabotka terapevticheskikh monoklonal'nykh antitel dlya onkologii: Dostizheniya i perspektivy. Rossiiskii bioterapevticheskii zhurnal, 2009; 3. Tom 8: 27-36 (in Russ)].
5. Насонов Е.Л., Денисов Л.Н., Станислав М.Л., Ильина А.Е. Перспективы фармакотерапии ревматоидного артрита: моноклональные антитела. Науч-практич. ревматол. 2012. 52 (3): 75-82. [Nasonov E.L., Denisov L.N., Stanislav .L., Il'ina A.E. Perspektivy farmakoterapii revmatoidnogo artrita: monoklonal'nye antitela. Nauch-praktich. revmatol. 2012. 52 (3): 75-82 (in Russ)].
6. Marqués-Garcia F., Marcos-Vadillo E. Mouse Models Applied to the Research of Pharmacological Treatments in Asthma. Methods Mol. Biol. 2016. Vol. 1434: 239-53. DOI 10.1007/978-1-4939-3652-6 17.
7. Fisher T.L., Reilly Ch.A., Winter L.A., Pandina T., Jonason A., Scrivens M., Balch L., Bussler H., Torno S., Seils J., Mueller L., Huang H., Klimatcheva E., Howell A., Kirk R., Evans E., Paris M., Leonard J.E., Smith E.S., Zauderer M. Generation and preclinical characterization of an antibody specific for SEMA4D, mAbs. 2016. Vol. 8:1: 150-62. DOI: 10.1080/19420862.2015.1102813
8. Leckie M.J. Anti-interleukin-5 monoclonal antibodies: preclinical and clinical evidence in asthma models. Am. J. Respir. Med. 2003; 2 (3): 245-59.
9. Kianmeher M., Ghorani V., Boskabady M.H. Animal Model of Asthma, Various Methods and Measured Parameters: A Methodological Review. Iran J. Allergy Asthma Immunol., 2016 Dec; 15 (6): 445-65.
10. Keir S.D., Spina D., Douglas G., Herd C., Page C.P. Airway responsiveness in an allergic rabbit model. J. Pharmacol. Toxicol. Methods., 2011 Sep-Oct;64(2): 187-95. DOI: 10.1016/j.vascn.2011.08.003.
11. Laucho-Contreras M.E., Taylor K.L., Mahadeva R., Boukedes S.S., Owen C.A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. J. Vis. Exp. 2015. Jan 16; (95): e52236: 12 p. DOI: 10.3791/52236.
12. Polverino F., Doyle-Eisele M., McDonald J., Wilder J.A., Royer C., Laucho-Contreras M., Kelly E.M., Divo M., Pinto-Plata V., Mauderly J., Celli B.R., Tesfaigzi Y., Owen C.A. A novel nonhuman primate model of cigarette smoke-induced airway disease. Am. J. Pathol. 2015; 185:741-55; PMID:25542772; http://dx.doi.org/10.1016/j.ajpath.2014.11.006.
