CC BY
4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОКСИДА АЗОТА НА СОСТОЯНИЕ ТКАНЕЙ И СТРУКТУР НЕПОВРЕЖДЁННОГО ГЛАЗНОГО ЯБЛОКА КРОЛИКА
О.И. Кваша1, Н.Б. Чеснокова 2, А.А. Пекшев3, А.Б. Шехтер4, В.Н. Василец5
1 ООО "Евразмедцентр", Москва Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца, Москва
Московский государственный технический университет им. Н.Э. Баумана, Москва
4 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва
5 Филиал Федерального исследовательского центра химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, Черноголовка
Оксид азота генерируется в организме при участии NO-синтаз и обладает множеством функций, определяющих и регулирующих различные физиологические процессы в организме. Аппарат «Плазон», генерирует при атмосферном давлении воздушно-плазменный поток, обогащенный NO, позволяющий осуществлять локальное воздействие NO на поверхность глазного яблока. В настоящей работе на 62 кроликах (124 глазах) исследовано влияние различных концентраций и доз оксида азота в газовом потоке, генерируемом аппаратом «Плазон», на состояние тканей и структур неповреждённого глазного яблока. В первой серии экспериментов проведен подбор оптимальных доз и режимов, не оказывающих местноразражающего действия на глаз кролика. Кроликов разделили на две группы: в 1 группе (6 кроликов - 12 глаз) -воздействие производили при высокой концентрации NO - 2250 ppm, в течение 60 секунд. Во 2 группе (6 кроликов - 12 глаз) - воздействие производили при средней концентрацией NO -750 ppm, и времени экспозиции 20 секунд на оба глаза кроликов. Во второй серии экспериментов было проведено исследование реакции конъюнктивальных сосудов на действие различных доз NO-содержащего газового потока. Исследование было проведено на 50 кроликах. . В 1-ой группе (40 животных - 80 глаз) определяли влияние однократного воздействия NO-содержащего газового потока на калибр сосудов конъюнктивы и сетчатки с использованием различных концентраций NO: 300 и 750 ppm (время воздействия составляло 10, 20 и 60 секунд). Во 2-ой группе (10 животных - 20 глаз) определяли влияние многократного воздействия (21 день) NO-содержащего газового потока «Плазона» на тонус сосудов конъюнктивы и сетчатки с использованием тех же концентраций NO: 300 и 750 ppm (времена воздействия 10, 20 и 60 секунд). В результате проведённых исследований был показано, что
безопасным следует признать кратковременное воздействие NO с концентрацией 750 ppm в течении 10 и 20 сек или воздействии NO при концентрации 300 ppm в течении 10, 20 и 60 сек. Длительное же воздействие NO при концентрации 750 ppm в течении 60 сек вызывает нежелательный резкий спазм и ведет к ишемии сосудов конъюнктивы в течение 3 часов. При многократном в течении 21-го дня воздействии различных доз NO на сосуды конъюнктивы к 7-14 суткам отмечали эффект "привыкания" к воздействию. В обеих группах кроликов клинических изменений переднего отрезка глаза при биомикроскопии не обнаружено. В сосудах сетчатки достоверных изменений под влиянием газового потока, содержащего NO, не наблюдалось.
Ключевые слова: оксид азота, конъюнктива, сосуды
Abstract
Nitric oxide is generated in the body with the participation of NO-synthases and has many functions that determine and regulate various physiological processes in the body. The "Plazon" apparatus generates an air-plasma flow enriched with NO at atmospheric pressure, allowing a local effect of NO on the wound surface. In this work, on 62 rabbits (124 eyes), the effect of various concentrations and doses of nitric oxide in the gas flow generated by the "Plazon" apparatus on the state of tissues and structures of the intact eyeball was investigated. In the first series of experiments, the selection of optimal doses and modes that do not have a local irritating effect on the rabbit's eye was carried out. The rabbits were divided into two groups. In group 1 (6 rabbits - 12 eyes) - the exposure was performed at a high concentration of NO - 2250 ppm, for 60 seconds. In group 2 (6 rabbits - 12 eyes) - exposure was performed at an average concentration of NO-750 ppm, and an exposure time of 20 seconds on both eyes of rabbits.In the second series of experiments, we studied the reaction of the conjunctival vessels to the action of various doses of the NO-containing gas stream. The study was carried out on 50 rabbits. In the 1st group (40 animals - 80 eyes), the effect of a single exposure to an NO-containing gas stream on the caliber of the vessels of the conjunctiva and retina was determined using various NO concentrations: 300 and 750 ppm (exposure time was 10, 20 and 60 seconds). In group 2 (10 animals - 20 eyes), the effect of repeated exposure (21 days) to the NO-containing gas flow from "Plazon" on the tone of the vessels of the conjunctiva and retina was determined using the same NO concentrations: 300 and 750 ppm (exposure times 10, 20 and 60 seconds). As a result of the studies, it was shown that short-term exposure to NO with a concentration of 750 ppm for 10 and 20 seconds or exposure to NO at a concentration of 300 ppm for 10, 20 and 60 seconds should be recognized as safe. Long-term exposure to NO at a concentration of 750 ppm for 60 seconds causes an unwanted sharp spasm and leads to ischemia of the conjunctival vessels within 3 hours. With repeated exposure of different doses of NO on the vessels of the conjunctiva during the 21st day, the effect of "addiction" to the effect was noted by 7-14 days. In both groups of rabbits, no clinical changes in the anterior segment of the eye were detected by biomicroscopy. No significant changes were observed in the retinal vessels under the influence of a gas flow containing NO.
