CC BY
4
РОЛЬ NO В МОДУЛЯЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА ЭРИТРОЦИТОВ IN VITRO
А.К. Мартусевич, А.Г. Соловьева, М.А. Артамонов, С.П. Перетягин
ФГАОУ «Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)» Минздрава России, Москва ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород
Abstract
We studied action of gas flow with nitric oxide on some parameters of human erythrocytes energy metabolism. Whole blood specimens were processed by NO-containing gas flow from Plazon apparatus (800 and 80 ppm) and new device (NO level - 75 ppm). In erythrocytes activity of lactate dehydrogenase in direct and reverse reactions and lactate level were tested. Some additional coefficients were calculated. It was stated, that blood processing by gas flow from Plazon apparatus (800 ppm) depress erythrocyte energy metabolism, but tenfold dilution of this flow decrease effect intensity. In opposite, use of new device optimized these processes.
Key words: nitric oxide, blood, energy metabolism, lactate dehydrogenase, lactate
Изучали характер действия газовой фазы, содержащей NO, на некоторые параметры энергетического метаболизма эритроцитов человека. Образцы цельной крови обрабатывали газовыми потоками от аппарата «Плазон» (концентрация NO - 800 и 80 ppm) и экспериментального генератора (75 ppm). Оценивали активность лактатдегидрогеназы в прямой и обратной реакциях, уровень лактата и ряд производных коэффициентов. Установлено, что обработка крови NO в концентрации 800 ppm угнетает энергетический метаболизм эритроцитов, а десятикратное его разведение снижает интенсивность воздействия. Применение газового потока, содержащего NO в концентрации 75 ppm и свободного от примеси активных форм кислорода, способствует оптимизации рассматриваемого процесса.
Ключевые слова: оксид азота, кровь, энергетический метаболизм, лактатдегидрогеназа, лактат
Многогранная биорегуляторная роль монооксида азота (регуляция сосудистого тонуса, нейротрансмиссия, апоптоз и др. [1, 7, 10, 11]), а также возможность его участия как в процессах регенерации и реадаптации, так и в патогенезе различных заболеваний (прежде всего, за счет формирования нитрозативного стресса [9]) детерминируют целесообразность направленной коррекции уровня NO. Для этого в настоящее время существуют 3 основных пути: применение фармацевтических доноров оксида азота или модуляторов
активности NO-синтазы [1], действие газового потока, содержащего NO и генерируемого аппаратом «Плазон» [8], а также использование физических факторов-индукторов эндогенного синтеза соединения (терагерцовое электромагнитное излучение [5]). С другой стороны, только первый из перечисленных вариантов способен обеспечить четкое дозирование «добавляемой» концентрации оксида азота, однако биотрансформация NO из лекарственных доноров происходит болюсно или в течение короткого промежутка времени, что полезно лишь в отдельных ситуациях (например, при коррекции ишемии коронарных сосудов нитроглицерином [1]). Аппарат «Плазон» генерирует определенную концентрацию оксида азота, однако, как было показано нами ранее [8], данное количество соединения для целого ряда биотканей проявляет токсичные свойства. Кроме того, в создаваемом газовом потоке, помимо основного действующего вещества, присутствуют активные формы кислорода, в том числе озон [3]. С данных позиций, сохраняет актуальность разработка принципиально нового прибора для синтеза NO с минимальным количеством примесей и вариабельной концентрацией агента. Он был создан в Российском федеральном ядерном центре [2] и, по результатам предварительных испытаний, способствует оптимизации окислительного метаболизма крови in vitro [4]. Поэтому логичным представляется дальнейшее изучение его лечебного потенциала, в связи с чем целью данной работы служил сравнительный анализ влияния NO-содержащих газовых потоков от аппарата «Плазон» и нового генератора на энергетический метаболизм эритроцитов.
Материал и методы исследования
Объектом исследования явились образцы цельной крови здоровых доноров (n=14). Каждый образец был разделен на четыре порции (по 5 мл), первая из которых являлась контрольной (с ней не производили никаких манипуляций). Вторую порцию обрабатывали газовым потоком от аппарата «Плазон» (концентрация NO - 800 ppm; объем - 100 мл), третью - указанным потоком, десятикратно разведенным атмосферным воздухом (концентрация NO - 80 ppm; объем аналогичен), четвертую - газовой фазой, полученной от экспериментального генератора (концентрация NO - 75 ppm; объем аналогичен). Продолжительность барботажа во всех случаях составляла 5 минут, последующей экспозиции - 3 минуты.
В донорской консервированной крови спектрофотометрически определяли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в прямой и обратной реакциях по методу Г.А. Кочетова (1980). Содержание белка устанавливали по модифицированному методу Лоури. Уровень лактата в плазме крови и эритроцитах определяли с помощью анализатора SuperGL Ambulance. Для оценки сдвигов энергетического метаболизма использовали ряд параметров: коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР) и субстратной обеспеченности (КСО) [6].
Полученные данные были обработаны в программном пакете Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение
Первым компонентом проведенного анализа являлась оценка активности ЛДГ в прямой и обратной реакциях при действии различных концентраций NO (рис. 1). Установлено, что газовый поток, генерируемый аппаратом «Плазон»,
способствует смещению функционирования фермента в сторону активации обратной реакции с одновременным ингибированием прямой, что рассматривается нами как негативная тенденция и подтверждает ранее полученные данные [8]. При этом исходный газовый поток обусловливает существенно более выраженные изменения активности энзима, чем его десятикратное разведение ф<0,05). Однако следует подчеркнуть, что даже при использовании указанного разведения сдвиги изучаемых показателей относительно контрольного образца остаются значимыми ф<0,05). Напротив, обработка образцов крови газовым потоком от экспериментального генератора, содержащим концентрацию оксида азота, сопоставимую с десятикратным разведением потока от «Плазона», способствует изолированной активации прямой реакции ЛДГ без значимого влияния на обратную, увеличивая поставку пирувата в цикл Кребса.