Key words: nitric oxide, conjunctiva, vessels
Оксид азота генерируется в организме при участии NO-синтаз и обладает множеством функций, определяющих и регулирующих различные физиологические процессы в организме. Основными эффектами воздействия газового оксида азота являются: вазодилатация, способность к активации нейтрофилов и макрофагов, индукция пролиферации и стимуляции фибробластов, бактерицидное действие, ускорение эпителизации раневого дефекта [1-3].
Материалы и методы
В 1998 г. группой специалистов МГТУ им. Н.Э. Баумана и ММА им. И.М. Сеченова был разработан плазменный аппарат «Плазон», который генерирует при атмосферном давлении воздушно-плазменный поток, обогащенный NO, позволяющий осуществлять локальное воздействие NO на поверхность раны [4]. Проведенные нами эксперименты и расчёты показали, что в воздушно-плазменном потоке аппарата «Плазон» наряду с оксидом азота и основными компонентами воздуха O2, N2, Ar присутствуют малые концентрации NO2, H2O2 и радикалов ОН . Синергетическое взаимодействие NO с Н2О2 и ОН значительно усиливает как бактерицидный, так и, возможно, терапевтический эффект воздействия плазменного потока на раны [5].
В настоящей работе на 62 кроликах (124 глазах) исследовано влияние различных концентраций и доз оксида азота в газовом потоке, генерируемом аппаратом «Плазон», на состояние тканей и структур неповреждённого глазного яблока, а также проведен подбор оптимальных доз и режимов, не оказывающих местноразражающего действия на глаз кролика. В первой серии эксперимента кроликов разделили на две группы: в 1 группе (6 кроликов - 12 глаз) -воздействие производили при высокой концентрации NO - 2250 ppm, в течение 60 секунд. Во 2 группе (6 кроликов - 12 глаз) - воздействие производили при средней концентрацией NO -750 ppm, и времени экспозиции 20 секунд на оба глаза кроликов. Фоновое исследование тонометрии, для оценки естественных колебаний внутриглазного давления (ВГД), проводили два раза в день в течение двух дней: до воздействия, затем через 5, 15, 30, 60 минут после однократного, и 7, 14 сутки после ежедневного воздействия NO. Внутриглазное давление измеряли с помощью тонометра Маклакова.
Во второй группе эксперимента было проведено исследование реакции конъюнктивальных сосудов на действие различных доз NO-содержащего газового потока. Исследование было проведено на 50 кроликах. Как и в первой серии эксперимента, животные были разделены на 2 группы. В 1 -ой группе (40 животных - 80 глаз) определяли влияние однократного воздействия NO-содержащего газового потока на калибр сосудов конъюнктивы и сетчатки с использованием различных концентраций NO: 300 и 750 ppm. При этом время воздействия составляло 10, 20 и 60 секунд. Во 2-ой группе (10 животных - 20 глаз) определяли влияние многократного воздействия (21 день) NO-содержащего газового потока «Плазона» на тонус сосудов конъюнктивы и сетчатки с использованием тех же концентраций NO: 300 и 750 ppm при временах воздействия 10, 20 и 60 секунд. Регистрацию реакции конъюнктивальных сосудов под действием различных доз NO-содержащего газового потока
проводили с помощью фотощелевой лампы Zeiss-Iena на позитивной фотопленке фирмы "Codak-100S". Калиброметрию микрососудов проводили по негативам на стереокомпораторе "ЗОМЗ"
Результаты и обсуждение
Ранее нами было исследовано лечение газовым потоком аппарата «Плазон» с малыми концентрациями оксида азота (200-300 ppm в течении 10-90 сек ) химических ожогов, эрозии и ран роговицы, повреждений кожи век [6-8]. Однако вопрос о предельно допустимых концентрациях и оптимальных терапевтических дозах оставался открытым. В данной работе особое внимание было уделено влияние высоких концентраций NO-содержащего газового потока «Плазона» на внутриглазное давление (ВГД) и реакции конъюнктивальных сосудов у кроликов при однократном и многократном воздействии.
Таблица №1. Влияние NO на внутриглазное давление (мм рт. ст.) кроликов при
Время наблюдени 2250 ppm, 60 сек 750 ppm, 20 сек Отличие от фона ( Р).
Контроль 20,7 + 2,5 20,3 + 1,8 < 0,5
5 мин. 21,4 + 1,6 20,2 + 1,4 < 0,1
15 мин. 21,3 + 0,8 19,7 + 0,9 < 0,2
30 мин. 21,0 + 1,5 20,3 + 0,4 < 0,1
60 мин. 21,4 + 1,3 19,9 +0,6 < 0,2
В таблице 1 приведены результаты экспериментов в первой серии. После однократного воздействия в 1-ой группе кроликов с концентрацией NO 2250 ppm клинически наблюдали резкое уменьшение слезопродукции, сопровождающееся отеком эпителия роговицы в течение 1 -ой минуты и завершались обильным слезоотделением с нормализацией состояния эпителия. У кроликов 2-ой группы при концентрации NO 750 ррт подобных клинических изменений переднего отрезка глаза во время воздействия не обнаружено. Значения ВГД через 15, 30 и 60 мин. после воздействия газовым потоком в 1-ой группе и 2-ой группе не отличались от уровня фоновых и контрольных измерений. Дальнейшие исследования были проведены на тех же животных, продолжавших получать ежедневное воздействие газовым потоком в течение 14-ти дней. Методом биомикроскопии было обнаружено, что для обеих групп кроликов клинических изменений переднего отрезка глаза не наблюдается. Статистически значимых отличий от значений фоновых и контрольных измерений не обнаружено
В результате проведённых экспериментов во второй серии было показано (см. Рис.1), что воздействие потока при концентрации NO 750 ррт в течение 20 сек, а также при концентрации 300 ррт в течение 60, 20 и 10 сек вызывает вазодилятацию с раскрытием нефункционирующих резервных капилляров от 24 до 96 часов. Вместе с тем воздействие NO при той же концентрации 750 ррт, но уже в течении 60 сек. вызывает резкий спазм и ведет к ишемии сосудов конъюнктивы в течение 3 часов. Наиболее выраженная и продолжительная
реакция (расширение калибра сосудов - 205 % от исходного и продолжительность реакции - 96 часов) отмечена при использовании самой короткой экспозиции (10 сек) при концентрации оксида азота 300 ррт. Увеличение времени однократного воздействия при концентрации N0 в потоке 300 ррт до 20 и 60 сек ведет к уменьшению эффекта вазодилятации. При воздействии N0 с концентрацией 750 ррт и экспозицией 20-ти секунд ежедневно - в течение 21-го дня, отмечали значительное (141 % от исходного) расширение сосудов и раскрытие нефункционирующих капилляров, с возвратом к исходному уровню на 14-й день воздействия. Воздействие же в течении 60 секунд - при той же концентрации N0 750 ррт, вызвало через 20 минут резкий спазм микрососудов конъюнктивы (в среднем до 56,5 % от исходного), Возвращение диаметра сосудов к исходному уровню произошло ко 2-ой неделе и в дальнейшем не зависело от продолжающегося воздействия. При ежедневном воздействии N0 с концентрацией 300 ррт и временем воздействия 60 секунд, в течение 21-го дня, наблюдался мягкий сосудорасширяющий эффект (113,8 % от исходного), продолжительностью до 7 дней. Таким образом при многократном в течении 21-го дня воздействии различных доз N0 на сосуды конъюнктивы к 7-14 суткам отмечали эффект "привыкания" к воздействию.