□ контроль
□ N0 800 ррт
□ N0 80 ррт (1:9) 0 N0 75 ррт
ЛДГпр
ЛДГобр
Рис. 1. Активность лактатдегидрогеназы эритроцитов в прямой (ЛДГпр) и обратной (ЛДГобр) реакциях при действии различных концентраций монооксида
азота
Изменения активности ЛДГ четко согласуются с результатом определения уровня его субстрата в эритроцитах (рис. 2). Следует отметить, что данный параметр более стабилен, чем изучаемые каталитические свойства энзима. Максимальное его отклонение (на 17,7% относительно контрольных значений; p<0,05) наблюдали при барботировании крови неразведенным газовым потоком, полученным от аппарата «Плазон». В меньшей степени уровень лактата эритроцитов повышался при обработке крови газовым потоком с десятикратно уменьшенной дозой NO (80 ppm), оставаясь значимо выше контрольных цифр (на 14% относительно интактного образца; p<0,05). При обработке крови потоком от экспериментального генератора оксида азота также регистрировали значимое повышение концентрации лактата (на 9%; p<0,05), однако в этом случае уровень
данного параметра был ниже, чем при барботаже биологической жидкости неразведенным газовым потоком от «Плазона» ф<0,05). Это подтверждает более оптимальное действие изучаемого нового аппарата на рассматриваемый компонент энергетического метаболизма.
Рис. 2. Уровень лактата в эритроцитах при действии различных концентраций
оксида азота
Для комплексной оценки характера сдвигов энергетического метаболизма при действии различных концентраций изучаемого агента были применены производные коэффициенты, одновременно учитывающие и активность ЛДГ в обеих реакциях, и уровень лактата (рис. 3).
А. Уровень коэффициента баланса Б. Коэффициент субстратного
энергетических реакций обеспечения
Рис. 3. Производные коэффициенты энергетического метаболизма крови при
действии NO
Выявлено, что газовый поток, содержащий 800 ppm NO, многократно снижает значение КБЭР (в 3,5 раза; р<0,05), тогда как при применении десятикратного разведения эти сдвиги менее выражены (уменьшение в 1,8 раза;
p<0,05 относительно контрольного образца и неразведенного потока). Данная тенденция указывает на то, что реализованная в использованном аппарате концентрация NO является крайне высокой для крови, приводя к угнетению энергетического обмена эритроцитов, а снижение концентрации агента на порядок уменьшает интенсивность негативного эффекта. В результате анализа динамики КБЭР крови при ее обработке газовым потоком, полученным от экспериментального генератора, показано, что в этом случае обнаруживается не угнетение, а умеренное, но значимое увеличение рассматриваемого показателя (в 1,13 раза; p<0,05). Это свидетельствует об оптимизирующем влиянии низких концентраций газообразного оксида азота на энергетический метаболизм эритроцитов.
Аналогичная динамика просматривается и по коэффициенту субстратного обеспечения, характеризующему баланс ЛДГ и одного из его субстратов (рис. 3Б).
Заключение
Таким образом, обработка крови газовым потоком, содержащим монооксид азота в концентрации 800 ppm, угнетает энергетический метаболизм эритроцитов, но десятикратное его разведение снижает интенсивность воздействия, что свидетельствует о наличии дозозависимости эффекта. Не менее важным фактором, определяющим характер ответа процессов энергопродукции клетки на действие оксида азота, является наличие в потоке активных форм кислорода. В связи с этим, применение газового потока, содержащего NO в концентрации 75 ppm и свободного от примеси последних, способствует стимуляции функционирования ЛДГ эритроцитов.
Список литературы
1. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М.: Вузовская книга, 2004.
2. Карелин В.И., Буранов С.Н., Пименов О.А. с соавт. Плазмохимическая установка для NO-терапии // Медиаль. - 2013. - №4. - С. 46.
3. Мартусевич А.К., Перетягин С.П., Ванин А.Ф. Исследование продуктов от терапевтического аппарата для получения NO-содержащей холодной плазмы // Медицинская физика. - 2012. - №4. - С. 80-86.
4. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П. с соавт. Влияние различных концентраций оксида азота (NO) на интенсивность процессов липопероксидации в плазме крови in vitro // Медицинский альманах. - 2013. -№3. - С. 76-77.
5. Островский В.Н., Никитюк С.М., Киричук В.Ф., Креницкий А.П. и др. Комплексное лечение ожоговых ран терагерцовыми волнами молекулярного спектра оксида азота // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2004. - № 11. - С. 55-61.
6. Соловьева А.Г., Зимин Ю.В. Новый способ оценки динамики метаболизма крови у больных и термической травмой // Современные технологии в медицине. - 2012. - №2. - С. 116-117.
7. Giliano N.Y. et al. Dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands and apoptosis: studies with HeLa cells // Nitric Oxide Biol. Chem. - 2011. - Vol. 24. - P. 151-159.
8. Martusevich A.K., Peretyagin S.P., Soloveva A.G., Vanin A.F. Estimation of some molecular effects of gaseous nitrogen oxide on human blood in vitro // Biophysics. - 2013. - Vol. 58, N5. - P. 689-692.
9. van der Vliet A. et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P. 7617-7625.
10.van Faassen E., Vanin A.F. (Eds.) Radicals for Life: The Various forms of Nitric Oxide. Elsevier, Amsterdam, 2007.
11.Vanin A.F. Dinitrosyl-iron complexes with thiolate ligands: physico-chemistry, biochemistry and physiology // Nitric Oxide Biol. Chem. - 2009. - Vol. 21. - P. 136149.