Рис.1. Изменение тонуса сосудов конъюнктивы после однократного воздействия N0 при концентрации 750 ррт - р< 0,05.
Нами также было отмечено, что артерии реагировали на воздействие N0 более активно, калибр сопряженных артерий увеличивался в среднем на 14-26 % больше, чем вены. На 14-й день воздействия этот эффект уже не отмечали. Достоверных изменений в сосудах сетчатки под влиянием газового потока не наблюдали.
Выводы
Таким образом безопасным следует признать кратковременное воздействие NO с концентрацией 750 ppm в течении 10 и 20 сек или воздействии NO при концентрации 300 ppm в течении 10, 20 и 60 сек. Длительное же воздействие NO при концентрации 750 ppm в течении 60 сек вызывает нежелательный резкий спазм и ведет к ишемии сосудов конъюнктивы в течение 3 часов. После воздействия концентрации NO 2250 ppm в течении 60 сек у кроликов наблюдали резкое уменьшение слезопродукции, сопровождающееся отеком эпителия роговицы в течение 1 минуты. При многократном в течении 21-го дня воздействии различных доз NO на сосуды конъюнктивы к 7-14 суткам отмечали эффект "привыкания" к воздействию. В обеих группах кроликов клинических изменений переднего отрезка глаза при биомикроскопии не обнаружено. В сосудах сетчатки достоверных изменений под влиянием газового потока, содержащего NO, не наблюдалось.
Подбор безопасных доз и концентраций оксида азота для обработки слизистой оболочки глазного яблока играет важнейшее значение для клинического применения NO терапии в офтальмологии.
Заключение
Полученные в этой работе результаты вызывают в настоящее время большой интерес также в связи безопасностью последних исследований, проводимых в НИИ скорой помощи имени М.Н. Склифосовского, в Приволжском окружном медицинском центре ФМБА и в НМИЦ им. В.А. Алмазова, по использованию оксида азота, вводимого непосредственно в лёгкие пациентов, при лечении тяжёлых больных COVID-19, находящихся на ИВЛ [9]. В этих исследованиях применяется NO-содержащий поток, генерируемый плазмохимическим прибором «Тианокс», разработанным саровскими учеными из ФГУП «РФЯЦ-ВНИИЭФ» (предприятие Госкорпорации «Росатом») [10].
Список литературы
1. Ziche M., Morbidelli L. Nitric oxide and angiogenesis // Journal of neuro-oncology 50(1-2) (2000) 139-148.
2. Witte M.B., Barbul A. Role of nitric oxide in wound repair // The American Journal of Surgery 183(4) (2002) 406-412.
3. Han G., Nguyen L.N., Macherla C., Chi Y., Friedman J.M., Nosanchuk J.D., Martinez L.R. Nitric oxide-releasing nanoparticles accelerate wound healing by promoting fibroblast migration and collagen deposition // The American journal of pathology 180(4) (2012) 1465-1473.
4. Shekhter A.B., Serezhenkov V.A., Rudenko T.G., Pekshev A.V., Vanin A.F. Beneficial effect of gaseous nitric oxide on the healing of skin wounds // Nitric Oxide 12(4) (2005) 210-219.
5. Vasilets V.N., Shekhter A.B., Guller A.E., Pekshev A.V. Air plasmagenerated nitric oxide in treatment of skin scars and articular musculoskeletal disorders: Preliminary review of observations // Clinical Plasma Medicine 3(1) (2015) 32-39.
6. Гундорова Р.А., Чеснокова Н.Б., Шехтер А.Б., Пекшев А.В., Кваша О.И., Давыдова Н.Г., Безнос О.В., Столярова Е.П., Косакян С.М., Горбачёва О.А. Применение оксида азота в газовом потоке для заживления ран роговицы // Офтальмологический журнал. 2003. №1. С. 47-52.
7. Кваша О.И. Возможность использования NO- терапии при лечении эрозий роговицы глазного яблока // Глаз. 2004. №6. С. 8-10.
8. Кваша О.И. Применение оксида азота и эмоксипина при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы. Экспериментальные исследования // Офтальмология. 2006. Т. 3, №3. С. 67-71.
9. https://ria.ru/20200424/1570484858.html
10. https://minzdrav.gov.ru/special/regional_news/12188-v-fgbu-nmits-im-v-a-almazova-minzdrava-rossii-nachaty-klinicheskie-ispytaniya-otechestvennogo-apparata-dlya-terapii-oksidom-azota
